本申请涉及制药领域，特别涉及中草药提取物的制备及其用途。
背景技术：
缺血性心脏病(Ischemic heart disease，IHD)指由于冠状动脉功能性或器质性病变，在诱发因素如过劳、情绪激动、寒冷等刺激下导致冠状动脉痉挛甚至血栓形成，冠脉血流量骤然降低，致使冠脉供血和心肌需求之间不平衡，心肌代谢产物增加而出现的临床病理状态。IHD是一种高发病率、高致残率和高病死率的疾病，已成为我国第三大致死性疾病。心肌缺血时会导致心肌缺氧、心肌细胞代谢紊乱、心功能降低、有害产物难以清除而产生心绞痛等症状。因而尽早恢复冠脉血流的再灌注，降低心肌耗氧量，清除有害代谢产物是临床治疗心肌缺血最有效的措施。
毛郁金(Curcuma aromatica Salisb)是姜科姜黄属植物毛郁金的干燥根茎，国内主要分布于广西等地区，别名广西黄姜，目前已收载于《广西壮药质量标准》第二版[9]。该药材气香、味辛、微苦，具有行气破血、通经止痛之功效。壮医常用于阿闷(心绞痛)，京瑟(闭经)，腊胴尹(腹痛)等病的治疗，且疗效显著。
技术实现要素：
根据本申请的一方面，提供了一种毛郁金(Curcuma aromatica Salisb)乙醇提取物的制备方法，包括将毛郁金根茎干燥、粉碎成粗粉，用相同体积量50％至70％乙醇浸泡过夜，用10-20倍量50％至70％乙醇回流提取2-5次，第一次提取2-4小时，其后每次提取2-3h，减压回收提取溶剂，真空冷冻干燥。
根据本申请的另一方面，提供了根据上述制备方法制得的毛郁金乙醇提取物。
根据本申请的另一方面，提供了上述毛郁金乙醇提取物在制备用于治 疗缺血性心脏病的药物中的用途。
本申请的毛郁金乙醇提取物对于心率，ST段和T波的异常有较好的缓解作用，最终接近于正常值，有较强的抗氧化活性，对心肌缺血有较好的保护作用。
附图说明
图1示出了根据本发明的实施例2中各组大鼠的CK-MB、LDH、TAC、NO、MDA和SOD水平。
具体实施方案
在以下的说明中，包括某些具体的细节以对各个公开的实施方案提供全面的理解。然而，相关领域的技术人员会认识到，不采用一个或多个这些具体的细节，而采用其它方法、部件、材料等的情况下可实现实施方案。
除非本申请中另外要求，在整个说明书和权利要求书中，词语“包括”和“包含”应解释为开放式的、含括式的意义，即“包括但不限于”。
在整个本说明书中提到的“一实施方案”或“实施方案”或“在另一实施方案中”或“在某些实施方案中”意指在至少一实施方案中包括与该实施方案所述的相关的具体参考要素、结构或特征。因此，在整个说明书中不同位置出现的短语“在一实施方案中”或“在实施方案中”或“在另一实施方案中”或“在某些实施方案中”不必全部指同一实施方案。此外，具体要素、结构或特征可以任何适当的方式在一个或多个实施方案中结合。
应当理解，术语“或”通常以其包括“和/或”的含义而使用，除非文中另外明确地规定。
根据本申请的一方面，提供了一种毛郁金(Curcuma aromatica Salisb)乙醇提取物的制备方法，包括将毛郁金根茎干燥、粉碎成粗粉，用相同体积量50％至70％乙醇浸泡过夜，用10-20倍量50％至70％乙醇回流提取2-5次，第一次提取2-4小时，其后每次提取2-3h，减压回收提取溶剂，真空冷冻干燥。
在某些实施方案中，回流提取步骤中50％至70％乙醇的量为12倍量。
在另一些实施方案中，第一次提取的时间为3小时，第二次提取的时间为2.5小时。
根据本申请的另一方面，提供了根据上述制备方法制得的毛郁金乙醇提取物。
根据本申请的另一方面，提供了上述毛郁金乙醇提取物在制备用于治疗缺血性心脏病的药物中的用途。
本申请的毛郁金乙醇提取物对于心率，ST段和T波的异常有较好的缓解作用，最终接近于正常值，有较强的抗氧化活性，对心肌缺血有较好的保护作用。
下文中，本申请将通过如下实施例进行详细解释以便更好地理解本申请的各个方面及其优点。然而，应当理解，以下的实施例是非限制性的而且仅用于说明本申请的某些实施方案。
本申请实施例中使用的动物及材料来源如下。
1.动物
SPF级健康雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠，体重180-220g，由广西医科大学医学科学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号SCXK(桂)2009-0002，实验动物使用许可证号SYXK(桂)2009-0004。
2.主要试剂
复方丹参片(CDT，河南省宛西制药股份有限公司，生产批号140805)；异丙肾上腺素(ISO，上海和丰制药有限公司，生产批号20120701)；福林酚试剂(国药集团化学试剂有限公司，生产批号20150610)以下试剂均购自南京建成科技生物工程研究所：SOD试剂盒(生产批号20120823)，MDA测试盒(生产批号20120709)，TAC试剂盒(生产批号20121026)，CK-MB试剂盒(生产批号20121128)，NO试剂盒(生产批号20120921)，LDH试剂盒(酶标法，20120921)。
3.主要仪器
TDL-5A型高速离心机(上海菲恰尔分析仪器有限公司)；721紫外分光光度计(上海精密科学仪器有限科技有限公司)；涡旋混匀器(Genius公司)；电热恒温水浴箱(北京长安科学仪器厂)；高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；心电图仪(喜鹊牌单导心电图机XD-7100，上海医疗器械高新技术公司)。
实施例1 毛郁金醇提物的制备
试物原生药(采自广西横县)经广西中医药研究院赖茂祥研究员鉴定为姜科毛郁金(Curcuma aromatica Salisb.)，凭证标本存放于广西医科大学药学院。将毛郁金根茎干燥、粉碎成粗粉，分别用相同体积量的30％，50％，70％，90％乙醇浸泡过夜，用12倍量溶剂回流提取4次，第一次提取3h，第2～4次分别提取2.5h，减压回收提取溶剂，真空冷冻干燥，得各部位粗提膏。各样品均在4℃冰箱中密封保存备用。
实施例2 动物实验
1.实验动物筛选
用45mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，仰位固定于鼠板，将心电图仪针形电极插入大鼠四肢皮下，仪器设置为心电图II导联，走纸速度25mm/s。皮下注射异丙肾上腺素ISO 30mg/kg，观察大鼠注射ISO后心电图II导联T波变化，筛选注射ISO后1min内T波升高，ST段抬高(＞0.1mV)随后T波低平、双向或倒置的动物纳入ISO致大鼠急性心肌缺血实验组。
2.分组与给药方法
取70只对ISO敏感的SPF级SD雄性大鼠适应性饲养3天后，随机分组，每组10只：正常对照组(Sham)，模型对照组(Model)，阳性药对照组(CDT)，30％乙醇提取物组，50％乙醇提取物组，70％乙醇提取物组，90％乙醇提取物组。毛郁金各提取物组给药剂量均为150mg/kg，约相当于生药原粉给药量为1.5g/kg剂量；阳性药1对照组给予姜黄素0.4mg/kg，阳性药2对照组给予复方丹参片600mg/kg；正常对照组和模型对照组给予相同体积量的生理盐水，每天灌胃给药一次，连续给药9天。
3.急性心肌缺血模型的建立
ISO模型实验组于最后两天给药的同时，除正常对照组皮下注射相同体积量生理盐水外，各受试药物组、阳性对照组和模型对照组均于给药30min后注射ISO 30mg/kg，1次/天，连续两天。
4.观察指标
用45mg/kg剂量的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，仰位固定于鼠板，记录注射前和注射后不同时间点(0，30s，1min，3min，5min，7min，10min，15min)大鼠心电图(Electrocardiogram，ECG)记录大鼠的心率、 ST段幅度及T波值；于注射ISO 45min后眼眶取血，于4℃下1000g离心分离血清，测定血清SOD、MDA、TAC、CK-MB、LDH和NO含量。
5.多酚测定
多酚含量常用福林酚法测定，其中没食子酸常用来做标准曲线来测定天然产物中多酚的含量。本实验中，多酚的含量测定采用了改进与优化条件的福林酚方法。
将5g毛郁金根茎分别用12倍量的30％、50％、70％和90％浓度的乙醇回流提取3次，趁热过滤，减压回收溶剂，分别得30％、50％、70％和90％乙醇的提取物，然后分别溶解在4个25mL容量瓶中，并用甲醇定容至25mL，作为提取物溶液。分别用移液枪移取0.1mL提取物溶液至4只10mL比色管中，然后分别用移液枪加入1.5mL福林酚试剂，混合均匀静置30s后，分别加入2mL12％的Na2CO3溶液，摇匀后分别用蒸馏水定容至10mL，常温下反应1h，每份样品平行做3次，在最大吸收波长758nm处测定吸光值。
标准曲线的建立：用移液枪分别精确地移取浓度为0.2488mg/mL的没食子酸标准溶液0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于10mL比色管中，加入1.5mL的福林酚试剂，放置30s，再加入2mL 12％的Na2CO3溶液摇匀后分别用蒸馏水定容至10mL，常温下反应1h，每份样品平行做3次，在最大吸收波长758nm处测定吸光值。以没食子酸标准溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，建立标准曲线。
6.统计学处理
所有数据均采用SPSS 16.0统计学软件分析，结果用均数±标准差()表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用t检验，P＜0.05为具有统计学意义。
7.结果
7.1毛郁金各部位对ISO诱导的急性心肌缺血大鼠心率的影响
结果如表1所示，与正常组比较，ISO诱导大鼠心动过缓，说明模型成功。ISO诱导后3min，阳性对照组和90％部位的大鼠心率显著提高(P＜0.05)，ISO诱导7min后，阳性对照组和90％部位的大鼠心率无显著性差异；ISO诱导15min，50％，70％，90％部位的大鼠心率几乎恢复至正常水平，相反30％部位的大鼠与假手术组和模型组比较均无显著性差 异。
表1. 毛郁金各部位对ISO诱导的AMI大鼠心率的影响(n＝10)
30％，50％，70％，90％分别对应于30％、50％、70％、90％乙醇提取部位；P＜0.05表示有显著性差异；aP＜0.05与假手术组比较，bP＜0.05与模型组比较。在表2，3，4和图中所表述含义相同，不重复。
7.2毛郁金各提取部位对ISO诱导的急性心肌缺血大鼠T波和ST波的影响
实验结果如表2和表3所示，ISO诱导15分钟后，与假手术组比较，毛郁金各提取部位及阳性药CDT组大鼠的T波和ST波基本恢复正常，然而，阴性组大鼠的T波和ST波显著提高(P＜0.05)，说明毛郁金提取物有抑制ISO诱导大鼠T波和ST波上升的作用。阳性组、50％、90％提取部位的大鼠，给药1分钟后，ST波明显降低，30％和70％部位7分钟后显示相同的作用。另一方面，毛郁金30％，50％和70％部位的大鼠，ISO诱导后3分钟，T波显著减小(P＜0.05，和模型组比较)，阳性组和90％部位的大鼠ISO诱导7分钟后显示相同的药理活性。上述现象说明毛郁金提取部位与CDT均可以改善ISO诱导大鼠的T波和ST波改变。
表2 毛郁金各提取部位对ISO诱导AMI大鼠ST波的影响(n＝10)
表3 毛郁金各提取部位对ISO诱导AMI大鼠T波的影响(n＝10)
7.3毛郁金各提取部位对ISO诱导的AMI大鼠心肌酶和抗氧化能力的影响
表4和图1总结了各组大鼠CK-MB，LDH，TAC，NO，MDA和SOD水平。和假手术组比较，模型组动物的各项指标均显示显著性差异，说明ISO诱导ISO模型成功。与阳性组比较，毛郁金50％和70％部位大鼠的CK-MB无显著性差异(P＞0.05)，50％，70％和90％部位大鼠的LDH也无显著性差异(P＞0.05)；用CDT、毛郁金各提取物处理后的大鼠，它们的抗氧化水平几乎恢复正常，这些提取物有效地增强抗氧化酶的抗氧化能力；与假手术组比较，毛郁金70％部位大鼠血清中的TAC，NO，MDA和SOD水平无显著性差异(P＞0.05)；50％和70％部位大鼠血清中的TAC，MDA和SOD水平与阳性组比较无显著性差异(P＞0.05)，说明毛郁金50％和70％部位显示良好的心肌保护ISO诱导的AMI大鼠作用，其中70％部位保护大鼠心肌活性最好，70％提取部位和CDT组大鼠几乎恢复这些酶活性至正常水平。
表4毛郁金各提取部位对ISO诱导AMI大鼠血清中CK-MB，LDH， TAC，NO，MDA和SOD的影响(n＝10)
cP＜0.05vs.CDT.
7.4毛郁金各提取物中多酚的含量
各部位多酚含量中，横坐标为没食子酸标准溶液浓度，纵坐标为吸光度值建立标准曲线。标准曲线为y＝0.1355x+0.0536(r2＝0.9959)，毛郁金30％，50％，70％和90％部位多酚的含量分别是3.389±0.038，2.684±0.0381，5.629±0.037和5.307±0.041mg/g原生药，结果显示多酚含量最高的部位是70％乙醇提取部分。
8.讨论
急性心肌缺血是由于冠状动脉功能性或器质性病变，在诱发因素如过劳、情绪激动、寒冷等刺激下导致冠状动脉痉挛，冠脉血流量骤然降低，致使冠脉供血和心肌需求之间不平衡，心肌代谢产物增加，进而产生心绞痛等临床表现的一种病理状态。目前急性心肌缺血药物造模的动物模型之一是给予大剂量的ISO造成短时间的心肌缺血。
CK-MB是心肌损伤的特异性分子标志物，其血清含量高低与心肌缺血的严重程度呈正相关；LDH是体内能量代谢过程中的关键酶之一，当心肌等组织出现坏死时，血清中LDH含量升高。因此，血清LDH、CK-MB含量的测定可以作为AMI模型是否成功或动物恢复程度的判定标准之一。
TAC反应体内总抗氧化能力；SOD是体内重要的抗氧化物质，其活性的高低可间接反应机体清除氧自由基的能力；脂质过氧化反应的中间产 物MDA反应机体细胞受自由基攻击的严重程度；NO是血管内皮细胞产生的内源性活性物质，可扩张冠状动脉，还可以抗中性粒细胞和血小板黏附聚集，其含量高低可以反应冠状动脉的收缩程度及血流动力学的变化。
本实验结果显示，给予大剂量ISO后可以使模型组大鼠ECG的ST段和T波显著升高，心率明显下降，血清中CK-MB、MDA、LDH含量明显增高，表明ISO成功诱导大鼠AMI模型。与模型组比较，30％、50％、70％、90％乙醇提取物和复方丹参片预处理的大鼠在心率，ST段和T波的异常有较好的缓解作用，最终接近于正常值，其中90％乙醇提取物和复方丹参效果最佳，其次70％和50％提取物也有较好的效果。从抗氧化指标TAC、NO、MDA、SOD来看，30％、50％、70％、90％乙醇提取物和复方丹参片预处理的大鼠与模型组大鼠有显著性差异，大部分指标与正常值无显著性差异，其中70％乙醇提取物效果最好，优于复方丹参片，其次为50％提取物，表明毛郁金提取物有较强的抗氧化活性，对心肌缺血有较好的保护作用。在心肌酶指标CK-MB、LDH方面来看，30％、50％、70％、90％乙醇提取物和复方丹参片预处理的大鼠与模型组大鼠均有显著性差异，其中70％乙醇提取物与复方丹参片几乎有相同的效果，其次为50％乙醇提取物，表明毛郁金乙醇提取物对心肌的较好的保护作用。综合各指标来看70％乙醇提取物对AMI大鼠有良好的保护作用，活性最好。
从前述中可以理解，尽管为了示例性说明的目的描述了本申请的具体实施方案，但是在不偏离本申请的精神和范围的条件下，本领域所述技术人员可以作出各种变形或改进。这些变形或修改都应落入本申请所附权利要求的范围。