氧化苦参碱聚乳酸微球的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种氧化苦参碱聚乳酸微球的制备方法，包括以下步骤：1）取明胶在水中溶解得明胶溶液；2）将氧化苦参碱、聚乳酸用二氯甲烷溶解；3）在搅拌条件下将步骤2）所得溶液缓慢加入明胶溶液中，继续搅拌得微球溶液；4）离心，所得沉淀用水清洗得固体沉淀；5）将步骤4）所得固体沉淀冷冻干燥即得氧化苦参碱微球。采用本发明的方法制备得到的氧化苦参碱聚乳酸微球的平均粒径为8～11μm，被肺部的毛细血管截留浓集于肺，装载其中的氧化苦参碱随聚乳酸的分解逐渐释放到肺部的毛细血管，使得肺部的氧化苦参碱始终保持较高浓度，避免因氧化苦参碱半衰期短导致的有效浓度维持时间短，达到对肺部疾病持续、靶向治疗作用。
【专利说明】氧化苦参碱聚乳酸微球的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及靶向治疗药物领域，尤其涉及一种氧化苦参碱聚乳酸微球的制备方法。
【背景技术】
[0002]氧化苦参碱(Oxymatrine)是苦参等豆科槐属植物中生物碱的主要成分。大量的药理和临床研究发现，氧化苦参碱具有抗病毒、抗肝纤维化、强心、降压、镇静、镇痛等多种药理作用，对肺癌、胃癌细胞诱导的血管内皮细胞增殖具有抑制作用，近年的研究揭示，氧化苦参碱对于哮喘、肺损伤、肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病的发展均具有良好的治疗效果，具有减轻肺部炎症、抑制成纤维细胞增殖、降低自由基产生等多种功效，显示了该种药物在治疗多种肺部疾病方面的应用前景。
[0003]但根据现有资料发现，氧化苦参碱有如下药动学不足:
[0004]1.半衰期短:氧化苦参碱注射给药后，大鼠的消除半衰期约5min，健康人的消除半衰期仅为130.4min，导致氧化苦参碱有效浓度维持时间短，难以长时间作用肺部。
[0005]2.不具有靶向性:给药后，氧化苦参碱在体内随血液全身分布，原型药物及其代谢物主要分布在肾脏，极少量进入肺脏，有效作用于肺脏的剂量过小。而哮喘、肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病等均为慢性疾病，长期使用，可能增加药物对其它器官毒性反应发生率，降低患者依从性。
[0006]微球(Microsphere)是指药物分子分散或被吸附在高分子聚合物载体中而形成的微粒分散系统，其微粒直径在I?300 μ m，可用于动脉栓塞、口服和注射给药。药物制成微球后，主要特点是:
[0007]1.靶向性:微球在体内的分布情况主要取决于微球的粒径大小，微球粒径在
2.5?10 μ m的毫微粒会浓集于单核巨噬系统；大于7 μ m的微球将会被肺部的毛细血管截留浓集于肺；粒径40 μ m以上的浓集于动脉栓塞。
[0008]2.缓释性:微球中的药物释放需依赖载体材料的降解，释放有一个润湿、溶解、扩散的过程，使药物释放缓慢，达到药物长久发挥功效的目的。
[0009]国外已有多种微球制剂上市，如曲普瑞林微球注射剂(triptorelin, Decapeptyl)、戈舍瑞林微球注射剂(goserelin, Zoladex),亮丙瑞林微球注射剂(leuprorelin, Enantone)等。也有多种肺祀向抗结核或抗肿瘤药物微球研制成功,如利福平明胶微球、卡钼明胶微球、依托泊苷白蛋白微球等，显示了微球制剂在肺部肿瘤、肺结核以及肺部感染治疗中良好的应用前景。但是，由于氧化苦参碱水溶性高，难以溶于有机溶剂，导致微球中氧化苦参碱中含量极低。
【发明内容】
[0010]针对现有技术的不足，本发明提供一种氧化苦参碱聚乳酸微球及其制备方法，通过特定辅料的选择，最佳配比、浓度的筛选，制备得到的氧化苦参碱聚乳酸微球粒径、含药量较为理想，靶向浓集于肺部，且具有良好的生物相容性和生物可降解性，氧化苦参碱释放缓慢，能长久发挥治疗肺部疾病的功效。
[0011]本发明的技术方案是:一种氧化苦参碱聚乳酸微球的制备方法，包括以下步骤:
[0012]I)取明胶在水中溶解得明胶溶液；
[0013]2)将氧化苦参碱、聚乳酸用二氯甲烷溶解；
[0014]3)在搅拌条件下将步骤2)所得溶液缓慢加入明胶溶液中，继续搅拌得微球溶液；
[0015]4)离心，所得沉淀用水清洗得固体沉淀；
[0016]5)将步骤4)所得固体沉淀冷冻干燥即得氧化苦参碱微球；
[0017]所述氧化苦参碱、聚乳酸和明胶的质量比为1:0.8-1.2:0.8-1.2，所述明胶溶液的浓度为0.5g/100ml。
[0018]步骤2)氧化苦参碱的浓度为4g/100ml。
[0019]作为优选技术方案，步骤2)为超声溶解。
[0020]作为优选技术方案，步骤3)中氧化苦参碱溶解液和明胶溶解液的体积比为1:8。
[0021]作为优选技术方案，步骤3)的具体操作为:在1650-1750rpm/min搅拌下，将步骤
2)所得溶液缓慢加入明胶溶液中，搅拌1min,于900rpm/min下搅拌2_3小时,得微球溶液。
[0022]作为进一步优选，氧化苦参碱、聚乳酸和明胶的质量比为1:1:1。
[0023]采用上述技术方案，以生物可降解高分子材料聚乳酸为载体，聚乳酸在体内分解的终产物为水和二氧化碳，故制得的氧化苦参碱聚乳酸微球具有良好的生物相容性和生物可降解性；氧化苦参碱聚乳酸微球的平均粒径为8?11 μ m，被肺部的毛细血管截留浓集于肺，装载其中的氧化苦参碱随聚乳酸的分解逐渐释放到肺部的毛细血管，使得肺部的氧化苦参碱始终保持较高浓度，避免因氧化苦参碱半衰期短导致的有效浓度维持时间短，达到对肺部疾病持续、靶向治疗作用。因此，本发明还提供一种氧化苦参碱聚乳酸微球在制备肺部疾病靶向治疗药物中的用途。
[0024]本发明所用试剂中，氧化苦参碱为陕西慧科植物开发有限公司产品，聚乳酸山东济南岱罡生物工程有限公司产品，明胶购于山东淄博欧昌明胶销售有限公司，下面结合【具体实施方式】作进一步的说明。
【具体实施方式】
[0025]实施例1:氧化苦参碱微球制备
[0026]处方:
[0027]氧化苦参碱:1.0g
[0028]聚乳酸:1.0g
[0029]二氯甲烷:25ml
[0030]明胶:0.5% (g/ml), 200ml
[0031]①称取明胶5.0g于100ml纯化水中溶解，得0.5%的明胶溶液，待用；
[0032]②称取氧化苦参碱l.0g，聚乳酸1.0g，于25ml 二氯甲烷中溶解，超声I小时，待用；
[0033]③量取200ml 0.5%的明胶溶液于500ml烧杯中，1700rpm/min下缓慢加入超声过后的氧化苦参碱和聚乳酸溶液，搅拌1min,于900rpm/min下搅拌2_3小时,得微球溶液；
[0034]④用50ml离心管离心微球溶液:于4000rpm/min下离心15min,弃上清液,用纯化水20ml清洗沉淀固体，重复清洗共3次，得固体沉淀；
[0035]⑤将清洗干净的固体沉淀于_80°C冰箱冷冻30min，放入冻干机冷冻干燥48小时，即得氧化苦参碱微球。
[0036]实施例2:氧化苦参碱微球制备
[0037]处方:
[0038]氧化苦参碱:1.0g
[0039]聚乳酸:0.8g
[0040]二氯甲烷:20ml
[0041]明胶:0.5%(g/ml), 200ml
[0042]①称取明胶5.0g于100ml纯化水中溶解，得0.5%的明胶溶液，待用；
[0043]②称取氧化苦参碱1.(^，聚乳酸0.88，于20!111 二氯甲烷中溶解，超声I小时，待用；
[0044]③量取200ml 0.5%的明胶溶液于500ml烧杯中，1700rpm/min下缓慢加入超声过后的氧化苦参碱和聚乳酸溶液，搅拌1min,于900rpm/min下搅拌2_3小时,得微球溶液；
[0045]④用50ml离心管离心微球溶液:于4000rpm/min下离心15min,弃上清液,用纯化水20ml清洗沉淀固体，重复清洗共3次，得固体沉淀；
[0046]⑤将清洗干净的固体沉淀于_80°C冰箱冷冻30min，放入冻干机冷冻干燥48小时，即得氧化苦参碱微球。
[0047]实施例3:氧化苦参碱微球制备
[0048]处方:
[0049]氧化苦参碱:1.0g
[0050]聚乳酸:1.2g
[0051]二氯甲烷:30ml
[0052]明胶:0.5% (g/ml), 200ml
[0053]①称取明胶5.0g于100ml纯化水中溶解，得0.5%的明胶溶液，待用；
[0054]②称取氧化苦参碱l.0g，聚乳酸1.2g，于30ml 二氯甲烷中溶解，超声I小时，待用；
[0055]③量取200ml 0.5%的明胶溶液于500ml烧杯中，1700rpm/min下缓慢加入超声过后的氧化苦参碱和聚乳酸溶液，搅拌1min,于900rpm/min下搅拌2_3小时,得微球溶液；
[0056]④用50ml离心管离心微球溶液:于4000rpm/min下离心15min,弃上清液,用纯化水20ml清洗沉淀固体，重复清洗共3次，得固体沉淀；
[0057]⑤将清洗干净的固体沉淀于_80°C冰箱冷冻30min，放入冻干机冷冻干燥48小时，即得氧化苦参碱微球。
[0058]对比例1:
[0059]处方:
[0060]氧化苦参碱:Ig
[0061]聚乳酸:0.5ml
[0062]二氯甲烷:5ml
[0063]聚乙烯醇:0.5ml, I % (g/ml)
[0064]①称取聚乙烯醇1.0g于10ml纯化水中溶解，得I %的明胶溶液，待用；
[0065]②称取氧化苦参碱1.(^，聚乳酸0.51111，于51111 二氯甲烷中溶解，超声I小时，待用；
[0066]③量取0.5ml I %的聚乙烯醇溶液于10ml烧杯中，1700rpm/min下缓慢加入超声过后的氧化苦参碱和聚乳酸溶液，搅拌1min,于900rpm/min下搅拌2_3小时,得微球溶液；
[0067]④用50ml离心管离心微球溶液:于4000rpm/min下离心15min,弃上清液,用纯化水20ml清洗沉淀固体，重复清洗共3次，得固体沉淀；
[0068]⑤将清洗干净的固体沉淀于_80°C冰箱冷冻30min，放入冻干机冷冻干燥48小时，即得氧化苦参碱微球。
[0069]氧化苦参碱微球载药量的测定
[0070]①色谱条件
[0071]流动相:乙腈:乙醇:3%磷酸液=85:10:5
[0072]流速:1.0ml/min ；
[0073]检测波长:220nm；
[0074]进样体积:20 μ I。
[0075]②检测结果
[0076]用高效液相色谱仪检测样品，计算得到氧化苦参碱聚乳酸微球平均载药量:实施例I为6.08% ;实施例2为5.94% ;实施例3为5.96% ;对比例I为3.29%.
[0077]微球性质分析:氧化苦参碱聚乳酸微球形态和粒径分布观察
[0078]I)氧化苦参碱聚乳酸微球形态观察:
[0079]氧化苦参碱聚乳酸微球的扫描电子显微镜图显示成球性良好，均匀。
[0080]2)氧化苦参碱聚乳酸微球粒径检测:
[0081]将所制氧化苦参碱微球粒径在10 μ m左右(8-11 μ m)所占百分比作为考察指标，实施例1-3分别为78%，75%和72%，符合肺靶向要求，制得氧化苦参碱聚乳酸微球富集于肺部的毛细血管；对比例I为55%。
[0082]3)氧化苦参碱聚乳酸微球稳定性实验:
[0083]将制得的氧化苦参碱聚乳酸微球置于4°C的冰箱，分别于3个月、6个月后取出观察，实施例1-3制备氧化苦参碱聚乳酸微球形态如初，稳定性良好；对比例I制备的微球3个月时形态变化明显。
[0084]4.氧化苦参碱聚乳酸微球药物缓释性和靶向实验
[0085]I)氧化苦参碱聚乳酸微球体外释药的实验
[0086]采用透析法进行微球体外释药试验。精密取氧化苦参碱或氧化苦参碱聚乳酸微球，加入Iml生理盐水使氧化苦参碱溶解或微球混悬后，分别装入透析袋中，将袋口扎紧，置于盛有50ml生理盐水的溶出杯中，于37土 1°C恒温，50r/min的转速下持续转动，定时取释放液lmL，立即补加等量的生理盐水。将取出的释放液采用HPLC检测，计算药物的累积释放百分率(％)。
[0087]未经包裹的OM在体外的释药很快，15分钟时药物已达42.9%，Ih释放92.8%。实施例1-3制备的氧化苦参碱聚乳酸微球以较恒定的速度缓慢释放药物，12h时累积释药量达86.5%左右，以后基本保持在88-89%，具有明显的缓释效应。对比例I制备的微球2h时释放药物75.2%，缓释效应不明显。
[0088]2)聚乳酸微球体内分布实验
[0089]6?8周龄SPF级BALB/C小鼠(20?22g，由第三军医大学实验动物中心提供)。Super FLuor750, SE (cy7_SE，购自北京泛博生物化学有限公司)。
[0090](I) cy7-SE-氧化苦参碱聚乳酸微球制备方法:
[0091]①称取明胶0.5g于10ml纯化水中溶解，得0.5%的明胶溶液，待用；
[0092]②称取氧化苦参碱50mg，聚乳酸(聚乳酸)50mg，cy7_SE10mg，于Iml 二氯甲烷中溶解，超声I小时，待用；
[0093]③量取1ml 0.5%的明胶溶液于20ml烧杯中，缓慢加入超声过后的氧化苦参碱、cy7-SE和聚乳酸溶液，高剪切乳化机6000rpm/min搅拌5min，然后用磁力搅拌器搅拌2_3小时，得微球溶液；
[0094]④用1ml离心管离心微球溶液:于4000rpm/min下离心15min,弃上清液,用5ml
纯水清洗沉淀固体，重复清洗共3次，得固体沉淀；
[0095]⑤将清洗干净的固体沉淀于_80°C冰箱冷冻30min，放入冻干机冷冻干燥48小时，即得cy7-SE_氧化苦参碱聚乳酸微球。
[0096](2) cy7-SE-氧化苦参碱聚乳酸微球体内分布观察
[0097]称取9mg cy7-SE_氧化苦参碱聚乳酸微球，加Iml无菌生理盐水，2000rpm离心，去上清，沉淀加0.4ml无菌生理盐水重悬，尾静脉注射，在预定时相点活杀动物，活体成像系统观察微球组织分布情况。
[0098]实验结果显示，注射后cy7-SE_氧化苦参碱聚乳酸微球主要分布于肺组织，其它组织几乎未见荧光，肺组织的荧光强度从30min、2h、24h、168h逐渐降低。说明本方法制备的微球具有肺靶向性，并具有缓释性。
[0099]结论:
[0100]1.本发明制备的氧化苦参碱聚乳酸微球，成球性良好，均匀，其平均粒径为8-11 μ m，符合肺靶向要求。
[0101]2.本发明制备的微球在小鼠体内分布具有肺靶向性，体外释放具有明显缓释性。
[0102]上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属【技术领域】中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
【权利要求】
1.一种氧化苦参碱聚乳酸微球的制备方法，包括以下步骤: 1)取明胶在水中溶解得明胶溶液； 2)将氧化苦参碱、聚乳酸用二氯甲烷溶解； 3)在搅拌条件下将步骤2)所得溶液缓慢加入明胶溶液中，继续搅拌得微球溶液； 4)离心，所得沉淀用水清洗得固体沉淀； 5)将步骤4)所得固体沉淀冷冻干燥即得氧化苦参碱微球； 所述氧化苦参碱、聚乳酸和明胶的质量比为1:0.8-1.2:0.8-1.2，所述明胶溶液的浓度为 0.5g/100ml。
2.如权利要求1所述氧化苦参碱聚乳酸微球的制备方法，其特征在于步骤2)氧化苦参碱的浓度为4g/100ml。
3.如权利要求1或2所述氧化苦参碱聚乳酸微球的制备方法，其特征在于步骤2)为超声溶解。
4.如权利要求1或2所述氧化苦参碱聚乳酸微球的制备方法，其特征在于步骤3)中氧化苦参碱溶解液和明胶溶解液的体积比为1:8。
5.如权利要求1或2所述氧化苦参碱聚乳酸微球的制备方法，其特征在于步骤3)的具体操作为:在1650-1750rpm/min搅拌下，将步骤2)所得溶液缓慢加入明胶溶液中，搅拌lOmin,于900rpm/min下搅拌2_3小时,得微球溶液。
6.如权利要求1-5中任意方法制备得到的氧化苦参碱聚乳酸微球在制备肺部疾病靶向治疗药物中的用途。
【文档编号】A61K9/16GK104382858SQ201410590100
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月28日 优先权日:2014年10月28日
【发明者】陈晓红, 苏敏, 冯川东, 陈波, 杨晓洪, 刘涛, 陈鑫 申请人:中国人民解放军第三军医大学