一种稳定高效表达鸡防御素8的细胞系及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种稳定高效表达鸡防御素8的细胞系及应用。本发明提供了猴胎肾细胞MARC145/Gal-8,CCTCCNO：C2014207。该细胞系蛋白表达量高，鸡防御素8表达量高达203.1ng/ml，传代稳定。本发明的细胞系可用于制备抑菌药物，特别是制备家禽抗菌类的生物制品，将该防御素用于鸡疾病防治中，治疗效果显著，安全无毒，具有广泛的应用前景，为进一步研究其抗菌活性、抗菌机理及其在兽用生物制品中的应用奠定了基础。CCTCC NO:C20142072014.11.07
【专利说明】-种稳定高效表达鸡防御轰8的细胞系及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因生物工程【技术领域】，具体涉及一种稳定高效表达鸡防御素8的细 胞系及应用。 技术背景
[0002] 我国是禽类产品出口大国，养禽业的健康发展不仅关系到广大养殖户的经济利 益，还关系到国民的身体健康。然而，由于抗生素的滥用，导致检测出药物残留量超标，严重 威胁食品安全问题，同时也产生了大量的耐药菌株，该给养禽业的疾病防控和治疗工作带 来了严重的阻碍。为了养禽业的健康发展，我们亟需寻找到一种新的途径或者新的方法，防 止耐药性的出现和食品安全等问题。因此寻找和开发无耐药性的新型抗菌药物具有非常重 要的现实意义（Miyasaki，1998)。
[0003] 防御素（defensin)又名嗜中性多肤（Neutrophil Peptides, NP)，是一类对抗外 源性病源菌的防御性肤类活性物质，是生物机体免疫系统的一个重要组成部分，在动物、植 物、昆虫体内广泛存在，具有广谱抗菌功能（Tang, 1999)。研究表明，各种防御素对革兰氏 阴性菌、革兰氏阳性菌、分枝杆菌、霉菌、真菌、囊膜病毒及肿瘤细胞有不同程度的抑制作用 (Salzman，2003)。Gallinacin是广泛存在于鸡体内的一种目-防御素，在鸡防御系统中有 重要作用，具有很强的抗细菌活性和广泛的抗菌谱，提示我们可W将其开发为一种新的抗 微生物制剂。因此，鸡防御素的成功获取能带来极大的社会、经济效益。但鸡体内天然防御 素表达量低、分子小，分离困难，化学合成防御素成本又太高，所W利用基因工程技术重 组表达外源基因已成为获取目标蛋白的有效途径之一。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供了一种能稳定高效表达鸡防御素8 (Gallinacin-8,本发明 或称Ga^8)的细胞系，该细胞系已于2014年11月7日送往中国典型培养物保藏中也进行 保藏，分类命名；猴胎肾细胞MARC145Akd-8,保藏编号；CCTCC NO ;C2014207,地址；中国武 汉武汉大学。
[0005] 本发明的另一个目的在于提供了猴胎肾细胞MRC145/Gal-8细胞系表达的重组 鸡防御素8,该防御素具有显著的抗菌活性，安全性好。
[0006] 本发明的最后一个目的在于提供了猴胎肾细胞MRC145/Gal-8细胞系在制备抑 菌药物中的应用，包括在制备生物防腐剂，生物抑菌剂中的应用，还包括用于制备家禽生物 药品中的应用，特别是在制备鸡细菌感染性疾病药物中的应用。
[0007] 为了实现上述的目的，本发明采用W下技术措施：
[0008] -种能稳定高效表达鸡防御素8的细胞系，其制备方法如下：
[000引 （1)从15日龄的仔鸡体内采集新鲜的鸡肾组织，提取鸡组织总RNA。反转录的CDNA 产物用0化36 1371：处理20111111^去除基因组0臟污染；
[0010] (2)根据鸡防御素8基因序列，PCR扩增鸡防御素8,设计引物如下：
[0011] P8-1 ;5' CGGAATTCATGAAGATCCTTTACCTTCTCTTGG 3'
[0012] P8-2 ;5' CGGGATCCTTAGTCGTACACAGTCCGGCA 3'
[0013] (3)用EcoR I和BamH I双酶切鸡防御素8和PIRES2-EGFP，将防御素8基因连 接到载体PIRES2-EGFP，获得重组质粒pIRES2-EGFP-GAk8,用于细胞转染。
[0014] (4)将复苏后传代3次的marc-145细胞W膜蛋白酶消化，用含10%胎牛血清的高 糖DMEM培养基调成5 X IO5个/mL的密度，接种于若干个直径为35mm的培养皿中，于37C、 5%(：〇2的细胞培养箱中培养2化。待细胞融合至70%?80%时，按照^口〇'6(31311111162000 操作说明书进行细胞转染操作，对照组不加脂质体。化后更换有血清、无双抗的高糖DMEM 培养基继续培养。转染4她后，开始用600 y g/mL的G418进行筛选，直至绝大部分细胞死 亡，维持筛选6周。将获得的细胞采用极限稀释法传至96孔细胞培养板。每孔大约1个细 胞，交替使用常规培养基和G418化OOy g/mL)培养基培养单个细胞，至其长出单个克隆。在 英光显微镜下挑选出最优的细胞克隆继续培养，并不断扩繁至建立新的细胞系，得到稳定 转染PIRES2-EGFP-GAL-8的细胞系。该细胞系已于2014年11月7日送往中国典型培养物保 藏中也进行保藏，分类命名；猴胎肾细胞MRC145Akd-8,保藏编号；CCTCC N0;C2014207。 地址；中国武汉武汉大学。
[0015] 它具有W下特征；（1)从形态上观察，猴胎肾细胞MRC145/Gal-8形态比较规则， 呈近圆形，细胞折光性强，胞质饱满，核质清晰；(2)细胞易于消化、贴壁和传代，最适在含 10%胎牛血清的DMEM培养基中生长，细胞倍增时间为32h ; (3)能高效表达鸡防御素8,具 有较好的抑菌活性，抑菌谱广泛；（4)细胞传代50次W上，仍可W稳定遗传Gal-8基因，稳 定表达出鸡防御素8。
[0016] 猴胎肾细胞MRC145/Gal-8细胞系在制备抑菌药物中的应用，包括在制备生物防 腐剂，生物抑菌剂中的应用，所述的鸡防御素8在作为生物防腐剂或抑菌剂时，将其涂布在 需防腐或抑菌的物体表面即可还包括用于制备家禽生物药品中的应用，特别是在制备治疗 鸡细菌感染性疾病药物中的应用，将其制备成各类具有抑菌作用的剂型，直接用于家禽即 可。
[0017] 与现有技术相比，本发明具有W下特点：
[0018] (1)本发明提供的真核表达载体PIRES2-EGFP-GAL-8可W同时表达重组鸡防御素 8和绿色英光蛋白，其优点是可对转染结果进行直观、及时的观察和检测；能高效表达重组 鸡防御素8,蛋白获取方法简单，成本低。
[0019] (2)本发明提供的重组鸡防御素8具有显著的抗菌活性，安全性好，提供了一种新 的鸡疾病防治中的抗菌药物的方法及其在兽用生物制品中的应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1为一种重组表达质粒PIRES2-EGFP-GAL8PCR鉴定示意图。
[0021] M, DL2000marker ;1, GAk8。
[002引 图2为一种重组表达质粒PIRES2-EGFP-GAL8酶切鉴定示意图。
[0023] M, DL2000marker ; 1，ECORI 和 BamHI 双酶切重组质粒 PIRES2-EGFP-GAk8。
[0024] 图3为一种稳定转染GAkS基因的marcl45细胞示意图。
[002引 A,未转染的Marc-145细胞；A':稳定转染GAL-8基因的marcl45细胞。
[0026] 图4为一种PIRES2-EGFP-GAL-8重组质粒PCR稳定性检测示意图。
[0027] 其中M，化2000marker ;1，连续培养10代重组质粒；2,连续培养30代重组质粒； 3,连续培养50代重组质粒。
[0028] 图5为一种GAL-8蛋白表达的Western Blot鉴定示意图。
[0029] 1，连续培养10代重组蛋白；2,连续培养30代重组蛋白；3,连续培养50代重组蛋 白。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合附图及具体实施例子对本发明作进一步说明。在实施例中涉及的所有培 养基和分子生物学操作方法为本领域技术人员所熟知。本实验所涉及的分子生物学方法为 常规方法，为本领域人员所熟悉。本发明中未详细阐述的请参见《分子克隆实验指南》J.萨 姆布鲁克，D.W.拉塞尔等主编。
[00引]实施例1 ;
[0032] -种能稳定高效表达鸡防御素8的细胞系，通过W下步骤筛选得到：
[0033] (1)鸡肾组织总RNA的提取及反转录
[0034] 从15日龄的仔鸡体内采集新鲜的鸡肾组织，按照TRIz化Reagent试剂盒佑IBCO 公司）并按其说明书提取鸡组织总RNA。反转录的CDNA产物用面ase I 37C处理20min W去除基因组DNA污染。
[00巧](2)鸡防御素基因的制备：
[0036] 1)鸡防御素8基因的制备：
[0037] 根据GeneBank中已经发表的鸡防御素8基因的序列；GeneBank ;NM_001001781. 1 设计引物，
[0038] P8-1 ;5' CGGAATTCATGAAGATCCTTTACCTTCTCTTGG 3'
[0039] P8-2 ;5' CGGGATCCTTAGTCGTACACAGTCCGGCA 3'
[0040] W步骤1)中的CDNA为模板进行PCR，PCR反应体系为；20ymol/L的引物各IyL, 2. 5mmol/L 的 dNTPs 5uL，10Xbuffer 5uL，2. 5U/UL 的 Thq DNA 聚合酶 IyL,加 d地2〇 至50y L。反应程序：94°C预变性4min ;94°C变性30s，56°C退火40s，72°C延伸45s，共30 个循环；72°C延伸lOmin，得到鸡防御素8基因，其序列为SEQ ID NO. 1所示。
[0041] (3)真核表达载体的构建
[0042] 1)真核表达载体PIRES2-EGFP-GAL-8的构建：
[0043] 用限制性内切酶EcoR I、BamH I双酶切载体PIRES2-EGFP和纯化的GAkSPCR产 物。酶切体系如下：
[0044]
【权利要求】
1. 一种稳定高效表达鸡防御素8的细胞系，其特征在于：猴胎肾细胞MARC145/Gal-8， CCTCC NO ：C2014207〇
2. 权利要求1所述细胞系表达的鸡防御素。
3. 权利要求1所述细胞系的细胞培养上清液。
4. 权利要求1所述的细胞系或权利要求2所述的鸡防御素在制备抑菌药物中的应用。
5. 根据权利要求4所述的应用，所述的应用为在制备生物防腐剂中的应用。
6. 根据权利要求5所述的应用，所述的应用为在制备家禽抗菌生物制品中的应用。
7. 根据权利要求6所述的应用，所述的应用为在制备鸡细菌感染性疾病药物中的应 用。
【文档编号】A61P31/04GK104357399SQ201410649945
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月17日 优先权日:2014年11月17日
【发明者】周莉, 谭本忠, 钱运国, 高其双, 陈志华, 刘武, 彭霞, 卢顺, 童伟文, 夏瑜, 王连芳 申请人:武汉市畜牧兽医科学研究所