一种空白plga微球及制备方法
【专利摘要】发明提供一种空白聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球，由水-油-水乳胶法制备获得。本发明利用二氯甲烷的优良溶解能力，聚乙烯醇的乳化作用，将PLGA粉末制备成PLGA微球。通过对该微球的表征观察及粒径测定，得知该生物支架材料的直径大小，表面征象，此PLGA空白微球直径符合能被注射大小。通过CCK-8测定和乳酸脱氢酶测定得知，该微球对附着的间充质干细胞没有毒性且不影响生长活性。与壳聚糖颗粒相比，制作方法简单，重复率高，结构明确，在生物体内易被降解且不影响微环境代谢，在组织再生工程中为不同治疗目的充当良好的细胞载体。
【专利说明】一种空白PLGA微球及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物组织工程细胞支架材料，涉及生物材料乳化转型方法，尤其涉及一种空白PLGA (聚乳酸-羟基乙酸共聚物)微球及制备方法。
【背景技术】
[0002]已有许多研宄组利用髓核细胞或间充质干细胞复合细胞支架用于椎间盘组织工程的研宄。在生物支架材料的评估中，主要使用固态和预成型的细胞支架包括网状支架和纤维网格。但这些细胞支架，用于移植细胞的载体时，需要开放性切口植入到椎间盘内，破坏了椎间盘天然密闭微环境，故缺陷明显。同时此类细胞支架多采用琼脂，透明质酸等为原料，虽对生物无害，但因体积较大，已破坏椎间盘原有微生物环境，生物组织相容性不佳，且无法保证能在治疗完成后被生物体降解。新型空白PLGA微球为细胞附着，生长，分化等提供了优良的载体，且对生物体无毒无害，并使细胞支架在治疗完成后被生物体降解成为可會泛。
【发明内容】
[0003]发明的目的是提供一种空白聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)微球，所述的空白PLGA微球由水-油-水(w/o/w)乳胶法制备，具体通过以下步骤实现:PLGA溶于二氯甲烷，将混合溶液注入含有2% (w/v)聚乙稀醇(poly (vinyl alcohol，PVA)的水溶液，用磁力搅拌器以600rpm搅拌2-3小时(35° C)，脱去二氯甲烧，以1500rpm速度离心2min后收集微球体，用蒸馏水洗涤6次后冻干即得。
[0004]本发明的另一个目的是提供所述微球在制备生物支架载体中的应用。
[0005]本发明方法基于以下原理设计:(1)为了得到能被注射入生物体内并能被细胞附着的载体；(2)为了得到生物组织相容性良好对机体无毒无害的支架模型；(3)实现细胞支架在一定时间后被生物体降解的可能。
[0006]本发明通过水-油-水(w/o/w)乳胶法，利用二氯甲烷的优良溶解能力，聚乙烯醇的乳化作用，将PLGA粉末制备成PLGA微球。通过对该微球的表征观察及粒径测定，得知该生物支架材料的直径大小，表面征象，此PLGA空白微球直径符合能被注射大小。通过CCK-8测定和乳酸脱氢酶(LDH)测定得知，该微球对附着的间充质干细胞没有毒性且不影响生长活性。与壳聚糖颗粒相比，制作方法简单，重复率高，结构明确，在生物体内易被降解且不影响微环境代谢，在组织再生工程中为不同治疗目的充当良好的细胞载体。
【专利附图】
【附图说明】
[0007]图1是空白PLGA微球在不同放大倍数下SEM照片。
[0008]图2是通过CCK-8值测定空白PLGA微球对细胞增殖的影响。
[0009]图3是通过LDH释放测定空白PLGA微球对细胞凋亡的影响。
【具体实施方式】
[0010]下面通过附图和实施例对本发明作出进一步的具体说明，但本发明不局限于这些实施例。
[0011 ] 实施例1以6gPLGA制作空白PLGA微球
该空白PLGA微球制备步骤:PLGA(6g)溶于30ml 二氯甲烷，利用玻璃注射器(规格，20G)将混合溶液注入300ml含有2% (w/v)聚乙稀醇(poly (vinyl alcohol，PVA)的水溶液，用磁力搅拌器以600rpm搅拌2-3小时(35° C)，脱去二氯甲烧，以1500rpm速度离心2min后收集微球体，用蒸馏水洗涤6次后冻干即得。
[0012]实施例2以12gPLGA制作空白PLGA微球。
[0013]该空白PLGA微球制备步骤:PLGA(12g)溶于60ml 二氯甲烷。将混合溶液注入600ml含有2% (w/v) PVA的水溶液。用磁力搅拌器以600rpm搅拌2-3小时(35° C)，脱去二氯甲烧。以1500rpm速度离心2min后收集微球体，用蒸饱水洗涤6次后冻干既得。(SEM下形态参见图1)
实施例3以24gPLGA制作空白PLGA微球。
[0014]该空白PLGA微球制备步骤:PLGA(24g)溶于120ml 二氯甲烷。将混合溶液注入1200ml含有2% (w/v) PVA的水溶液。用磁力搅拌器以600rpm搅拌2-3小时(35° C)，脱去二氯甲烧。以1500rpm速度离心2min后收集微球体，用蒸饱水洗涤6次后冻干。
[0015]实施例4
目前此项研宄已被成功用于椎间盘退变大鼠尾部以修复退变椎间盘，实验通过构建大鼠退变椎间盘模型，并将单独间充质干细胞与间充质干细胞合并空白PLGA微球注射入退变椎间盘，以研宄搭载支架的干细胞对退变椎间盘的修复作用。实验结果显示空白PLGA微球组间充质干细胞增殖率与正常对照组相比无明显降低，提示空白PLGA微球不影响间充质干细胞的增殖率(见图2)。空白PLGA微球组细胞LDH释放与正常对照组相比无显著性差异，提示空白PLGA微球对间充质干细胞无毒性作用(见图3)，此项实验证明了此项研宄成果的可靠性与有效性。空白PLGA微球为细胞的附着提供了良好的支架环境，使细胞更容易集中在退变区域发挥作用。空白PLGA使用不仅仅局限于椎间盘环境，膝关节，肩关节等不同关节，骨折断裂处等均可使用，以促使细胞定位与集中，在组织再生工程中为不同治疗目的提供了优良的细胞载体，加之良好的组织相容性和较低的免疫原性，以及PLGA自身的优良降解特性。
【权利要求】
1.一种空白聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球，所述的空白PLGA微球由水-油-水乳胶法制备，其特征在于，具体通过以下步骤实现:取聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于30ml 二氯甲烷，将混合溶液注入含有w/v为2%的聚乙烯醇的水溶液，用磁力搅拌器以搅拌2-3小时，脱去二氯甲烷，离心后收集微球体，用蒸馏水洗涤后冻干即得。
2.根据要求I所述的一种空白聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球，其特征在于，用磁力搅拌器，在35°C以600rpm搅拌2_3小时。
3.根据要求I所述的一种空白聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球，其特征在于，以1500rpm速度离心2min后收集微球体。
4.根据要求I所述的一种空白聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球，其特征在于，用蒸馏水洗涤6次后冻干。
5.根据要求I所述的一种空白聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球，其特征在于，利用玻璃注射器将混合溶液注入到含有2%的聚乙烯醇的水溶液中。
6.根据权利要求1所述的一种空白聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球在制备生物支架载体中的应用。
【文档编号】A61L27/18GK104448356SQ201410762387
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月13日 优先权日:2014年12月13日
【发明者】梁成振, 周校澎, 李方财, 陈其昕 申请人:浙江大学