多功能主动靶向透明质酸-聚乳酸载体合成及其抗肿瘤药物胶束制备方法
【专利摘要】本发明属于高分子化学和药物制剂领域。具体涉及主动靶向透明质酸-聚乳酸载体的合成及其抗肿瘤药物胶束的制备方法和应用；采用新型自组装技术通过静电作用，将两亲性的PEG嵌段聚酯共聚物与肿瘤靶向性配体透明质酸-聚乳酸共聚物自组装形成多功能复合胶束，该载抗癌药胶束与复合胶束组合物，能显著提高难溶性肿瘤药溶解性或水溶性抗癌药的载药量与包封率，体内能生物降解，能够避免网状内皮系统(RES)的吞噬和肾脏的排泄，具有长循环作用，多功能组合物突出优势有肿瘤主动靶向作用，体内外药效学参数明显优于抗肿瘤药普通注射剂。临床上可接受的给药途径有注射给药或粘膜给药；剂型为注射剂、输液剂、注射冻干粉针剂或粉雾剂。
【专利说明】多功能主动靶向透明质酸-聚乳酸载体合成及其抗肿瘤药 物胶束制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于高分子化学和药物制剂领域。具体涉及主动靶向透明质酸-聚乳酸载 体的合成及其抗肿瘤药物胶束的制备方法和应用；本发明还涉及具有主动靶向生物降解载 体与两亲性嵌段共聚物载体自组装新技术。
【背景技术】
[0002] 癌症严重是危害人们健康和生命的常见病，全球每年新发病1200万，死亡率高， 我国每年发病人数超过220万，恶性肿瘤的发病死亡率在我国逐年上升已是不争的事实， 并已成为造成我国居民疾病死亡的首要病因。据国家卫生部信息中心的报道，近年来危 害我国民众的主要癌症类型依次为胃癌（21.76% )、肝癌（17.83% )、肺癌（15. 19% )、 食管癌（15.02% )、结直肠癌（4.54% )、白血病（3.53% )、子宫颈癌（1.64% )、鼻咽癌 (1.53% )和乳腺癌（1.49% )。
[0003] 目前癌症的临床治疗仍以化疗为主，上市的紫杉醇和多西紫杉醇普通注射剂的毒 副作用大，缺点是化疗药物对癌细胞没有选择性，会导致相当数量正常细胞的死亡，热点是 针对特定的癌症类型、特定病人研究开发更有针对性、副作用更少"靶向治疗"。抗肿瘤药物 新型制剂得以研究和开发。其中紫杉醇脂质体（力朴素）、白蛋白纳米粒（Abmxane? )已 上市并应用与临床。
[0004] EP0583955B1专利公开一种单甲基聚乙二醇-聚乳酸载多西紫杉醇胶束的制备 方法，将单甲基聚乙二醇聚乳酸和多西紫杉醇，在60°C水浴溶解于乙腈，将乙腈液缓慢滴 加到纯化水中，搅拌lh，60°C常压蒸发5h，胶束粒径为50nm，载药量为6%。Kim等采用 ΡΕΟ-b-PDLLA制备Genexol? -PM胶束，已进入临床研究阶段，然而该胶束存在药物消除速 率过快的问题，剂量提高2. 5倍，该胶束血浆的AUC为Taxol的74. 1 %，血浆清除速率CL为 Taxol StJ 3fp [Kim S C,Kim D ff, Shim Y H, et al. In vivo evaluation of polymeric micellar paclitaxel formulation ：toxicity and efficacy. Journal of Controlled Release, 2007, 72(1) :191-202]。Glen S. Kwon等授权一种肿瘤多药耐药逆转剂热休克蛋白（Hsp-90)，采用 Hsp-90修饰PEG-b-PLA包载紫杉醇或雷帕霉素，薄膜旋转蒸发法制备胶束，过滤除菌冷冻 干燥即得载药胶束冻干粉，该胶束存在主要问题，A549荷瘤小鼠药效学评价中，胶束组del 药效远低于市售制剂组[US8529917]。
[0005] 针对被动靶向载体嵌段共聚物胶束存在体内靶向性低问题，提出了靶向治疗，是 指在细胞分子水平上，针对已经明确的致癌位点，来设计相应的治疗药物，药物进入体内 会特异地选择致癌位点来相结合发生作用，使肿瘤细胞特异性死亡，而不会波及肿瘤周围 的正常组织细胞。通过靶向治疗可以改善药物在肿瘤部位的分布，上皮细胞癌、卵巢癌、直 肠癌、胃癌等多种肿瘤细胞表面阳性表达透明质酸受体⑶44, RHAMM、HARE和LYVE-1等，表 达量高，而正常细胞CD44、RHAMM受体阴性。将透明质酸与胶束传递系统结合，可
[0006] 透明质酸（HA)在人体内存在多种特异性受体，如⑶44, RHAMM、HARE和LYVE-1等， 而CD44、RHAMM在多种肿瘤（如上皮、卵巢、直肠、胃部肿瘤）均有过度表达。HA具有高度特 异性和生物相容性，HA修饰载体是设计和制备聚合物胶束亲水链段介导肿瘤主动靶向成的 关键。将药物主动靶向肿瘤细胞，从而提高药物在肿瘤组织分布，达到肿瘤靶向治疗目的。
[0007] Choi K Y等合成PEG修饰的透明质酸-5 β-胆烷酸聚合物，将聚合物溶于水相， 喜树碱DMS0溶液缓慢滴入聚合物水相，用透析法制备胶束。与成纤维细胞ΝΙΗ-3Υ3相比， 在CD44过表达SCC7癌细胞，细胞摄取量显著增加。但该方法缺点是胶束的平均粒径较大 为319. 6nm，另透明质酸包覆于PEG内部无法暴露，影响与靶细胞表面受体的作用，使药物 难以从网状内皮系统（RES)逃逸，被单核巨噬细胞系统（MPS)清除，降低了胶束中药物在肿 瘤部位蓄积[Choi K Y，Yoon Η Y，Kim J-H，et al.，Smart nanocarrier based on PEGylated hyaluronic acid for cancer therapy. ACS nano,2011,5 (11) :8591-9]〇 Pitarresi G 合 成透明质酸接枝聚乳酸与聚乙二醇（HA-g-PLA-g-PEG)共聚，制备阿霉素胶束，该胶束通过 CD44受体介导内吞作用增加 HCT116细胞的摄取，但PLA接枝率较低为5. 0%，导致该胶束 载药量低为4. 8%，包封率为9. 6%，抗肿瘤药效降低[Pitarresi G，Palumbo F S，Albanese A, et al. , Self-assembled amphiphilic hyaluronic acid graft copolymers for targeted release of antitumoral dmg. J Drug Target, 2010,18 (4) :264-76] 〇
[0008] Yadav A K等制备阿霉素（D0X) HA-PEG-PLGA胶束，将PLGA-PEG-NH2溶于纯化水中 加入HA和EDCA，磁力搅拌7h，冷冻干燥得HA-PEG-PLGA。用沉淀分散法水相方法制备聚 合物胶束，包封率为87. 66%。药动学结果表明，D0X胶束血浆药物浓度远低于游离D0X， 可能由于血浆中抗透明质酸酶和玻尿酸降解酶的作用分解胶束，降低药物在血液循环滞 留时间[Yadav A K, Mishra P, Mishra A K, et al· , Development and characterization of hyaluronic acid-anchored PLGA nanoparticulate carriers of doxorubicin. Nanomedicine ：nanotechnology, biology, and medicine,2007,3(4) :246-57]〇 中国专 利201010228961授权一种透明质酸-C18胶束的制备方法，将HA-C18和紫杉醇溶于DMS0 中，磁力搅拌混合均匀，用透析法透析除有机溶剂和游离紫杉醇，粒径为236. 6nm，载药量为 9. 57%，与聚酯相比十八烷甲酸的生物相容性不好，今后临床应用有困难。
[0009] 基于HA与聚酯两亲性生物降解载体修饰药物传递系统，对于一些肿瘤治疗具有 重大潜在应用价值，新型给药系统对抗癌药临床应用提供理论依据。本发明以透明质酸为 主动靶头通过与聚酯合成系列两嵌段共聚物，以透明质酸为基础构建的主动靶向药物传递 系统，具有免疫原性低、生物相容性良好和可降解等优点，还具有低临界胶束浓度和药物缓 释等特性；HA与CD44高表达的肿瘤细胞特异性结合，引导纳米胶束在肿瘤细胞中主动蓄 集，达到主动靶向肿瘤细胞目的。
【发明内容】
[0010] 本发明涉及主动靶向透明质酸-聚乳酸载体的合成及其抗肿瘤药物胶束的制备 方法和应用；本发明还涉及具有主动靶向生物降解载体与两亲性嵌段共聚物载体自组装新 技术。本发明的目的是将透明质酸-聚酯（聚乳酸、聚己内酯等）通过还原胺化反应合成， 采用该两亲性载体包覆抗癌药物制备聚合物胶束；更重要的目的是采用自组装技术通过静 电作用，将两亲性的PEG嵌段聚酯共聚物与肿瘤靶向性配体透明质酸-聚乳酸共聚物自组 装形成多功能复合胶束。 toon] 本发明利用透明质酸分子中含有多种基团通过共价键与聚酯中活性基团结合，通 过酰氨化反应合成HA-聚酯，通过与PEG化-聚酯载体自组装新技术新策略，使PEG在循环 过程中屏蔽HA表面，通过摄取前暴露HA靶点，更有利于延长药物在循环系统中的循环时 间，其双亲水外壳和聚酯环绕的疏水内核，可逃避单核巨噬细胞的吞噬，减少药物全身性扩 散的毒副作用提高抗癌药物靶向治疗作用。
[0012] 本发明提供一种或系列具有肿瘤靶向性载体和多功能作用的自组装复合胶束组 合物，其特征在于：透明质酸末端的羟基与聚乳酸中羧基通过共价键结合，为具有两亲性的 嵌段共聚物，其结构通式（I):
[0013]
【权利要求】
1. 主动靶向透明质酸-聚乳酸载体及其抗肿瘤药物胶束组合物，其特征在于：透明质 酸末端的羟基与聚乳酸中羧基通过共价键结合，为具有两亲性的嵌段共聚物载体；其结构 通式（I):
其中透明质酸分子量为4500?45000Da，聚乳酸分子量为1200?13000Da，m范围为 20?92, η范围为30?103 ; 所述（I)的透明质酸-聚乳酸包载抗癌药物能自发形成胶束，通过自组装新技术与ΑΒ、 ABA、ABC两亲性-聚酯嵌段共聚物包覆抗癌药物自组装成多功能复合胶束，其自组装胶束 由双亲水性外壳和聚酯环绕的疏水内核组成； 所述透明质酸与聚乳酸的重量比为1 : 〇. 2?0. 8 ;透明质酸-聚乳酸与两亲性聚酯 共聚物的自组装胶束组合物的重量比为：1 : 〇. 2?4. 0。
2. 根据权利要求1所述的透明质酸-聚乳酸（I)，其特征在于，可以包载疏水性或亲水 性抗肿瘤药物，其中药物与（I)的重量比为1 : 1.0?200。
3. 根据权利要求1所述主动靶向透明质酸-聚乳酸载体及其抗肿瘤药物胶束组合物， 其特征在于所述难溶性抗肿瘤药物选自紫杉醇、多烯紫杉醇、阿霉素、冬凌草素、姜黄素、姜 黄素3、人参皂苷Rh2、柔红霉素、表柔比星、10羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、S-38、甲氨蝶呤、 依托泊苷、米托蒽醌或其衍生物；水溶性抗肿瘤药物选自有盐酸阿霉素、盐酸拓扑霉素、盐 酸柔红霉素等。
4. 根据权利要求1-3所述的透明质酸-聚乳酸共聚物⑴载体，制备方法包括如下步 骤： (1) 聚乳酸的合成 将D，L-丙交酯适量加入圆底烧瓶中，油浴温度为100-135°C，待丙交酯熔融，加入催化 齐[J Sn (Oct)2，通氮气排净容器中空气，逐步升温至140-175°C温度，聚合反应6-8h，加有机溶 剂a纯化，真空干燥，即得聚乳酸固体； 聚乳酸的活化：将聚乳酸溶于有机溶剂a，加 N，N-二环己基碳二亚胺和N-羟基-琥珀 酰亚胺，氮气保护，室温反应24h，用有机溶剂b沉淀，抽滤，真空干燥，即得聚乳酸-NHS ; (2) 透明质酸-聚乳酸的合成 透明质酸的末端胺化合成：将N，N-二乙基乙二胺用pH7-9. 5磷酸盐缓冲溶解，称取透 明质酸加纯化水溶解滴入上述溶液中，磁力搅拌2-6h。加还原试剂，控制温度8?20°C反 应l-3h，室温反应8-16h ;将反应物放入透析袋中，用PBS缓冲溶液透析两天，冷冻干燥冻 干，即得透明质酸-nh2; 称取透明质酸-NH2适量，加 pH7-9. 5PBS缓冲溶液，超声溶解，加聚乳酸-NHS有机溶 剂a，室温磁力搅拌反应15_30h，采用有机溶剂a，除去杂质沉淀；纯化水透析袋法透析 24-72h，除去未反应的透明质酸-NH 2，冷冻干燥，即得透明质酸-聚乳酸固体； 其中所述有机溶剂a为甲醇、乙醇、乙醚、乙腈、氯仿、二氯甲烷、二甲基亚砜一种或混 合物；所述溶剂b为石油醚、冰乙醚、乙酸乙酯的一种或混合物； 所述还原试剂选自氰基硼氢化钠、硼氢化钠等。
5. 根据权利要求1所述主动靶向透明质酸-聚乳酸载体及自组装多功能胶束组合物， 其特征在于，所述两亲性-聚酯为AB、ΑΒΑ或ABC型两嵌段共聚物、三嵌段共聚物或接枝共 聚物，其中两嵌段共聚物选自mPEG-PLA、mPEG-PCL、mPEG-PLGA、mPEG-PAA，三嵌段共聚物选 自 mPEG-PLLA-PMMD、PLA-PEG-PLA、PCL-PEG-PCL、PLGA-PEG-PLGA 或 PEG-PAA-PEG ;PMMD 为 聚丙氨酸、聚赖氨酸、聚甘氨酸、聚谷氨酸，m为800?20000。
6. 根据权利要求1-5所述主动靶向透明质酸-聚乳酸载体及其抗肿瘤药物胶束组合 物，其特征在于，采用乳化溶剂扩散-薄膜分散法-或与透析法结合，所述聚合物胶束和复 合胶束组合物的制备方法如下： (1) 称取透明质酸-聚乳酸溶于纯化水，抗肿瘤药物加有机溶剂a超声溶解，将含药相 滴入载体水相，置恒温磁力搅拌仪，扩散2-6h得胶束初混悬液；再将上述胶束初混悬液移 至透析袋中，在纯化水或磷酸盐缓冲液中透析12-48h，探头超声5-40min，0. 22 μ m微孔滤 膜过滤，即得胶束混悬液；另取胶束混悬液，加冻干保护剂，分装西林瓶冷冻干燥，即得聚合 物胶束固体粉；或 (2) 两亲性聚酯溶解于有机溶剂，抗肿瘤药物溶于有机溶剂；将含药相缓慢滴入载体 有机相，置恒温磁力搅拌仪，扩散2-6h即得胶束初混悬液；再将上述胶束初混悬液置入 旋转蒸发仪发挥除去有机溶剂，加纯化水分散，即得胶束混悬液1 ;另取两亲性聚酯载体 加有机溶剂超声溶解，滴入磁力搅拌的胶束混悬液1中，固体分散组装2?3h，探头超声 5-30min，0. 22 μ m微孔滤膜过滤，即得自组装复合胶束混悬液；另取自组装复合胶束混悬 液，加冻干保护剂，分装西林瓶冷冻干燥，即得自组装复合胶束固体粉。
7. 根据权利要求1-6所述主动靶向透明质酸-聚乳酸载体及其抗肿瘤药物胶束组合 物，其特征是，其中所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、乙醚、二氯甲烷、三氯甲烷等的 一种或两种混合溶剂； 所述聚合物胶束或复合胶束冻干保护剂选自甘露醇、葡萄糖、乳糖、蔗糖或海藻糖中的 一种或几种，冻干保护剂用量按载药聚合物胶束混悬液重量计，1份载药聚合物胶束混悬液 加入冻干保护剂〇. 01?〇. 2份。
8. 根据权利要求1-7所述主动靶向透明质酸-聚乳酸载体及其抗肿瘤药物胶束组合 物，其特征在于该载药胶束和复合胶束可用于治疗非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫颈 癌、胃癌、肝癌、白血病、肾癌等恶性肿瘤的单一或联合用药。
【文档编号】A61K47/36GK104056275SQ201410244165
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年5月30日 优先权日:2014年5月30日
【发明者】李娟 , 王广基, 陈芳, 张经纬, 周芳 申请人:中国药科大学