宝霍苷i在制备防治阿尔茨海默病药物中的用途
【专利摘要】本发明公开了宝霍苷I在制备防治阿尔茨海默病药物中的用途，本发明采用宝藿苷I作为制备治疗阿尔茨海默病的药物，经过系列动物实验验证得知，制备得到的药物组合物能防治阿尔茨海默病的学习记忆减退，减少阿尔茨海默病的特征性病理改变老年斑的形成，减轻在阿尔茨海默病发病中的神经炎症反应。本发明材料来源广泛，易于获取，用于制备药物简单易行、治疗效果好。
【专利说明】宝霍苷I在制备防治阿尔茨海默病药物中的用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及药学领域，尤其是一种宝霍苷I在制备防治阿尔茨海默病药物中的用途。
【背景技术】
[0002]阿尔茨海默病(Alzheimer’ s disease, AD)是一种常见的老年人中枢神经系统退行性疾病。该病隐匿起病，主要表现为进行性记忆力下降和认知功能障碍。流行病学调查显示，阿尔茨海默病患病率约占60岁以上老年人的10%左右，且发病率呈逐年上升趋势，是老年人发生痴呆的主要类型，占整个痴呆发生率的60%_70%。阿尔茨海默病的发病机制至今仍未阐明，可能涉及到基因突变、线粒体功能紊乱、神经炎症、胆碱能缺陷及环境毒素等，其中，目前认为β淀粉样肽(β-amyloid，A β )的神经毒性作用及神经炎症是阿尔茨海默病形成和发展的关键因素。在治疗学上，临床上仍无针对性的治疗方法，目前主要采用胆碱酯酶的抑制剂如多奈哌齐等用于治疗阿尔茨海默病。这些药物在改善病人的临床症状方面有一定的作用，但也因为存在不良反应多或疗效不满意等情况而在一定程度上限制了它们的广泛使用，因此寻求新的治疗方法极为重要。
[0003]在临床上，传统中医药对阿尔茨海默病有较好的治疗效果，为本病的治疗研究提供了思路。中医目前将阿尔茨海默病归于“健忘” “呆症”等范畴，认为其发病以内因为主，病位在脑，脑髓空虚，气血不足致神明失养，因肾藏精，生髓通脑，故治疗多以补肾填精类中药为主。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是:提供一种宝霍苷I在制备防治阿尔茨海默病药物中的用途，将宝霍苷I用于制备治疗阿尔茨海默病药物中，具有良好的防治效果，以克服现有技术的不足。
[0005]本发明是这样实现的:宝霍苷I在制备防治阿尔茨海默病药物中的用途，将宝霍苷I作为有效成分用于制备预防或治疗，以及预防及治疗阿尔茨海默病的药物中。
[0006]将宝霍苷I与药学上可接受的辅料制备成药学上可接受的剂型。
[0007]所述的药学上可接受的剂型为片剂，胶囊剂，注射液，颗粒剂或糖浆剂。
[0008]为了验证本发明的实验效果，进行了以下体内实验:
本发明采用β淀粉样肽25-35片段(β-amyloid 25-35 fragment,Αβ 25_35)诱导的大鼠阿尔茨海默病模型，观察了每日I次灌胃宝霍苷I 60mg/kg对该模型大鼠学习记忆减退的影响，同时与每日I次灌胃等剂量的淫羊藿中的另一单体化合物淫羊藿苷进行比较。结果发现，宝霍苷I及淫羊藿苷均能减轻海马内注射Αβ25_35诱导的大鼠学习记忆减退，且宝霍苷I的作用优于淫羊藿苷。
[0009]采用APP/PS1转基因AD小鼠模型，观察了每日I次灌胃宝霍苷I 60mg/kg对该模型大鼠学习记忆减退的影响，同时通过该模型观察了每日I次灌胃宝霍苷I 60mg/kg对阿尔茨海默病的特征性病理改变老年斑形成的影响。结果发现，每日I次灌胃宝霍苷I 60mg/kg可阻遏APP/PS1转基因AD小鼠的学习记忆减退，并减少其特征性病理改变老年斑形成。
[0010]采用左侧脑室注射脂多糖(I μ g/μ I) 5μ I制备大鼠急性神经炎症模型，观察了每日一次灌胃给予宝藿苷I 30mg/kg/d对该模型大鼠神经元损伤及神经炎症的影响。结果发现，预防性给予宝藿苷I能拮抗脂多糖诱导的神经元损伤及急性神经炎症，其机制至少与抑制海马中COX-2、IL-1 β、iNOS等炎症因子的表达有关。
[0011]实验结果证明，所述的宝藿苷I具有抗阿尔茨海默病作用，可应用于制备药物组合物防治阿尔茨海默病。
[0012]实验1:宝霍苷I及淫羊藿苷均能减轻海马内注射Αβ25_35$导的大鼠学习记忆减退及二者比较实验
体重250± 1g的雄性SD大鼠40只，随机分为4组，假手术组、模型组、淫羊藿苷(ICA)组及宝霍苷I (IRS)组(η=10)，模型组、ICA组及IRS组每侧海马内注射聚集态的Aβ25_351yg造模，假手术组注射等体积溶媒。造模后当日大鼠清醒后开始灌胃，ICA组每日I次灌胃ICA 60mg/kg, IRS组每日I次灌胃IRS 60mg/kg,连续15天。给药后第11天开始连续5天行水迷宫检测，前4天为定向航行实验，第5天为空间探索实验。结果发现，在第2、3、4天，IRS明显阻遏了 A β 25_35诱导的逃避潜伏期延长，在第3、4天，ICA明显阻遏了 A β 25_35诱导的逃避潜伏期延长，但在第4天，IRS阻遏Αβ25_35诱导的逃避潜伏期延长作用优于ICA。在第5天的空间探索实验，ICA及IRS明显阻遏了 Αβ25_35$导的大鼠矫正逃避潜伏期的减少，且IRS的作用优于ICA。该研究结果表明，宝霍苷I及淫羊藿苷均能减轻海马内注射Αβ25_35诱导的大鼠学习记忆减退，且宝霍苷I的作用优于淫羊藿苷。
[0013]实验2:宝霍苷I阻遏APP/PS1转基因AD小鼠的学习记忆减退，减少其特征性病理改变老年斑形成实验
APP/PSI双重转基因AD小鼠和同月龄同背景野生型小鼠，SPF级，雄性，体重(30 ± 5 )g。品系名称:B6C3-TG ( APPSffE, PSEN1DE9 ) 85DB0/J，简称:APPSWe，相关基因:APP,PSl0SPF级动物房单笼饲养，自由饮食，环境温度22?24°C，湿度50-60%，每12小时明暗交替，光照时间为6:00-18:00。雄性APP/PS1双重转基因AD小鼠30只，随机分为模型对照组、IRS组，同性别同月龄的野生型小鼠30只，随机分为对照组(15只)及正常给药组(15只)。自10月龄开始给药，IRS低、高剂量组分别灌胃IRS 60 mg.kg—1 (以双蒸水为溶媒)，正常给药组灌胃IRS 60 mg.kg_\模型组、空白组灌胃等体积的双蒸水(0.1 mL.10 g—1)，每日给药I次，连续灌胃4个月。4个月后，Morris水迷宫检测小鼠的学习记忆能力，后处死小鼠，硫磺素S染色观察APP/PS1双重转基因AD小鼠的老年斑形成情况。结果显示，IRS对正常小鼠的学习记忆未见明显影响，但是可阻遏APP/PS1双重转基因AD小鼠的学习记忆减退，并减少其老年斑形成。
[0014]实验3:宝藿苷I抗脂多糖诱导的大鼠神经炎症实验
雄性SD大鼠60只，体重250-350 g。动物适应性喂养3天后，随机法分为3组，分别为假手术对照组(sham，n=20)、模型组(LPS，n=20)、治疗组(LPS+BHG，n=20)。分组后次日开始给药，治疗组灌胃BHG 30mg/kg/d，假手术组和模型组灌胃等体积的生理盐水(normalsaline, NS)。预防性给药5天，给药过程中监测体重。预给药5日后进行手术造模。7%水合氯醛麻醉(5ml/kg)麻醉后固定在大鼠脑立体定位仪上，剪毛、消毒，沿头部正中线切口(1.0cm),暴露前囟及正中线后定标。侧脑室进针坐标为[11]:AP-0.8mm(前囟后)、ML-1.5mm(中线左侧)、H-3.8mm (自脑膜起深度)。定位后用牙科钻钻开颅骨，微量注射器垂直进针3.8mm,模型组、治疗组注射5 μ I浓度为I μ g/ μ I的LPS溶液，缓慢注入(I μ I/min)，留针5min。假手术组同法注射等体积NS。术后给予腹腔注射4万单位/0.25ml青霉素，伤口外用红霉素软膏涂抹预防感染。造模后24小时，每组随机抽取5只大鼠，处死，HE染色观察大鼠海马组织CAl区细胞形态学变化。每组随机抽取4只大鼠，与上同法进行透心灌注，断头取脑，在冰袋上快速分离出海马，用刀片将其切成匀称的小块，将处理好的组织转移至预冷的电镜固定液中，透射电镜观察大鼠海马CAl区神经元细胞超微结构的变化。剩余大鼠处死后，Real time RT-PCR检测大鼠海马炎症因子的表达。HE染色结果表明，侧脑室注射脂多糖引起模型组海马损伤，神经元紊乱，CAl区嗜酸性神经元变性，核固缩；治疗组嗜酸性神经元变性和核固缩明显减轻。透射电镜观察发现模型组海马CAl区神经元超微结构损伤，核周间隙明显增宽，线粒体肿胀，异染色质聚集；预防性给予宝藿苷I明显减轻海马神经元的超微结构损伤，染色质分布均匀、线粒体及内质网结构清晰；RT_PCR实验表明，模型组海马组织中COX-2、IL-l β、iNOS的mRNA表达水平增加；宝藿苷I明显减轻LPS引起的炎症因子COX-2、IL-1 β、iNOS的过度表达。这表明预防性给予宝藿苷I能拮抗LPS诱导急性神经炎症，抑制海马中COX-2、IL-1 β、iNOS等炎症因子的表达。
[0015]本发明采用宝藿苷I作为制备治疗阿尔茨海默病的药物，经过系列动物实验验证得知，制备得到的药物组合物能防治阿尔茨海默病的学习记忆减退，减少阿尔茨海默病的特征性病理改变老年斑的形成，减轻在阿尔茨海默病发病中的神经炎症反应。本发明材料来源广泛，易于获取，用于制备药物简单易行、治疗效果好。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为宝霍苷I及淫羊藿苷均能缩短海马内注射Αβ 25_35诱导的大鼠逃避潜伏期及二者比较实验；
其中，sham代表假手术组，Αβ代表模型组，Aβ+ICA代表淫羊藿苷治疗组，Αβ+IRS代表宝霍苷I治疗组，逃避潜伏期代表大鼠在定向航行实验中的逃避潜伏期，day K day 2,day3, day4分别代表第I天、第2天、第3天、第4天，*为与假手术组比较/^ ( 0.05，#为与模型组比较^ 0.05, &为与淫羊藿苷治疗组比较/7 ^ 0.05 ；
图2为宝霍苷I及淫羊藿苷均能延长海马内注射A β25_35诱导的大鼠平均校正逃避潜伏期及二者比较实验；
其中，sham代表假手术组，A β代表模型组，A β +ICA代表淫羊藿苷治疗组，A β +IRS代表宝霍苷I治疗组，*为与假手术组比较/0.05，#为与模型组比较P < 0.05，&为与淫羊藿苷治疗组比较/7 ^ 0.05 ；
图3为宝霍苷I阻遏APP/PS1转基因AD小鼠的逃避潜伏期延长，
其中，WT代表野生型小鼠，即正常小鼠组，WT+IRS代表正常给宝霍苷I组，APP/PS1代表转基因AD小鼠组，APP/PS1+IRS代表宝霍苷I治疗组，逃避潜伏期代表大鼠在定向航行实验中的逃避潜伏期，dayl、day2、day3、day4分别代表第I天、第2天、第3天、第4天，**为与正常小鼠比较/7彡0.01，##为与转基因AD小鼠组比较产彡0.01 ；
图4为宝霍苷I延长APP/PS1转基因AD小鼠的逃避潜伏期； 其中，WT代表野生型小鼠，即正常小鼠组，WT+IRS代表正常给宝霍苷I组，APP/PS1代表转基因AD小鼠组，APP/PS1+IRS代表宝霍苷I治疗组，林为与正常小鼠比较/7 ( 0.01，##为与转基因AD小鼠组比较/7彡0.01 ；
图5为宝霍苷I减少APP/PS1转基因AD小鼠的脑老年斑形成的代表性图片；
图6为宝霍苷I减少APP/PS1转基因AD小鼠的脑老年斑形成的量化图；
其中，WT代表野生型小鼠，即正常小鼠组，WT+IRS代表正常给宝霍苷I组，APP/PS1代表转基因AD小鼠组，APP/PS1+IRS代表宝霍苷I治疗组，林为与正常小鼠比较/7 ( 0.01，##为与转基因AD小鼠组比较/7彡0.01 ；
图7为宝霍苷I减轻脂多糖所致大鼠海马组织CAl区形态损伤，
其中，A代表放大倍数为50倍，B代表放大倍数为200倍；
图8为宝霍苷I减轻脂多糖所致大鼠海马组织CAl区神经元超微结损伤；
其中，A代表放大倍数为10000倍，B代表放大倍数为25000倍；
图9为宝霍苷I抑制脂多糖诱导的大鼠海马组织中COX-2、IL-1 β、iNOS的mRNA表达；
其中，C0X-2代表环氧合酶_2，IL-1b代表白细胞介素-1 β，iNOS代表诱导型一氧化氮合酶，sham代表假手术组，LPS代表脂多糖侧脑室注射诱导的模型组，LPS+IRS代表制模后宝霍苷I治疗组，**为与sham比较/7彡0.01, ##为与LPS组比较Z7彡0.01。
【具体实施方式】
[0017]本发明的实施例1:取宝霍苷I5g、药用淀粉75 g、微晶纤维素20 g，将药用淀粉先干燥，过120目筛后再与宝霍苷I及微晶纤维素混合，过两次120目筛，填入硬胶囊中，制成1000粒本发明胶囊。每粒硬胶囊含主药成分0.5 mg O
[0018]本发明的实施例2:取宝霍苷I 5g、羟丙甲纤维素6g、羧甲淀粉钠10g，微晶纤维素Sg，乳糖115g、淀粉50g，硬脂酸镁Ig ;将主药与辅料充分混匀后投入高速搅拌机中，喷雾加水适量，整粒，水分控制在3?4%，然后压片，制成1000片，包薄膜衣。
[0019]本发明的实施例3:取宝霍苷I 5g，加入400 ml聚乙二醇200溶解，再加入适量蒸馏水进行稀释，然后再加入适量蔗糖并调整体积至1000 ml,搅匀，过滤，灌装成10 ml或20 ml每只，灭菌包装。
【权利要求】
1.宝霍苷I在制备防治阿尔茨海默病药物中的用途，其特征在于:将宝霍苷I作为有效成分用于制备预防或治疗，以及预防及治疗阿尔茨海默病的药物中。
2.根据权利要求1的宝霍苷I在制备防治阿尔茨海默病药物中的用途，其特征在于:将宝霍苷I与药学上可接受的辅料制备成药学上可接受的剂型。
3.根据权利要求2的宝霍苷I在制备防治阿尔茨海默病药物中的用途，其特征在于:所述的药学上可接受的剂型为片剂，胶囊剂，注射液，颗粒剂或糖浆剂。
【文档编号】A61P25/28GK104173361SQ201410254624
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年6月10日 优先权日:2014年6月10日
【发明者】龚其海, 邓媛媛, 石京山, 李菲 申请人:遵义医学院