用于表征和治疗急性髓样白血病的方法与流程

本申请分别要求2014年5月20日提交的美国临时专利申请序列号62/001,015；2014年6月12日提交的62/011,456；和2014年11月5日提交的62/075,715的优先权和权益。这些申请中每篇的全部内容据此通过引用方式并入本文。

发明背景

急性髓样白血病(AML)与骨髓中的异常母细胞的积累有关。急性髓样白血病(AML)是成年人中的最常见的白血病类型之一。仅在美国，每年鉴定出超过18,000例新的AML病例，并且超过10,000例死亡与AML有关。尽管对化学疗法的高初始响应率，许多急性髓样白血病(AML)患者未能实现完全消退。实际上，大多数AML患者从诊断起在3-5年内复发。认为AML复发是由于持续性白血病干细胞(LSC)的生长。因而，迫切需要用于表征受试者中的AML和鉴定有效疗法的改善的方法，以及用于治疗AML复发的改善的方法。

发明概述

如下文描述，本发明的特征在于使用本发明的免疫缀合物表征和治疗受试者中的急性髓样白血病(AML)(例如，新诊断、复发性和难治性AML)的方法。

在一个方面，本发明一般特征在于治疗受试者(例如人)中的急性髓样白血病的方法，所述方法牵涉对预选受试者施用有效量的免疫缀合物，其中免疫缀合物含有经由由以下结构式所示的可裂解的二硫化物接头与细胞毒性苯二氮杂二聚体化合物缀合的人源化或嵌合抗体或片段：

其中抗体含有重链可变区，所述重链可变区含有一个或多个互补决定区，所述互补决定区是SEQ ID NO:1-3中的任一个或多个；和/或轻链可变区，所述轻链可变区含有一个或多个互补决定区，所述互补决定区是SEQ ID NO:4-6中的任一个或多个；以及由以下结构式之一所示的所述细胞毒性苯二氮杂二聚体化合物或其药学上可接受的盐：

其中Y是–SO₃M并且M是H或药学上可接受的阳离子，并且其中预选牵涉检测所述受试者的生物样品中的CD33。

在另一个方面，本发明的特征在于：治疗受试者中的急性髓样白血病的方法，所述方法牵涉对在生物样品中测定为每个细胞具有约1,000个CD33抗原的受试者施用有效量的免疫缀合物，其中免疫缀合物含有经由由以下结构式所示的可裂解的二硫化物接头与细胞毒性苯二氮杂二聚体化合物缀合的人源化或嵌合抗体或片段：

其中抗体含有重链可变区，所述重链可变区含有一个或多个互补决定区，所述互补决定区是SEQ ID NO:1-3中的任一个或多个；和/或轻链可变区，所述轻链可变区含有一个或多个互补决定区，所述互补决定区是SEQ ID NO:4-6中的任一个或多个；以及由以下结构式之一所示的所述细胞毒性苯二氮杂二聚体化合物或其药学上可接受的盐：

其中Y是–SO₃M并且M是H或药学上可接受的阳离子，并且其中预选牵涉检测所述受试者的生物样品中的CD33。

在另一个方面，本发明的特征在于治疗具有FLT3-ITD阳性急性髓样白血病的受试者的方法，所述方法牵涉对预选受试者施用有效量的免疫缀合物，其中免疫缀合物含有经由由以下结构式所示的可裂解的二硫化物接头与细胞毒性苯二氮杂二聚体化合物缀合的人源化或嵌合抗体或片段：

其中抗体含有重链可变区，所述重链可变区含有一个或多个互补决定区，所述互补决定区是SEQ ID NO:1-3中的任一个或多个；和/或轻链可变区，所述轻链可变区含有一个或多个互补决定区，所述互补决定区是SEQ ID NO:4-6中的任一个或多个；以及由以下结构式之一所示的所述细胞毒性苯二氮杂二聚体化合物或其药学上可接受的盐：

其中Y是–SO₃M并且M是H或药学上可接受的阳离子，并且其中所述预选包括检测所述受试者的生物样品中的FLT3-ITD。

在另一个方面，本发明的特征在于治疗具有急性髓样白血病的受试者的方法，所述方法包括对确定为具有FLT3-ITD阳性急性髓样白血病的预选受试者施用有效量的免疫缀合物，其中免疫缀合物含有经由由以下结构式所示的可裂解的二硫化物接头与细胞毒性苯二氮杂二聚体化合物缀合的人源化或嵌合抗体或片段：

其中抗体含有重链可变区，所述重链可变区含有一个或多个互补决定区，所述互补决定区是SEQ ID NO:1-3中的任一个或多个；和/或轻链可变区，所述轻链可变区含有一个或多个互补决定区，所述互补决定区是SEQ ID NO:4-6中的任一个或多个；以及由以下结构式之一所示的所述细胞毒性苯二氮杂二聚体化合物或其药学上可接受的盐：

其中Y是–SO₃M并且M是H或药学上可接受的阳离子，并且其中预选包括测定所述受试者的生物样品中的FLT3-ITD状态。

在另一个方面，本发明的特征在于鉴定受试者为对用免疫缀合物的治疗有响应的方法，所述方法牵涉：检测来自所述受试者的生物样品中的FLT3-ITD，以及将FLT3-ITD的检测与所述受试者对治疗的响应性关联，其中所述生物样品中的FLT3-ITD的存在鉴定所述受试者为对用所述免疫缀合物的治疗有响应，

其中免疫缀合物含有经由由以下结构式所示的可裂解的二硫化物接头与细胞毒性苯二氮杂二聚体化合物缀合的人源化或嵌合抗体或片段：

其中抗体含有重链可变区，所述重链可变区含有一个或多个互补决定区，所述互补决定区是SEQ ID NO:1-3中的任一个或多个；和/或轻链可变区，所述轻链可变区含有一个或多个互补决定区，所述互补决定区是SEQ ID NO:4-6中的任一个或多个；以及由以下结构式之一所示的所述细胞毒性苯二氮杂二聚体化合物或其药学上可接受的盐：

其中Y是–SO₃M并且M是H或药学上可接受的阳离子。

在另一个方面，本发明的特征在于治疗或预防受试者中的急性髓样白血病复发的方法，所述方法牵涉对确定为具有FLT3-ITD阳性急性髓样白血病并且尚未接受用酪氨酸激酶抑制剂的在先治疗的预选受试者施用有效量的免疫缀合物，其中免疫缀合物含有经由由以下结构式所示的可裂解的二硫化物接头与细胞毒性苯二氮杂二聚体化合物缀合的人源化或嵌合抗体或片段：

其中抗体含有重链可变区，所述重链可变区含有一个或多个互补决定区，所述互补决定区是SEQ ID NO:1-3中的任一个或多个；和/或轻链可变区，所述轻链可变区含有一个或多个互补决定区，所述互补决定区是SEQ ID NO:4-6中的任一个或多个；以及由以下结构式之一所示的所述细胞毒性苯二氮杂二聚体化合物或其药学上可接受的盐：

其中Y是–SO₃M并且M是H或药学上可接受的阳离子。

在另一个方面，本发明的特征在于用于治疗或预防受试者中的急性髓样白血病复发的方法，所述方法牵涉对确定为具有FLT3-ITD阳性急性髓样白血病并且已经接受用酪氨酸激酶抑制剂的在先治疗的预选受试者施用有效量的免疫缀合物，其中免疫缀合物含有经由由以下结构式所示的可裂解的二硫化物接头与细胞毒性苯二氮杂二聚体化合物缀合的人源化或嵌合抗体或片段：

其中抗体含有重链可变区，所述重链可变区含有一个或多个互补决定区，所述互补决定区是SEQ ID NO:1-3中的任一个或多个；和/或轻链可变区，所述轻链可变区含有一个或多个互补决定区，所述互补决定区是SEQ ID NO:4-6中的任一个或多个；以及由以下结构式之一所示的所述细胞毒性苯二氮杂二聚体化合物或其药学上可接受的盐：

其中Y是–SO₃M并且M是H或药学上可接受的阳离子。

在另一个方面，本发明的特征在于用于治疗具有多药物抗性急性髓样白血病的受试者的方法，所述方法牵涉对受试者施用有效量的免疫缀合物，其中免疫缀合物含有经由由以下结构式所示的可裂解的二硫化物接头与细胞毒性苯二氮杂二聚体化合物缀合的人源化或嵌合抗体或片段：

其中抗体含有重链可变区，所述重链可变区含有一个或多个互补决定区，所述互补决定区是SEQ ID NO:1-3中的任一个或多个；和/或轻链可变区，所述轻链可变区含有一个或多个互补决定区，所述互补决定区是SEQ ID NO:4-6中的任一个或多个；以及由以下结构式之一所示的所述细胞毒性苯二氮杂二聚体化合物或其药学上可接受的盐：

其中Y是–SO₃M并且M是H或药学上可接受的阳离子，由此治疗所述多药物抗性急性髓样白血病。在一个实施方案中，鉴定受试者为具有多药物抗性白血病。在另一个实施方案中，通过检测受试者的外周血或骨髓样品中的P-糖蛋白表达的存在鉴定受试者为具有多药物抗性白血病。在又一个实施方案中，方法进一步牵涉检测受试者的外周血或骨髓样品中的CD33表达的存在。在又一个实施方案中，每个细胞大于约1,000、3,000或5,000个CD33抗原的水平鉴定所述AML为对用所述免疫缀合物的治疗有响应。

在又一个方面，本发明的特征在于用于治疗或预防受试者中的急性髓样白血病复发的方法，所述方法牵涉对受试者施用有效量的免疫缀合物，其中免疫缀合物含有经由由以下结构式所示的可裂解的二硫化物接头与细胞毒性苯二氮杂二聚体化合物缀合的人源化或嵌合抗体或片段：

其中抗体含有重链可变区，所述重链可变区含有一个或多个互补决定区，所述互补决定区是SEQ ID NO:1-3中的任一个或多个；和/或轻链可变区，所述轻链可变区含有一个或多个互补决定区，所述互补决定区是SEQ ID NO:4-6中的任一个或多个；以及由以下结构式之一所示的所述细胞毒性苯二氮杂二聚体化合物或其药学上可接受的盐：

其中Y是–SO₃M并且M是H或药学上可接受的阳离子，由此治疗所述急性髓样白血病复发。在一个实施方案中，方法预防、降低或消除最小残留疾病。在另一个实施方案中，抗体特异性结合表达CD33的白血病祖细胞和/或白血病干细胞。在另一个实施方案中，方法不损害正常造血干细胞。

在另一个方面，发明的特征在于用于诱导白血病干细胞中的细胞死亡的方法，所述方法牵涉使所述白血病干细胞与有效量的免疫缀合物接触，所述免疫缀合物含有经由由以下结构式所示的可裂解的二硫化物接头与细胞毒性苯二氮杂二聚体化合物缀合的人源化或嵌合抗体或片段：

其中抗体含有重链可变区，所述重链可变区含有一个或多个互补决定区，所述互补决定区是SEQ ID NO:1-3中的任一个或多个；和/或轻链可变区，所述轻链可变区含有一个或多个互补决定区，所述互补决定区是SEQ ID NO:4-6中的任一个或多个；以及由以下结构式之一所示的所述细胞毒性苯二氮杂二聚体化合物或其药学上可接受的盐：

其中Y是–SO₃M并且M是H或药学上可接受的阳离子，由此诱导白血病干细胞中的细胞死亡。在一个实施方案中，方法不诱导正常造血干细胞中的细胞死亡。在另一个实施方案中，接触在体外或在体内。在另一个实施方案中，白血病干细胞在新诊断为患有急性髓样白血病的受试者中，在鉴定为具有与白血病干细胞的生长或增殖相关的复发的受试者中，或者在鉴定为具有难治性急性髓样白血病的受试者中。

在另一个方面，本发明的特征在于用于诱导FLT3-ITD阳性白血病细胞中的细胞死亡的方法，所述方法牵涉使所述白血病干细胞与有效量的免疫缀合物接触，所述免疫缀合物含有经由由以下结构式所示的可裂解的二硫化物接头与细胞毒性苯二氮杂二聚体化合物缀合的人源化或嵌合抗体或片段：

其中抗体含有重链可变区，所述重链可变区含有一个或多个互补决定区，所述互补决定区是SEQ ID NO:1-3中的任一个或多个；和/或轻链可变区，所述轻链可变区含有一个或多个互补决定区，所述互补决定区是SEQ ID NO:4-6中的任一个或多个；以及由以下结构式之一所示的所述细胞毒性苯二氮杂二聚体化合物或其药学上可接受的盐：

其中Y是–SO₃M并且M是H或药学上可接受的阳离子，由此诱导FLT3-ITD阳性白血病细胞中的细胞死亡。在一个实施方案中，方法不诱导正常造血干细胞中的细胞死亡。在另一个实施方案中，接触在体外或在体内。在另一个实施方案中，白血病干细胞在新诊断为患有急性髓样白血病的受试者中，在鉴定为具有与白血病干细胞的生长或增殖相关的复发的受试者中，或者在鉴定为具有难治性急性髓样白血病的受试者中。

在另一个方面，本发明的特征在于试剂盒，所述试剂盒含有抗CD33抗体和含有有效量的免疫缀合物的治疗组合物，所述免疫缀合物含有通过N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基丁酸酯与细胞毒性苯二氮杂二聚体化合物连接的人源化My9-6抗体，其中所述免疫缀合物由以下结构式之一所示或其药学上可接受的盐：

其中r是1至10的整数，Y是-SO₃M，并且对于每次出现，M独立是-H或药学上可接受的阳离子。在一个实施方案中，试剂盒进一步含有关于使用抗CD33抗体检测来自受试者的样品中的CD33表达水平的指导。在另一个实施方案中，进一步含有关于对鉴定为每个细胞具有至少约1,000个抗原的受试者施用所述免疫缀合物的说明。在另一个实施方案中，受试者被鉴定为具有每个细胞至少约3,000或5,000个抗原。

在上述方面的各个实施方案，或本文中叙述的发明的任何其它方面，重链可变区含有与SEQ ID NO:7或9的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，并且轻链可变区含有与SEQ ID NO:8或10的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在上述方面的各个实施方案中，抗体具有至少一个含有分别具有SEQ ID NO:1-3中所示的氨基酸序列的三个连续互补决定区的重链可变区或其片段，和至少一个含有分别具有SEQ ID NO:4-6中所示的氨基酸序列的三个连续互补决定区的轻链可变区或其片段。在上述方面的各个实施方案中，抗体或其片段具有：具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区CDR1；具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区CDR2；具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区CDR3；具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。在上述方面的各个实施方案中，抗体是人源化或嵌合My9-6抗体。在上述方面的各个实施方案中，人源化抗体是CDR移植或表面重塑抗体。在上述方面的各个实施方案中，免疫缀合物含有经由N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基丁酸酯与细胞毒性苯二氮杂二聚体化合物缀合的人源化My9-6抗体，其中所述免疫缀合物由以下结构式之一所示或其药学上可接受的盐：

其中r是1至10的整数，Y是-SO₃M，并且对于每次出现，M独立是-H或药学上可接受的阳离子。

在上述方面的各个实施方案中，检测步骤牵涉测量受试者的外周血或骨髓样品中存在的CD33水平，其中检测每个细胞的约1,000-25,000(例如2,000-20,000；3,000-25,000；3,000-20,000；3,000-18,000；5,000-18,000；5,000-20,000；5,000-25,000)个抗原将受试者预选为可能对免疫缀合物有响应。在上述方面的各个实施方案中，检测到每个细胞约3,000-25,000个抗原将受试者预选为可能对免疫缀合物有响应或检测到每个细胞约5,000-25,000个抗原将受试者预选为可能对免疫缀合物有响应。在上述方面的各个实施方案中，检测步骤牵涉测量受试者的外周血或骨髓样品中存在的CD33水平，其中检测到每个细胞至少约1,000、3,000或5,000个抗原将受试者预选为可能对免疫缀合物有响应。在上述方面的各个实施方案中，受试者被新诊断为患有急性髓样白血病。在上述方面的各个实施方案中，受试者被诊断为患有急性髓样白血病复发或难治性急性髓样白血病。在上述方面的各个实施方案中，来自诊断为患有急性髓样白血病复发或难治性急性髓样白血病的受试者的样品含有每个细胞至少约3,000个抗原。在上述方面的各个实施方案中，免疫缀合物具有约10pM至约2nM的IC₅₀值。在上述方面的各个实施方案中，免疫缀合物具有约11pM至约1.6nM的IC₅₀值。在上述方面的各个实施方案中，方法优先杀死白血病干细胞。

在上述方面的各个实施方案，或本文中叙述的发明的任何其它方面，检测步骤牵涉检测受试者的生物(例如，外周血或骨髓)样品中的FLT3-ITD突变的存在。在上述方面的各个实施方案中，检测步骤牵涉核酸杂交法或核酸测序法。在上述方面的各个实施方案中，检测步骤牵涉下列一种或多种：PCR、逆转录酶PCR或实时PCR。在上述方面的各个实施方案中，所述酪氨酸激酶抑制剂是FLT3酪氨酸激酶抑制剂。在上述方面的各个实施方案中，具有FLT3-ITD阳性急性髓样白血病的受试者被诊断为患有急性髓样白血病复发，并且尚未接受用酪氨酸激酶抑制剂(例如FLT3酪氨酸激酶抑制剂)的在先治疗。在上述方面的各个实施方案中，具有FLT3-ITD阳性急性髓样白血病的受试者在接受用酪氨酸激酶抑制剂(例如，FLT3酪氨酸激酶抑制剂)的在先治疗后被诊断为患有急性髓样白血病复发。在上述方面的各个实施方案中，具有FLT3-ITD阳性急性髓样白血病的受试者被诊断为患有难治性急性髓样白血病，并且尚未接受用酪氨酸激酶抑制剂(例如，FLT3酪氨酸激酶抑制剂)的在先治疗。在上述方面的各个实施方案中，具有FLT3-ITD阳性急性髓样白血病的受试者在接受用酪氨酸激酶抑制剂(例如，FLT3酪氨酸激酶抑制剂)的在先治疗后被诊断为患有难治性急性髓样白血病。

在任何上述方面的某些实施方案中，包含本文中描述的缀合物的组合物可以包含每个抗体分子平均1-10个细胞毒性苯二氮杂二聚体分子。每个抗体分子的细胞毒性苯二氮杂二聚体分子的平均比率在本文中称为药物抗体比率(DAR)。在一个实施方案中，DAR是2-8、3-7、3-5或2.5-3.5。

根据详细描述和权利要求书，本发明的其它特征和优点将是显而易见的。

定义

除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的意义。以下参考文献给技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义：Singleton等人,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(第2版1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker编,1988)；The Glossary of Genetics,第5版,R.Rieger等人(编),Springer Verlag(1991)；和Hale &Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。如本文中使用，以下术语具有下文归于它们的意义，除非另有规定。

“P-糖蛋白”意指与在NCBI登录号NP_001035830提供的人序列具有至少约85％氨基酸序列同一性并且对表达它的细胞赋予多药物抗性的多肽或其片段。下文提供了示例性的P-糖蛋白的序列：

“P-糖蛋白多核苷酸”意指编码P-糖蛋白的核酸分子。

“CD33蛋白”意指与在NCBI登录号CAD36509提供的人序列具有至少约85％氨基酸序列同一性并且具有抗CD33抗体结合活性的多肽或其片段。下文提供了示例性的人CD33氨基酸序列：

“CD33多核苷酸”意指编码CD33蛋白的核酸分子。

“FLT3蛋白”、“FLT3多肽”、“FLT3”、“FLT-3受体”或“FLT-3R”意指与在NCBI登录号NP_004110提供的FLT3酪氨酸激酶受体(又称为FLK-2和STK-1)的人序列具有至少约85％、90％、95％、99％或100％氨基酸序列同一性并且具有酪氨酸激酶活性(包括受体酪氨酸激酶活性)的多肽或其片段。在一个实施方案中，FLT3氨基酸序列是下文提供的人FLT3氨基酸序列：

“FLT3-ITD”意指具有内部串联重复，包括但不限于简单串联重复和/或具有插入的串联重复的FLT3多肽。在多个实施方案中，具有内部串联重复的FLT3多肽是灭活的FLT3变体(例如，组成性自身磷酸化)。在一些实施方案中，FLT3-ITD包含在任何外显子或内含子，包括例如外显子11、外显子11至内含子11和外显子12、外显子14、外显子14至内含子14和外显子15中的串联重复和/或具有插入的串联重复。内部串联重复突变(FLT3-ITD)是最常见的FLT3突变，存在于约20-25％的AML病例中。具有FLT3-ITD AML的患者比经由野生型(WT)FLT3的患者具有更差的预后，伴有升高的复发率和更短的对化学疗法的响应持续时间。

“FLT3多肽”意指编码FLT3蛋白的核酸分子。

“白血病干细胞”意指能够自身更新、能够启动白血病和/或能够触发受试者中的急性髓样白血病复发的白血病细胞。

“多药物抗性细胞”意指相对于对照细胞的响应，具有降低对一种或多种药剂的响应的细胞。特别地，预测表达P-糖蛋白的细胞比对照细胞具有更小的对用化学治疗剂的治疗的响应。

“改善”意指降低、抑制、减弱、减少、阻滞或稳定疾病的形成或进展。

“类似物”意指不相同但是具有类似的功能或结构特征的分子。例如，多肽类似物保留相应的天然存在的多肽的生物学活性，同时具有相对于天然存在的多肽增强类似物的功能的某些生物化学修饰。此类生物化学修饰可以提高类似物的蛋白酶抗性、膜通透性或半衰期，而不改变例如配体结合。类似物可以包括非天然的氨基酸。

在本公开中，“包含”、“含有”和“具有”等可以具有美国专利法归于它们的意义，并且可以意指“包括”等；同样地，“基本上由…组成”具有美国专利法归于的意义，并且该术语是开放式的，允许不仅存在叙述项，只要叙述项的基本或新颖特征不因不仅存在叙述项而变化，但是排除现有技术实施方案。

“检测”指鉴定要检测的分析物的存在、不存在或量。

“疾病”意指损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的任何疾患或病症。疾病的实例是急性髓样白血病、脊髓发育不良综合征(MDS)、急性早幼粒细胞性白血病(APL)、慢性髓样白血病(CML)。

“有效量”意指相对于未治疗的患者改善疾病症状需要的化合物或药剂的量。用于实施本发明以治疗性处理疾病的活性化合物的有效量随施用方式、受试者的年龄、体重和一般健康而变化。最后，主治内科医生会决定合适的量和剂量方案。此类量称为“有效”量。

术语“分离的”、“纯化的”或“生物学纯的”指在不同程度上不含如其天然状态中找到的通常伴随它的组分的材料。“分离”意指与初始来源或环境分开的程度。“纯化”意指高于分离的分开程度。“纯化的”或“生物学纯的”蛋白质充分不含其它材料，使得任何杂质实质上不影响蛋白质的生物学特性或者引起其它不利后果。也就是说，如果本发明的核酸或肽在通过重组DNA技术制备时基本上不含细胞材料、病毒材料或培养基，或者在通过化学合成时基本上不含化学前体或其它化学品，那么它是纯化的。通常使用分析化学技术，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相层析测定纯度和同质性。术语“纯化的”可以意指核酸或蛋白质在电泳凝胶中产生基本上一条带。对于可以进行修饰，例如磷酸化或糖基化的蛋白质，不同修饰可以产生不同分离的蛋白质，其可以分开纯化。

“分离的多核苷酸”意指不含基因的核酸分子(例如，DNA)，其在衍生本发明的核酸分子的生物体的天然存在的基因组中在基因侧翼。因此，该术语包括例如掺入载体中；掺入自主复制质粒或病毒中；或掺入原核生物或真核生物的基因组DNA中；或以不依赖于其它序列的分开分子(例如，通过PCR或限制性内切核酸酶消化制备的cDNA或基因组或cDNA片段)存在的重组DNA。另外，该术语包括从DNA分子转录的RNA分子，以及作为编码另外的多肽序列的杂合基因的一部分的重组DNA。

“分离的多肽”意指已经与天然伴随它的组分分开的本发明的多肽。通常，当多肽是至少60重量％不含与它天然联合的蛋白质和天然存在的有机分子时，它是分离的。优选地，制备物是至少75％，更优选至少90％，且最优选至少99重量％本发明的多肽。例如，可以通过从天然来源提取，通过编码此类多肽的重组核酸的表达；或通过化学合成蛋白质获得本发明的分离的多肽。可以通过任何合适的方法，例如柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳，或者通过HPLC分析测量纯度。

“参照”抑制标准或对照条件或样品。

“参照序列”是用作序列比较的基础的限定序列。参照序列可以是规定序列的子集或整体；例如全长cDNA或基因序列的区段，或完整的cDNA或基因序列。对于多肽，参照多肽序列的长度一般会是至少约16个氨基酸，优选至少约20个氨基酸，更优选至少约25个氨基酸，并且甚至更优选约35个氨基酸，约50个氨基酸，或约100个氨基酸。对于核酸，参照核酸序列的长度一般会是至少约50个核苷酸，优选至少约60个核苷酸，更优选至少约75个核苷酸，并且甚至更优选约100个核苷酸或约300个核苷酸或其上下或其间的任何整数。

“特异性结合”意指识别并结合感兴趣的多肽，但是基本上不识别并结合天然包含本发明的多肽的样品，例如生物样品中的其它分子的抗体或其片段。

可用于本发明的方法的核酸分子包括编码本发明的多肽或其片段的任何核酸分子。此类核酸分子不需要与内源核酸序列是100％相同的，而是通常会展现出实质性同一性。与内源序列具有“实质性同一性”的多核苷酸通常能够与双链核酸分子的至少一条链杂交。可用于本发明的方法的核酸分子包括编码本发明的多肽或其片段的任何核酸分子。此类核酸分子不需要与内源核酸序列是100％相同的，而是通常会展现出实质性同一性。与内源序列具有“实质性同一性”的多核苷酸通常能够与双链核酸分子的至少一条链杂交。“杂交”指在各种严格性条件下配对以形成互补多核苷酸序列(例如本文中描述的基因)或其部分间的双链分子。(参见例如，Wahl,G.M.和S.L.Berger(1987)Methods Enzymol.152:399；Kimmel,A.R.(1987)Methods Enzymol.152:507)。

例如，严格的盐浓度通常会是小于约750mM NaCl和75mM柠檬酸三钠，优选小于约500mM NaCl和50mM柠檬酸三钠，并且更优选小于约250mM NaCl和25mM柠檬酸三钠。可以在不存在有机溶剂，例如甲酰胺的情况下获得低严格性杂交，而可以在存在至少约35％甲酰胺，并且更优选至少约50％甲酰胺的情况下获得高严格性杂交。严格温度条件通常会包括至少约30℃，更优选至少约37℃，并且最优选至少约42℃的温度。改变另外的参数，如杂交时间、去污剂，例如十二烷硫酸钠(SDS)的浓度和载体DNA的纳入或排除是本领域技术人员公知的。根据需要，通过组合这些各种条件实现各种严格性水平。在优选的实施方案中，在30℃在750mM NaCl、75mM柠檬酸三钠和1％SDS中将发生杂交。在更优选的实施方案中，在37℃在500mM NaCl、50mM柠檬酸三钠、1％SDS、35％甲酰胺和100μg/ml变性的鲑鱼精DNA(ssDNA)中将发生杂交。在最优选的实施方案中，在42℃在250mM NaCl、25mM柠檬酸三钠、1％SDS、50％甲酰胺和200μg/ml ssDNA中将发生杂交。这些条件的有用的变化对于本领域技术人员将是非常显而易见的。

对于大多数应用，杂交后的洗涤步骤也将在严格性上变化。洗涤严格性条件可以以盐浓度和温度限定。如上文，可以通过降低盐浓度或者通过提高温度提高洗涤严格性。例如，用于洗涤步骤的严格的盐浓度优选将是小于约30mM NaCl和3mM柠檬酸三钠，并且最优选小于约15mM NaCl和1.5mM柠檬酸三钠。用于洗涤步骤的严格温度条件一般将包括至少约25℃，更优选至少约42℃，并且甚至更优选至少约68℃的温度。在优选的实施方案中，在25℃在30mM NaCl、3mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中将发生洗涤步骤。在更优选的实施方案中，在42℃在15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中将发生洗涤步骤。在更优选的实施方案中，在68℃在15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中将发生洗涤步骤。这些条件的另外的变化对于本领域技术人员将是非常显而易见的。杂交技术是本领域技术人员公知的，并且记载于例如Benton和Davis(Science 196:180,1977)；Grunstein和Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 72:3961,1975)；Ausubel等人(Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Interscience,New York,2001)；Berger和Kimmel(Guide to Molecular Cloning Techniques,1987,Academic Press,New York)；和Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York。

“基本上相同”意指与参照氨基酸序列(例如本文中描述的任一种氨基酸序列)或核酸序列(例如，本文中描述的任一种核酸序列)展现至少50％同一性的多肽或核酸分子。优选地，此类序列与用于比较的序列在氨基酸水平或核酸上是至少60％，更优选80％或85％，并且更优选90％、95％或甚至99％相同。

通常使用序列分析软件(例如，Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group,University of Wisconsin Biotechnology Center,1710University Avenue,Madison,Wis.53705，BLAST，BESTFIT，GAP或PILEUP/PRETTYBOX程序)测量序列同一性。此类软件通过将同源性程度分配给各个取代、缺失和/或其它修饰匹配相同或相似的序列。保守取代通常包括以下组内的取代：甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。在测定同一性程度的示例性的方法中，可以使用BLAST程序，在e^-3和e^-100之间的概率得分指示紧密相关的序列。

“受试者”意指哺乳动物，包括但不限于人或非人哺乳动物，如牛、马、犬、绵羊或猫。

本文中提供的范围理解为该范围内的所有数值的速记。例如，1至50的范围理解为包括来自下组的任何数目、数目的组合或亚范围：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。

如本文中使用，术语“治疗/处理”等指降低或改善病症和/或与其相关的症状。应当理解，虽然未排除，但是治疗病症或疾患不需要完全消除病症、疾患或与其相关的症状。

如本文中使用，术语“预防”、“预防性治疗”等指降低受试者中形成病症或疾患的概率，所述受试者没有病症或疾患，但是有风险或易于形成病症或疾患。

除非明确叙述或根据上下文明显的，如本文中使用，术语“或”理解为包括在内的。除非明确叙述或根据上下文明显的，如本文中使用，术语“一个/种”和“所述/该”理解为单数或复数。

除非明确叙述或根据上下文明显的，如本文中使用，术语“约”理解为在本领域中的正常容差的范围内，例如在平均值的2个标准差内。约可以理解为在叙述数值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。除非另外根据上下文清楚，本文中提供的所有数值以术语约修饰。

本文中的变量的任何定义中的一批化学基团的叙述包括定义所述变量为所列基团的任何单一基团或组合。本文中的变量或方面的实施方案的叙述包括作为任何单一实施方案或与任何其它实施方案或其部分组合的该实施方案。

本文中提供的任何组合物或方法可以与本文中提供了一种或多种任何其它组合物和方法组合。

附图简述

图1是显示患者急性髓样白血病(AML)样品(n＝56)中的CD33水平的图。

图2是散点图，其显示了与针对患者急性髓样白血病(AML)细胞的CD33靶向性美登素生物碱(maytansinoid)抗体药物缀合物相比IMGN779的体外IC₅₀值和对CD33表达水平的依赖性的比较。

图3提供了两幅图，其显示了Log IC₅₀的统计学显著(p<0.0001)分布，其中每个细胞的CD33抗原小于5000(底部)对比大于5000(顶部)。

图4A是显示IMGN779对白血病干细胞和正常造血干细胞的影响的图。

图4B是显示IMGN779不损害正常造血干细胞的图。

图5A是显示P-糖蛋白(PGP)活性作为原代患者AML细胞中的CD33表达的函数的点图。

图5B是显示IMGN779细胞毒性作为原代患者AML细胞中的PGP活性的函数的点图。

图6是显示AML细胞系对IMGN779和DGN462高度敏感的表。

图7A是显示针对EOL-1急性髓样白血病(AML)的IMGN779在单次静脉内注射IMGN779后在SCID小鼠中的皮下异种移植物中的抗肿瘤活性的图。

图7B是显示针对HL60/QC前髓细胞性白血病(PML)的IMGN779在单次静脉内注射IMGN779后在SCID小鼠中的皮下异种移植物中的抗肿瘤活性的图。

图7C是显示IMGN779或非靶向性抗体药物缀合物对EOL-1和HL60/QC细胞的人AML异种移植物的影响的表。“治疗(T)/对照(C)(％)”指肿瘤生长抑制比率。“CR”指完全响应。

图8是显示以14mg/kg和40mg/kg IMGN779处理的小鼠中随时间的平均体重变化的百分比的图。

图9A是随时间显示总抗体和抗体缀合物的血浆浓度的图。

图9B是显示如通过ELISA测量的完整IMGN779的血浆浓度和如通过细胞毒性测定法测定的IMGN779的生物学活性浓度的图。

图9C是显示IMGN779的体内稳定性和药动学的表。

图10A提供了人源化My9-6轻链的氨基酸序列

图10B提供了人源化My9-6重链的氨基酸序列。

图11是显示患者AML样品中的IMGN779细胞毒性的体外IC₅₀值和CD33ABC(抗体结合能力)的图。

图12是显示FLT3WT和FLT3-ITD(内部串联重复)患者AML样品中的IMGN779细胞毒性的体外IC₅₀值的图。

图13是显示FLT3WT和FLT3-ITD患者AML样品中的体外CD33ABC的图。

图14是显示IMGN779具有针对FLT3-ITD AML细胞系的高体外细胞毒性活性的表。

图15是显示IMGN779和FLT3激酶抑制剂在具有FLT3-ITD突变的MOLM-13AML细胞系中的体外细胞毒性的图。

图16是显示在最小有效剂量10μg/kg(DGN462剂量)时IMGN779针对MV4-11FLT3-ITD AML异种移植物的有力的抗原靶向性抗肿瘤活性的图。T/C(％)＝肿瘤生长抑制；PR＝部分肿瘤消退；CR＝完全肿瘤消退。

图17提供了质谱术分析，其显示了每个抗体缀合有约3个DGN462分子(药物与抗体比率(DAR))。

序列简述

鼠重链CDR1：SYYIH(SEQ ID NO：1)；

鼠重链CDR2：VIYPGNDDISYNQKFXG(SEQ ID NO：2)，其中X是K或Q；

鼠重链CDR3：EVRLRYFDV(SEQ ID NO：3)；

鼠轻链CDR1：KSSQSVFFSSSQKNYLA(SEQ ID NO：4)；

鼠轻链CDR2：WASTRES(SEQ ID NO：5)；

鼠轻链CDR3：HQYLSSRT(SEQ ID NO：6)；

鼠重链可变区：

QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFKGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSFDSAVYYCAREVRLRYFDVWGAGTTVTVSS(SEQ ID NO：7)；

鼠轻链可变区：

NIMLTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQSEDLAIYYCHQYLSSRTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO：8)；

人源化重链可变区：

QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARFVRLRYFDVWGQGTTVTVSS(SFQ ID NO：9)；

人源化轻链可变区：

EIVLTQSPGSLSVSPGERVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPRLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYCHQYLSSRTFGQGTKLEIKR(SEQ ID NO：10)。

在具体的实施方案中，人源化抗体包括表面重塑和/或CDR移植抗体。

发明详述

本发明的特征在于用于表征AML和选择有效的疗法的组合物和方法，及用于治疗新诊断为AML的患者、经历AML复发的患者和具有难治性AML的患者的方法。

本发明至少部分基于如下的发现：利用新颖的DNA烷化剂DGN462的CD33靶向性抗体-药物缀合物(ADC)在体外针对原代患者AML细胞和在体内针对小鼠中的AML异种移植物高度有活性。

尽管对化学疗法的约80％的高初始响应率，许多急性髓样白血病(AML)患者经历疾病的复发。不意图被理论束缚，认为这些复发是由于持续性白血病干细胞的生长。如下文报道，本发明的特征在于高度有力的DNA烷化剂DGN462，其包含含有单亚胺部分的吲哚啉-苯二氮杂二聚体(indolino-benzodiazepine dimer)。

IMGN779是一种CD33靶向性抗体药物缀合物，其包含经由可裂解的二硫化物接头与新颖的DNA烷化剂DGN462缀合的抗huCD33抗体，又称为huMy9-6或Z4681A。它的有利的临床前可耐受性概貌提示了IMGN779赋予相对于表明活性但具有重大毒性的针对AML的现有临床剂的治疗优点。IMGN779在体外针对AML细胞系和原代患者AML细胞的高度有力的CD33靶向性活性，针对小鼠中的AML异种移植物观察到的抗肿瘤活性和有利的安全性概貌支持其作为用于AML的治疗推进。

鼠和人源化My9-6抗体

鼠My9-6

鼠抗CD33抗体，在本文中各称为“My9-6”、“鼠My9-6”和“muMy9-6”，就轻链和重链可变区两者的种系氨基酸序列、轻链和重链可变区两者的氨基酸序列、CDR的鉴定、表面氨基酸的鉴定和其以重组形式表达的手段而言得到完全表征。参见例如美国专利No.7,557,189；7,342,110；8,119,787；8,337,855和美国专利公开文本No.20120244171，每篇通过引用的方式整体并入本文。

My9-6抗体也已经在功能上得到表征，并且显示了它以高亲和力结合CD33阳性细胞表面上的CD33。

术语“可变区”在本文中用于描述抗体间在序列上不同并且在每种特定的抗体对其抗原的结合和特异性中协作的抗体重链和轻链的某些部分。可变性通常不贯穿抗体可变区均匀分布。它通常聚集于轻链和重链可变区两者中的称作互补决定区(CDR)或超变区的可变区的三个区段内。可变区的更高度保守的部分称作框架区。重链和轻链的可变区包含4个框架区，主要采用β-片层构型，每个框架区通过3个CDR连接，所述CDR形成连接β-片层结构，并且在一些情况中形成β-片层结构的部分的环。每条链中的CDR通过框架区保持得极其接近，并且与来自另一条链的CDR一起促成抗体的抗原结合位点的形成(E.A.Kabat等人Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,1991,NIH)。

“恒定”区不直接参与抗体对抗原的结合，但是展现出各种效应子功能，如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。

人源化My9-6抗体

还已经制备My9-6的人源化形式，在本文中各称为“huMy9-6”，和“人源化My9-6”。

人源化的目的是降低对引入人的异种抗体，如鼠抗体的免疫原性，同时维持抗体的完全抗原结合亲和力和特异性。

可以使用几种技术，如表面重塑和CDR移植制备人源化抗体。如本文中使用，表面重塑技术使用分子建模、统计学分析和诱变的组合改变抗体可变区的非CDR表面以类似靶宿主的已知抗体的表面。

用于抗体的表面重塑的策略和方法，和用于降低抗体在不同宿主内的免疫原性的其它方法公开于美国专利No.5,639,641(Pedersen等人)，其据此通过引用的方式整体并入。简言之，在优选的方法中，(1)产生抗体重链和轻链可变区的合并物的位置比对以给出重链和轻链可变区框架表面暴露的位置的集合，其中所有可变区的比对位置是至少约98％相同的；(2)对啮齿类抗体(或其片段)限定重链和轻链可变区框架表面暴露的氨基酸残基的集合；(3)鉴定与啮齿类表面暴露的氨基酸残基的集合最紧密相同的重链和轻链可变区框架表面暴露的氨基酸残基的集合；(4)用步骤(3)中鉴定的重链和轻链可变区框架表面暴露的氨基酸残基的集合取代步骤(2)中限定的重链和轻链可变区框架表面暴露的氨基酸残基的集合，除了啮齿类抗体的互补决定区的任何残基的任何原子的5埃内的那些氨基酸残基外；并且(5)制备具有结合特异性的人源化啮齿类抗体。

可以使用多种其它技术使抗体人源化，包括CDR移植(EP 0 239 400；WO 91/09967；美国专利No.5,530,101；和5,585,089)，镶面或表面重塑(EP 0 592 106；EP 0 519 596；Padlan E.A.,1991,Molecular Immunology 28(4/5):489-498；Studnicka G.M.等人,1994,Protein Engineering 7(6):805-814；Roguska M.A.等人,1994,PNAS 91:969-973)，和链改组(美国专利No.5,565,332)。可以通过本领域中已知的多种方法(包括噬菌体展示方法)制备人抗体。还可参见美国专利No.4,444,887、4,716,111、5,545,806和5,814,318；和国际专利申请公开号WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741(所述参考文献通过引用的方式整体并入)。

如本文中进一步描述，通过建模鉴定My9-6的CDR，并且预测其分子结构。然后，制备人源化My9-6抗体，并且已经完全表征，如记载于例如美国专利公开No.20050118183，其通过引用的方式并入本文。图5A和5B中显示了许多huMy9-6抗体的轻链和重链的氨基酸序列。参见例如美国专利No.8,337,855和美国专利公开No.20120244171，每篇通过引用的方式并入本文。

My9-6抗体的表位结合片段

虽然鼠My9-6抗体和人源化My9-6抗体的表位结合片段在本文中与鼠My9-6抗体及其人源化形式分开讨论，但是应当理解本发明的一种或多种“抗体”可以包括全长muMy9-6和huMy9-6抗体及这些抗体的表位结合片段。

在又一个实施方案中，提供了抗体或其表位结合片段，其包含至少一个具有选自下组的氨基酸序列的互补决定区：SEQ ID NO:1-6：SYYIH(SEQ ID NO:1)，VIYPGNDDISYNQKFXG(SEQ ID NO:2)，其中X是K或Q，EVRLRYFDV(SEQ ID NO:3)，KSSQSVFF SSSQKNYLA(SEQ ID NO:4)，WASTRES(SEQ ID NO:5)，HQYL SSRT(SEQ ID NO:6)，并且具有结合CD33的能力。

在又一个实施方案中，提供了抗体或其表位结合片段，其包含至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区，其中所述重链可变区包含三个互补决定区，所述互补决定区具有分别SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列，SYYIH(SEQ ID NO:1)，VIYPGNDDISYNQKFXG(SEQ ID NO:2)，其中X是K或Q，EVRLRYFDV(SEQ ID NO:3)，并且其中所述轻链可变区包含三个互补决定区，所述互补决定区具有分别SEQ ID NO:4-6所示的氨基酸序列，KSSQSVFFSSSQKNYLA(SEQ ID NO:4)，WASTRES(SEQ ID NO:5)，HQYLSSRT(SEQ ID NO:6)。

在又一个实施方案中，提供了具有重链可变区的抗体，所述重链可变区具有与SEQ ID NO:7：QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFKGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGAGTTVTVSS所示的氨基酸序列共享至少90％序列同一性，更优选与SEQ ID NO:7具有95％序列同一性，最优选与SEQ ID NO:7具有100％序列同一性的氨基酸序列。

类似地，提供了具有轻链可变区的抗体，所述轻链可变区具有与SEQ ID NO:8：NIMLTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQSEDLAIYYCHQYLSSRTFGGGTKLEIKR所示的氨基酸序列共享至少90％序列同一性，更优选与SEQ ID NO:8具有95％序列同一性，最优选与SEQ ID NO:8具有100％序列同一性的氨基酸序列。

在又一个实施方案中，提供了具有人源化(例如，表面重塑的，CDR移植的)重链可变区的抗体，所述人源化重链可变区与SEQ ID NO:9：QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYY CAREVRLRYFDVWGQGTTVTVSS所示的氨基酸序列共享至少90％序列同一性，更优选与SEQ ID NO:9具有95％序列同一性，最优选与SEQ ID NO:9具有100％序列同一性的氨基酸序列。

类似地，提供了具有人源化(例如，表面重塑的，CDR移植的)轻链可变区的抗体，所述人源化轻链可变区与对应于SEQ ID NO:10：EIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPRLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYCHQYLS SRTFGQGTKLEIKR的氨基酸序列共享至少90％序列同一性，更优选与SEQ ID NO:10具有95％序列同一性，最优选与SEQ ID NO:10具有100％序列同一性的氨基酸序列。在具体的实施方案中，抗体包括CDR外部的框架区中的保守突变。

如本文中使用，“抗体片段”包括抗体中保持结合CD33的能力的任何部分，一般称作“表位结合片段”。优选地，抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'和F(ab')₂、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫化物连接的Fv(sdFv)和包含V_L或V_H结构域的片段。表位结合片段(包括单链抗体)可以包含单独的或与下列各项的整体或部分组合的可变区：铰链区、C_H1、C_H2和C_H3域。

此类片段可以含有Fab片段或F(ab')₂片段之一或两者。优选地，抗体片段含有全抗体的所有6个CDR，尽管含有少于全部的此类区的片段，如3、4或5个CDR也是功能性的。此外，功能性等同物也可以是或可以组合下列免疫球蛋白类别及其亚类的任一项的成员：IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。

可以通过使用酶，如木瓜蛋白酶(Fab片段)或胃蛋白酶(F(ab')₂片段)的蛋白水解裂解制备Fab和F(ab')₂片段。

单链FV(scFv)片段是表位结合片段，其含有与抗体轻链可变区(V_L)的至少一个片段连接的抗体重链可变区(V_H)的至少一个片段。接头可以是短的、柔性肽，其经选择以确保一旦连接它们，发生(V_L)和(V_H)区的正确三维折叠，从而维持衍生单链抗体片段的全抗体的靶分子结合特异性。可以通过接头将(V_L)或(V_H)序列的羧基端与互补(V_L)和(V_H)序列的氨基酸端共价连接。可以通过分子克隆，抗体噬菌体展示文库或熟练技术人员公知的类似的技术产生单链抗体片段。例如，可以在真核细胞或原核细胞(包括细菌)中制备这些蛋白质。

也可以使用本领域中已知的各种噬菌体展示方法产生本发明的表位结合片段。在噬菌体展示方法中，功能性抗体域在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面上展示。具体地，可以利用此类噬菌体展示从全集或组合抗体文库(例如人或鼠)表达的表位结合结构域。可以用抗原，例如使用经标记的CD33或结合或捕获到固体表面或珠的CD33选择或鉴定表达结合感兴趣的抗原的表位结合域的噬菌体。这些方法中使用的噬菌体通常是包括从噬菌体表达的fd和M13结合结构域的丝状噬菌体，所述噬菌体具有与噬菌体基因III或基因VIII蛋白重组融合的Fab、Fv或二硫化物稳定的Fv抗体结构域。

可以用于制备本发明的表位结合片段的噬菌体展示方法的实例包括公开于以下的那些：Brinkman等人,1995,J.Immunol.Methods 182:41-50；Ames等人,1995,J.Immunol.Methods 184:177-186；Kettleborough等人,1994,Eur.J.Immunol.24:952-958；Persic等人,1997,Gene 187:9-18；Burton等人,1994,Advances in Immunology 57:191-280；PCT申请No.PCT/GB91/01134；PCT公开文本WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；和美国专利No.5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108；每篇通过引用的方式整体并入本文。

在噬菌体选择后，可以分离编码片段的噬菌体的区域，并且用于经由在所选宿主，包括哺乳动物、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌中，使用重组DNA技术，例如如下文详细描述产生表位结合片段。例如，也可以使用本领域中已知的方法，如那些在以下中公开的方法，采用重组制备Fab、Fab'和F(ab')₂片段的技术：PCT公开文本WO 92/22324；Mullinax等人,1992,BioTechniques 12(6):864-869；Sawai等人,1995,AJRI34:26-34；和Better等人,1988,Science 240:1041-1043；所述参考文献通过引用的方式整体并入。可以用于制备单链Fv和抗体的技术的实例包括那些记载于美国专利No.4,946,778和5,258,498；Huston等人,1991,Methods in Enzymology 203:46-88；Shu等人,1993,PNAS 90:7995-7999；Skerra等人,1988,Science 240:1038-1040中的技术。

功能性等同物

本发明的范围内还包括My9-6抗体和人源化My9-6抗体的功能性等同物。术语“功能性等同物”包括具有同源序列的抗体、嵌合抗体、经修饰的抗体和人工抗体，例如，其中每种功能性等同物以其结合CD33的能力限定。熟练技术人员应当理解，称作“抗体片段”的分子组和称作“功能性等同物”的组中有重叠。

具有同源序列的抗体是具有与本发明的鼠My9-6和人源化My9-6抗体的氨基酸序列具有序列同一性或同源性的氨基酸序列的那些抗体。优选地，与本发明的鼠My9-6和人源化My9-6抗体的可变区的氨基酸序列有同一性。“序列同一性”和“序列同源性”如本文中应用于氨基酸序列时定义为与另一种氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％或94％序列同一性，并且更优选至少约95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，如例如通过根据Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,2444-2448(1988)的FASTA搜索方法测定。

如本文中使用，嵌合抗体是抗体的不同部分从不同动物物种衍生的抗体。例如，具有与人免疫球蛋白恒定区配对的从鼠单克隆抗体衍生的可变区的抗体。用于制备嵌合抗体的方法是本领域中已知的。参见例如Morrison,1985,Science 229:1202；Oi等人,1986,BioTechniques 4:214；Gillies等人,1989,J.Immunol.Methods 125:191-202；美国专利No.5,807,715；4,816,567；和4,816,397，它们通过引用的方式整体并入本文。

改善的抗体

CDR对于表位识别和抗体结合非常重要。然而，可以在不干扰抗体识别并结合其关联表位的能力的情况下对构成CDR的残基进行变化。例如，可以进行不影响表位识别，但提高抗体对表位的结合亲和力的变化。

因此，本发明的范围中还包括鼠和人源化抗体两者的改善形式，它们也特异性识别并结合CD33，优选以升高的亲和力。

几项研究已经基于一级抗体序列的知识和其特性，如结合和表达水平调查在抗体序列中的各个位置处引入一个或多个氨基酸变化的效果(Yang,W.P.等人,1995,J.Mol.Biol.,254,392-403；Rader,C.等人,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95,8910-8915；Vaughan,T.J.等人,1998,Nature Biotechnology,16,535-539)。

在这些研究中，已经通过使用诸如寡核苷酸介导的定点诱变，盒式诱变、易错PCR，DNA改组或大肠杆菌的增变株等方法改变CDR1、CDR2、CDR3或框架区中的重链和轻链基因的序列产生一级抗体的等同物(Vaughan,T.J.等人,1998,Nature Biotechnology,16,535-539；Adey,N.B.等人,1996,第16章,第277-291页,于"Phage Display of Peptides and Proteins",Kay,B.K.等人编,Academic Press)。改变一级抗体的序列的这些方法已经导致二级抗体的改善的亲和力(Gram,H.等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,3576-3580；Boder,E.T.等人,2000,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97,10701-10705；Davies,J.和Riechmann,L.,1996,Immunotechnolgy,2,169-179；Thompson,J.等人,1996,J.Mol.Biol.,256,77-88；Short,M.K.等人,2002,J.Biol.Chem.,277,16365-16370；Furukawa,K.等人,2001,J.Biol.Chem.,276,27622-27628)。

通过改变抗体的一个或多个氨基酸残基的类似的定向策略，本文(图10A，10B)中描述的抗体序列可以用于开发具有改善的功能的抗CD33抗体，包括改善的对CD33的亲和力。

改善的抗体还包括那些具有改善的特征的抗体，其通过动物免疫、杂交瘤形成和选择具有特定特征的抗体的标准技术制备。

患者分层

huMy9-6抗体(又称作“Z4681A”)可用于表征例如在活组织检查期间源自受试者的细胞上的CD33表达。我们已经发现了受试者的细胞上的CD33表达水平指示IMGN779的效力，并且因此可用于患者分层。此发现至少部分基于患者数据，其显示每个细胞表达少到1,000个CD33抗原的原代患者细胞对IMGN779高度敏感(60％的细胞是敏感的)。对于具有CD33水平>3,000的样品，超过75％对IMGN779高度敏感。对于具有高于5,000的CD33水平的样品，大于90％的细胞对IMGN779高度敏感。因而，具有每个细胞具有至少约1,000-25,000个CD33抗原(ABC，即抗体结合能力)(例如，1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、3,500、4,000、4,500、5,000、5,500、10,000、15,000、20,000、25,000ABC)的患者对用IMGN779治疗敏感。

在具体的实施方案中，根据本发明的方法选择和治疗具有在1,000-18,000，1,000-20,000，或1,000-25,000的范围中；或在3,000-18,000，3,000-20,000，或3,000-25,000的范围中；或在5,000-18,000，5,000-20,000，或5,000-25,000的范围中的ABC的患者。在具体的实施方案中，当将患者被鉴定为每个细胞具有至少约1,000、2,000、3,000、4,000、4,500、5,000或更多个抗原时，选择他们用于用IMGN779治疗。在其它实施方案中，根据本发明的方法选择和治疗患者，其中ABC的下限是约1,000-5,000，约2,000-4,000，或约2,500-3,000，并且范围的上限是约18,000-25,000，18,000-20,000，或20,000-25,000。IMGN779和另一种ADC的IC₅₀值的比较甚至在每个细胞的抗原数目超过5,000的情况下高10,000倍，所述另一种ADC包含相同的抗CD33抗体，但是包含不同接头和细胞毒素。

在又一些实施方案中，当将新诊断的患者被鉴定为每个细胞具有至少约5,000、6,000或7,000个抗原或更多时选择它们用于治疗。当将复发性AML患者被鉴定为每个细胞具有至少约1,000、2,000、2,500、3,000、3,500、4,000、4,500、5,000个抗原或更多时，选择他们用于IMGN779治疗。当将具有难治性疾病的AML患者被鉴定为每个细胞具有至少约1,000、2,000、2,500、3,000、3,500、4,000、4,500、5,000抗原或更多时，选择他们用于IMGN779治疗。在具体的实施方案中，根据本发明的方法选择和治疗具有在1,000-18,000，1,000-20,000，或1,000-25,000的范围中；或在3,000-18,000，3,000-20,000，或3,000-25,000的范围中；或在5,000-18,000，5,000-20,000，或5,000-25,000的范围中的ABC的复发性或难治性AML患者。在具体的实施方案中，在将复发性或难治性AML患者被鉴定为每个细胞具有至少约1,000、2,000、3,000、4,000、4,500、5,000或更多个抗原的情况下选择他们用于用IMGN779治疗。在其它实施方案中，根据本发明的方法选择和治疗复发性或难治性AML患者，其中ABC范围的下限是约1,000-5,000，约2,000-4,000，或约2,500-3,000，并且范围的上限是约18,000-25,000，18,000-20,000，或20,000-25,000。

因此，完全预料不到的是，IMGN779在此类低CD33值和在此类低浓度时将是有效的。使用校正的流式细胞术方法测量原代患者AML细胞上的CD33表达。用缀合有藻红蛋白(PE)的抗CD33抗体(克隆WM53,BD Biosciences)染色AML样品，并且使用Quantibrite珠(在不同标记物与珠比率的缀合有PE的珠)与校准曲线的荧光信号比较，允许测定每个AML细胞结合的CD33抗体总数(ABC值)。CD33在患者AML细胞中以相对较低的水平表达，最大表达为约17,000ABC。

IMGN779用于治疗AML和最小残留疾病的用途

虽然许多AML患者响应化学疗法，这些患者中的许多最终复发。认为AML复发与大量的白血病干细胞的持久性有关。本发明提供了用于治疗AML的方法，其牵涉特异性靶向白血病干细胞。因而，本发明提供了用于实现AML患者中的完全消退的方法。有利地，IMGN779特异性靶向白血病干细胞，而不损害正常造血干细胞。因此，预测IMGN相对于损害正常造血干细胞的其它化学治疗剂具有改善的毒性概貌。

鉴于IMGN779对白血病干细胞的特异性，IMGN779会可能通过降低最小残留疾病的可能性使经历复发的患者受益。然而，IMGN779不限于复发的治疗。预期它优于常规的化学治疗剂，因为它不仅靶向CD33表达胚细胞，而且还靶向白血病干细胞，其可能造成复发。因而，本发明提供了用于治疗新诊断、复发性和难治性的患者中的AML的方法。

缀合物

IMGN779是抗体药物缀合物，其包含经由可裂解的二硫化物接头与抗huCD33抗体Z4681A缀合的DGN462。DGN462包含含有单亚胺部分的吲哚啉-苯二氮杂二聚体。

在一个实施方案中，本发明的缀合物包含经由N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基丁酸酯(磺基-SPDB)接头或其药学上可接受的盐与由以下结构式所示的细胞毒性苯二氮杂二聚体化合物偶联的本文中描述的单克隆抗体(例如，huMy9-6，又称作“Z4681A”)

其中Y是-SO₃M并且M是H或药学上可接受的阳离子。在一个实施方案中，M是Na⁺或K⁺。在另一个实施方案中，M是Na⁺。在又一个实施方案中，M是H。

磺基-SPDB接头是本领域中已知的，并且记载于美国专利8,236,319。磺基-SPDB接头可以由以下结构式所示：

在另一个实施方案中，本发明的缀合物包含经由磺基-SPDB接头或其药学上可接受的盐与由以下结构式所示的细胞毒性苯二氮杂二聚体化合物偶联的本文中描述的单克隆抗体(例如huMy9-6)：

在另一个实施方案中，本发明的缀合物包含经由磺基-SPDB接头或其药学上可接受的盐与由以下结构式所示的细胞毒性苯二氮杂二聚体化合物偶联的本文中描述的单克隆抗体(例如，huMy9-6)：

在另一个实施方案中，本发明的缀合物包含经由磺基-SPDB接头或其药学上可接受的盐与由以下结构式所示的细胞毒性苯二氮杂二聚体化合物偶联的本文中描述的单克隆抗体(例如，huMy9-6)：

在又一个实施方案中，本发明的缀合物由以下结构式所示：

或其药学上可接受的盐，其中r是1至10的整数，Y是-SO₃M，并且对于每次出现，M独立是-H或药学上可接受的阳离子。在一个实施方案中，M是Na⁺或K⁺。在另一个实施方案中，M是Na⁺。

在另一个实施方案中，本发明的缀合物由以下结构式所示：

或其药学上可接受的盐，其中r是1至10的整数。

在另一个实施方案中，本发明的缀合物由以下结构式所示：

或其药学上可接受的盐，其中r是1至10的整数。

在另一个实施方案中，本发明的缀合物由以下结构式所示：

或其药学上可接受的盐，其中r是1至10的整数，并且M是-H或药学上可接受的阳离子。在一个实施方案中，M是Na⁺或K⁺。在另一个实施方案中，M是Na⁺。在又一个实施方案中，M是H。

在另一个实施方案中，本发明的缀合物由以下结构式所示：

或其药学上可接受的盐。

在另一个实施方案中，本发明的缀合物由以下结构式所示：

其药学上可接受的盐。

在另一个实施方案中，本发明的缀合物包含经由N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)接头与由以下结构式所示的细胞毒性苯二氮杂二聚体化合物偶联的本文中描述的单克隆抗体(例如huMy9-6)

其中Y是–SO₃M并且M是H或药学上可接受的阳离子。在一个实施方案中，M是Na⁺或K⁺。在另一个实施方案中，M是Na⁺。

SPDB接头是本领域中已知的，并且记载于美国专利6,913,748。SPDB接头可以由以下结构式所示：

在另一个实施方案中，本发明的缀合物包含经由SPDB接头与由以下结构式所示的细胞毒性苯二氮杂二聚体化合物偶联的本文中描述的单克隆抗体(例如huMy9-6)：

在另一个实施方案中，本发明的缀合物包含经由SPDB接头与由以下结构式所示的细胞毒性苯二氮杂二聚体化合物偶联的本文中描述的单克隆抗体(例如huMy9-6)：

在另一个实施方案中，本发明的缀合物包含经由SPDB接头与由以下结构式所示的细胞毒性苯二氮杂二聚体化合物偶联的本文中描述的单克隆抗体(例如huMy9-6)：

在又一个实施方案中，本发明的缀合物由以下结构式所示：

或其药学上可接受的盐，其中r是1至10的整数，Y是-SO₃M，并且对于每次出现，M独立是-H或药学上可接受的阳离子。在一个实施方案中，M是Na⁺或K⁺。

在另一个实施方案中，本发明的缀合物由以下结构式所示：

或其药学上可接受的盐，其中r是1至10的整数。

在另一个实施方案中，本发明的缀合物由以下结构式所示：

或其药学上可接受的盐，其中r是1至10的整数。

在另一个实施方案中，本发明的缀合物由以下结构式所示：

或其药学上可接受的盐，其中r是1至10的整数。

在又一个实施方案中，本发明的缀合物由以下结构式所示：

或其药学上可接受的盐，其中r是1至10的整数。

在某些实施方案中，本文中描述的缀合物可以包含1-10个细胞毒性苯二氮杂二聚体化合物、2-9个细胞毒性苯二氮杂二聚体化合物、3-8个细胞毒性苯二氮杂二聚体化合物、4-7个细胞毒性苯二氮杂二聚体化合物或5-6个细胞毒性苯二氮杂二聚体化合物。

在某些实施方案中，包含本文中描述的缀合物的组合物可以包含每个抗体分子平均1-10个细胞毒性苯二氮杂二聚体分子。每个抗体分子的细胞毒性苯二氮杂二聚体分子的平均比率在本文中称为药物抗体比率(DAR)。在一个实施方案中，DAR是2-8、3-7、3-5或2.5-3.5。

本文中描述的细胞毒性苯二氮杂二聚体化合物和缀合物可以根据US 2012/0244171和US 2012/0238731中描述的方法制备，例如但不限于US2012/0244171的段落[0395]-[0397]和[0598]-[0607]，图1、15、22、23、38-41、43、48、55和60，和US2012/0244171的实施例1、6、12、13、20、21、22、23、26-30和32和US 2012/0238731的段落[0007]-[0105]、[0197]-[0291]，图1-11、16、28和实施例1-7、9-13、15和16。

术语“阳离子”指带正电荷的离子。阳离子可以是单价(例如Na⁺、K⁺等)、二价(例如Ca²⁺、Mg²⁺等)或多价(例如Al³⁺等)。优选地，阳离子是单价的。

短语“药学上可接受的”指物质或组合物必须与构成配制剂的其它成分，和/或用其治疗的哺乳动物在化学和/或毒理学上相容。

如本文中使用，短语“药学上可接受的盐”是指本发明的化合物的药学上可接受的有机或无机盐。示例性的盐包括但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、蔗糖酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐“甲磺酸盐(mesylate)”、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、双羟萘酸盐(即，1,1'-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))、碱金属(例如，钠和钾)盐、碱土金属(如，镁)盐以及铵盐。药学上可接受的盐可涉及包括另一种分子，如乙酸根离子、琥珀酸根离子或其它抗衡离子。抗衡离子可以是稳定母体化合物上的电荷的任何有机或无机部分。此外，药学上可接受的盐可在其结构中具有多于一个的带电原子。多个带电原子为药学上可接受的盐的部分的情况可具有多个抗衡离子。因此，药学上可接受的盐可具有一个或多个带电原子和/或一个或多个抗衡离子。

如果本发明的化合物是碱，则期望的药学上可接受的盐可通过本领域可得的任何合适方法来制备，例如，用无机酸，如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、甲磺酸、磷酸等，或者用有机酸，如乙酸、马来酸、琥珀酸、扁桃酸、富马酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、乙醇酸、水杨酸、吡喃糖苷酸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸、α-羟基酸如柠檬酸或酒石酸、氨基酸如天冬氨酸或谷氨酸、芳族酸如苯甲酸或肉桂酸、磺酸如对甲苯磺酸或乙磺酸等处理游离碱。

如果本发明的化合物是酸，则期望的药学上可接受的盐可通过任何合适的方法制备，例如，用无机或有机碱，如胺(伯、仲或叔)、碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物等处理游离酸。合适的盐的说明性实例包括但不限于从氨基酸，如甘氨酸和精氨酸、氨、伯、仲和叔胺，和环胺，如哌啶、吗啉和哌嗪衍生的有机盐，和从钠、钙、钾、镁、锰、铁、铜、锌、铝和锂衍生的无机盐。

IMGN779

在一个实施方案中，IMGN779可以呈现为下文描述的二酸或任何其药学上可接受的盐。

在其它实施方案中，IMGN779可以呈现为活性成分或任何其药学上可接受的盐：

在其它实施方案中，可以使用以下式，其涵盖二酸以及盐：

其中r是1至10的整数，Y是-H或-SO₃M，优选其中Y是-SO₃M，并且M是-H或药学上可接受的阳离子。

在其它实施方案中，可以使用以下式，其涵盖二酸以及盐：

P-糖蛋白

P-糖蛋白(PGP)，又称为MDR1，是一种170kD的ATP依赖性药物流出泵。它是ABC超家族的成员，并且在多药物抗性(MDR)细胞中丰富表达并且由ABCB1细胞生成。表达PGP的AML细胞至少在一定程度上对用常规的化疗剂的治疗有抗性。重要地，本发明有利地提供了多药物抗性AML的治疗。在具体的实施方案中，本发明提供用于治疗表达PGP的AML的方法。

治疗应用

本发明提供了施用IMGN779以治疗AML，包括多药物抗性AML的方法。在具体的实施方案中，以药学上可接受的剂型对受试者施用IMGN779。可以在静脉内作为推注或通过在一段时间里连续输注，通过肌肉内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径施用IMGN779。通过肿瘤内、肿瘤周围、病灶内或损伤周围的途径施用包含IMGN779的药物组合物，以施加局部以及系统性治疗效果。

药学上可接受的剂型通常将包含药学上可接受的药剂，如载体、稀释剂和赋形剂。这些药剂是公知的，并且最合适的药剂可以由本领域技术人员确定为临床情况保证。合适的载体、稀释剂和/或赋形剂的实例包括：(1)Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水，pH.值约.7.4，其含有约1mg/ml至25mg/ml人血清白蛋白，(2)0.9％盐水(0.9％w/v NaCl)，和(3)5％(w/v)右旋糖。

当以水性剂型存在，而不是被冻干时，IMGN779通常将配制为约0.1mg/ml至100mg/ml的浓度，尽管这些范围之外广泛变化是允许的。对于疾病的治疗，IMGN779的适当剂量将取决于如上文所定义的有待治疗的疾病的类型，疾病的严重性和过程，抗体是否为预防还是治疗目的而施用，先前疗法的过程，患者的临床史和对抗体的响应，以及主治内科医生的判断。一次性或在一系列治疗里对患者适当施用抗体。

本发明的治疗应用包括治疗具有疾病的受试者的方法。用本发明的方法治疗的疾病是那些以CD33的表达为特征的疾病。此类疾病包括脊髓发育不良综合征(MDS)和癌症，如急性髓样白血病(AML)、慢性髓样白血病(CML)和急性前髓细胞性白血病(APL)。熟练技术人员会理解，本发明的方法也可以用于治疗尚有待描述，但是以CD33表达为特征的其它疾病。

也可以在体外和离体实施本发明的治疗性应用。

用于制备抗体的多核苷酸、载体、宿主细胞和方法

本发明进一步提供了包含编码本发明的抗体或其表位结合片段的核苷酸序列的多核苷酸。

可以通过本领域中已知的任何方法获得多核苷酸，并且测定多核苷酸的核苷酸序列。例如，若抗体的核苷酸序列是已知的，则可以从化学合成的寡核苷酸装配编码抗体的多核苷酸(例如，如描述于Kutmeier等人,1994,BioTechniques 17:242)，简言之，其牵涉合成含有编码抗体的序列的各部分的重叠寡核苷酸，退火并连接那些寡核苷酸，然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。

用于构建体重组载体的方法是本领域中公知的，所述重组载体含有抗体编码序列和合适的转录和翻译控制信号。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。因此，本发明提供了可复制载体，其包含与启动子可操作连接的编码本发明的抗体分子或其重链或轻链或重链或轻链可变域或这些中任一项的表位结合片段的核苷酸序列。

通过常规技术将重组载体转移到宿主细胞，然后通过常规技术培养经转染的细胞以制备本发明的抗体。因此，本发明包括宿主细胞，所述宿主细胞含有与异源启动子可操作连接的编码本发明的抗体或其表位结合片段的多核苷酸。在优选的实施方案中，可以在宿主细胞中共表达编码重链和轻链两者的载体以表达整个免疫球蛋白分子。

可以利用多种宿主表达载体系统表达本发明的抗体分子。此类宿主表达系统代表可以制备并且随后纯化感兴趣的编码序列的媒介物，而且还代表当用合适的核苷酸编码序列转化或转染时可以原位表达本发明的抗体分子的细胞。这些包括但不限于微生物，如用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如，大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia))；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞；用重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或者用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或含有重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BHK、293、3T3细胞)，所述重组表达构建体含有从哺乳动物细胞的基因(例如，金属硫蛋白启动子)或从哺乳动物病毒(例如，腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)衍生的启动子。

优选地，使用细菌细胞，如大肠杆菌和更优选真核细胞(尤其是用于表达完整重组抗体分子)表达重组抗体分子。例如，与载体，如来自人巨细胞病毒的主要立即早期基因启动子元件结合的哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是一种用于抗体的有效的表达系统(Foecking等人,1986,Gene 45:101；Cockett等人,1990,Bio/Technology8:2)。

对于重组蛋白的长期的高产率生产，稳定的表达是优选的。例如，可以工程化稳定表达抗体分子的细胞系。不同于使用含有病毒复制起点的表达载体，可以用受到合适的表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、多聚腺苷酸化位点等)控制的DNA和稳定的标志物转化宿主细胞。在引入外来DNA后，可以让工程化细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转换为选择性培养基。重组质粒中的选择标志物赋予对选择的抗性，并且让细胞将质粒稳定整合到其染色体中，并且生长以形成焦点，继而可以将所述焦点克隆并扩充成细胞系。有利地，可以使用此方法工程化表达抗体分子的细胞系。此类工程化细胞系可以特别可用于筛选和评估与抗体分子直接或间接相互作用的化合物。

一旦已经重组表达本发明的抗体分子，可以通过用于纯化免疫球蛋白分子的本领域中的任何已知方法，例如通过层析(例如，离子交换，亲和力，特别是通过蛋白A后对特定抗原的亲和力，和分筛柱层析)，离心，差异溶解度，或者通过用于纯化蛋白质的任何其它标准技术纯化它。

试剂盒

本发明提供了试剂盒，所述试剂盒包含检测患者样品中的CD33表达水平(例如每个细胞的抗原数目)的抗CD33抗体(例如，克隆WM53，BD Biosciences)和包含有效量的IMGN779的治疗组合物。若想要的话，试剂盒进一步包含关于检测CD33表达水平和确定在对患者施用时IMGN779是否会有效的指导。任选地，试剂盒进一步包含关于对选择接受IMGN779的患者施用IMGN779的说明。

除非另有指明，本发明的实践采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，其完全在双链技术人员的范围内。此类技术在文献中完整解释，如“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,第二版(Sambrook,1989)；“Oligonucleotide Synthesis”(Gait,1984)；“Animal Cell Culture”(Freshney,1987)；“Methods in Enzymology”“Handbook of Experimental Immunology”(Weir,1996)；“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells”(Miller和Calos,1987)；“Current Protocols in Molecular Biology”(Ausubel,1987)；“PCR:The Polymerase Chain Reaction”,(Mullis,1994)；“Current Protocols in Immunology”(Coligan,1991)。这些技术可适用于本发明的多核苷酸和多肽的制备，并且因而可以在产生和实施本发明中考虑。在以下的部分中将讨论用于具体的实施方案的特别有用的技术。

提出以下实施例以给本领域普通技术人员提供如何产生和使用测定法，筛选，和本发明的治疗方法的完全公开和描述，并且并不意图限制发明人视为其发明的事情的范围。

实施例

实施例1：IMGN779展现出针对原代患者AML细胞的CD33特异性体外细胞毒性

通过流式细胞术测量CD33水平和P-糖蛋白(Pgp)活性。用WST-8存活力染色，使用连续暴露直至7天评估AML细胞系中的DGN462和IMGN779的细胞毒性效力。24小时暴露后和长期液体培养后使用集落形成测定法评估IMGN779针对原代AML样品和正常骨髓(NBM)的效力，以分别评估在白血病祖细胞和白血病干细胞中的效力。在携带皮下HL60/QC和EOL-1异种移植物的SCID小鼠中评估IMGN779的抗肿瘤活性。

从通过ELISA测量的在各个时间点时的IMGN779缀合物及其总Z4681A抗体组分的血浆浓度测定CD-1小鼠中的药动学参数。通过针对AML细胞的细胞毒性效力的测定法确认这些血浆样品的子集的生物活性。通过测量体重、临床观察和临床化学，在CD-1小鼠中评估IMGN779的可耐受性。

IMGN779表明针对从外周血或骨髓样品分离的原代患者AML细胞的高度有力的且CD33特异性的体外细胞毒性。IC₅₀值范围为10至1500pM，一般在具有CD33表达水平>3000或每个细胞5000个抗原的样品中观察到最高的活性。在长期培养物中，IMGN779在患者AML样品中显示白血病集落形成的剂量依赖性降低。比较而言，集落形成在正常的骨髓中增加，这指示了正常造血干细胞不被损害。

PGP活性与CD33表达水平和IMGN779细胞毒性呈反相关。IMGN779针对AML细胞系，包括PGP表达细胞系为高度活性的，IC₅₀值范围为2至3000pM。IMGN779针对AML异种移植物是高度活性的，最小有效剂量(MED)为0.6mg/kg(缀合物剂量)。缀合物半衰期在小鼠中是约3-4天，生物活性维持至少3天，这指示了缀合物在循环过程中仍然完整且有活性。IMGN779在小鼠中具有有利的可耐受性(最大耐受剂量40mg/kg)，没有延迟的毒性或肝毒性。

实施例2：CD33在原代患者AML细胞上表达

使用校准的流式细胞术方法测量原代患者AML细胞上的CD33表达(图1)。用荧光标记的抗CD33抗体染色AML样品，并且与以不同的标记物与珠比率使用荧光标记的珠得到的校准曲线的荧光信号比较，允许测定每个AML细胞结合的CD33抗体的总数(ABC值)。CD33在患者AML细胞中以相对较低水平表达，最大表达为每个细胞的约17,000个抗原(ABC)。

实施例3：IMGN779表明针对原代患者AML细胞的高度有力的且CD33特异性的体外细胞毒性。

在24小时缀合物暴露后在集落形成测定法中针对一组原代患者AML细胞评估IMGN779的细胞毒性活性(图2)。

对这些样品的子集评估CD33靶向性美登素生物碱ADC(使用IMGN779中的相同抗体)的活性。IMGN779针对患者AML细胞是高度有活性的，IC₅₀值范围为11pM至1.6nM，对CD33表达水平有依赖性。CD33水平范围为每个细胞约200至16,000个抗原。比较而言，CD33靶向性美登素生物碱ADC比IMGN779有小60至9,000倍的活性，对CD33表达水平无依赖性。图2显示了与针对患者AML细胞的CD33靶向性美登素生物碱ADC相比IMGN779的体外效力。

使用0.3nM的IC₅₀截留限定高水平的敏感性(比CD33靶向性美登素生物碱ADC的中值IC₅₀低500倍)，测定基于CD33表达截留，对IMGN779高度敏感的患者细胞的百分比。对于具有大于1000的CD33水平的样品，超过60％是高度敏感的。对于具有>3,000的CD33水平的样品，超过75％对IMGN779是高度敏感的。对于具有超过5,000的CD33水平的样品，大于90％的细胞对IMGN779是高度敏感的，尽管样品数目较低(15份样品中的14份)。当包括不依赖于CD33水平的所有样品时，所有样品的仅56％是高度敏感的。高度敏感性样品的百分比随CD33水平而增加。表达高于5,000ABC的CD33水平的患者AML细胞比那些每个细胞具有小于5,000CD33抗原的那些细胞显著更敏感(中值IC₅₀值的比较)(p<0.0001)。

还评估非结合嵌合IgG1-DGN462缀合物的细胞毒性活性以测定观察到的IMGN779活性的CD33依赖性。非CD33结合缀合物针对这些细胞一般无活性，在测试的最高剂量(1nM)时在大多数样品中没有达到IC₅₀值，这证明了高度有力的IMGN779活性依赖于CD33靶向。图3显示了细胞中的log IC₅₀的分布，其中每个细胞的CD33抗原小于5000或大于5000。

实施例4：IMGN779特异性靶向白血病干细胞，同时不损害正常造血干细胞。

在长期液体培养(5-7周)后收集将AML细胞暴露于IMGN779后在集落形成单位(CFU)测定法中形成的集落，并且分析FLT3-ITD(内部串联重复)和/或突变体-NPM1状态作为白血病集落的分子标志物。对对照(未处理)和用100pM和1000pM的剂量的IMGN779处理的样品测定白血病集落(FLT3-ITD和/或突变体NPM1阳性)对比野生型(正常，在FLT3-ITD和/或突变体NPM1上呈阴性)的比率。用1000pM浓度的IMGN779的处理消除LSC，同时不损害造血干细胞，如根据仅存在正常集落指示(图4A)。

图4B显示了在5周后，存在集落数目的剂量依赖性增加。在7周时对集落分析AML的分子标志物(三体性8、FLT3-ITD和NPM1)的存在。AML分子标志物的不存在指示野生型(WT)集落源自正常HSC。在用IMGN779处理后在正常骨髓的长期培养物中也观察到增加的集落形成，这指示造血干细胞(HSC)不被损害。因此，IMGN779在长期白血病干细胞培养物中引起白血病集落形成的剂量依赖性减少和正常hsc集落的增加。

实施例5：P-糖蛋白(PGP)表达细胞对IMGN779敏感

为了评估PGP的作用，在添加或不添加2μM PGP抑制剂PSC833的情况下测试IMGN779的体外活性。对PGP的抑制导致IMGN779的体外活性的加强，范围为0.8至29倍，并且在对IMGN779有最小敏感性的两份AML样品中最高(5和29倍)。在剩余的样品中，加强小于因子5。PGP活性与CD33表达水平(图5A)和IMGN779细胞毒性(图5B)呈反相关。

实施例6：IMGN779表明针对原代患者AML细胞的高度有力的且CD33特异性的体外细胞毒性

在短期液体培养测定法中进行针对原代患者AML细胞的IMGN779细胞毒性的测定法。一般在每个细胞>5000个抗原的CD33表达水平的情况下观察到最高的IMGN779活性(图2)。IMGN779活性是CD33特异性的(图5A)。非靶向性DGN462-ADC没有活性(在33/35份样品中测试的最高剂量未达到IC₅₀)。CD33水平范围为每个细胞的约200至16,000个抗原。

实施例7：AML细胞系对IMGN779和DGN462高度敏感。

在体外评估一组21种AML细胞系(图6)。CD33表达范围为每个细胞的1,000–55,000个抗原。这些水平比在原代患者细胞中检测的水平高得多。对游离药物DGN462-SMe的中值敏感性是38pM(范围为5至3900pM IC₅₀)。对IMGN779的中值敏感性是70pM(范围为2至3000pM IC₅₀)。

使用校准的定量流式细胞术方法测量AML细胞系上的CD33水平。用缀合有藻红蛋白(PE)的抗CD33抗体(BD Biosciences)染色细胞，并且与BD Quantibrite珠校准曲线比较。以每孔2,000至5,000个细胞的密度将细胞铺板在96孔组织培养板上，并且在37℃与各个浓度的DGN462-SMe或IMGN779孵育5天。使用基于WST-8的比色测定法(Dojindo Molecular Technologies,Inc.)测定细胞的存活。

实施例8：IMGN779在0.6mg/kg的最小有效剂量针对人AML异种移植物是高度有活性并且抗原特异性的

为了测定IMGN779的抗肿瘤活性，在皮下异种移植物中携带EOL-1急性髓样白血病(AML)(图7A)或HL60/QC前髓细胞性白血病(PML)(图7B)细胞(约100mm³)的SCID小鼠接受IMGN779的单次皮下注射。肿瘤生长抑制(T/C％)以当对照中值肿瘤体积为约1000mm³时处理(T)和对照(C)组的中值肿瘤体积的比率计算(Bissery,M.等人,Cancer Res.51,4845-4852,1991年9月)。根据国家癌症研究所(National Cancer Institute)标准，T/C≤42％是抗肿瘤活性的最小水平。认为T/C<10％是高的抗肿瘤活性水平。图7C是概述从异种移植物模型获得的数据的表。

实施例9：IMGN779在CD-1小鼠中是良好耐受的，无肝毒性或延迟的毒性

为了测定IMGN779的可耐受性和毒性，以描述的剂量给雌性CD-1小鼠(7周龄)静脉内注射IMGN779。每日测量体重。通过在给药后第5天(体重减轻最低点)时测量血清化学，包括肝酶丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)在最大耐受剂量(MTD)和约30％的MTD评估毒性。

IMGN779在最大耐受(MTD)剂量不引起小鼠中的肝毒性。丙氨酸转氨酶(ALT)/天冬氨酸转氨酶(AST)值与CD-1小鼠的正常参照范围相当。用含有DNA交联剂的抗体药物缀合物(ADC)没有观察到延迟的毒性的证据。参见图8。

实施例10：IMGN779与具有可裂解的接头的抗体药物缀合物(ADC)具有相当的药动学概貌和体内稳定性，缀合物生物活性维持至少3天

为了测定IMGN779的药动学和生物活性，在CD-1小鼠中单次静脉内注射IMGN779(5mg/kg)后通过ELISA测定总抗体(Ab)(未缀合的Ab和完整的抗体药物缀合物两者)(图9A)和完整的缀合物的血浆浓度(图9B)。使用非区室分析程序(201)，WinNonlin,Professional 6.1版(Pharsight,Mountain View,CA)进行药动学(PK)分析。使用细胞毒性测定法测定小鼠血浆中的IMGN779的生物活性浓度。参见图9B和9C。将细胞暴露于标准IMGN779样品的连续稀释物，或者暴露于来自用缀合物给药的小鼠的滴定的血浆样品。通过用每份血浆样品的IC50稀释乘以IMGN779标准品的IC₅₀测定小鼠血浆中的IMGN779的生物学活性浓度。

实施例11：IMGN779针对具有FLT3-ITD突变的原代患者AML细胞展现出高的体外细胞毒性

评估了IMGN779针对来自患者血液和骨髓的原代AML样品的效力。使用24小时暴露后的集落形成测定法评估IMGN779对白血病祖细胞的细胞毒性活性。使用校准的流式细胞术方法测量原代患者AML细胞上的CD33表达。用荧光标记的抗CD33抗体染色AML样品，并且与校准曲线的荧光信号比较。以不同的标记物与珠比率使用荧光标记的珠产生校准曲线，允许测定每个AML细胞结合的CD33抗体的总数(ABC值)。在SSC和CD45抗体染色上门控AML母细胞。

CD33在患者AML母细胞中以范围为约200-15,000ABC的水平表达。IMGN779针对患者AML细胞具有高的细胞毒性活性，IC₅₀值范围为11pM至1.6nM，与CD33表达水平有关系(图11)。

基因组测试结果可用于具有产生的IC₅₀值的21份原代AML样品。这些中，12份携带FLT3内部串联重复突变(FLT3-ITD)。FLT3-ITD样品的均值IC₅₀值低于测试的其它样品的(图12)。这指示IMGN779在体外在原代患者FLT3-ITD AML样品中高度有活性。均值CD33ABC对于FLT3-ITD样品比对于测试的其它样品更高(图13)。不意图被理论束缚，这可以部分促成其相对敏感性。

实施例12：IMGN779针对具有FLT3-ITD突变的AML细胞系展现出高的体外细胞毒性

用WST-8存活力染色，使用连续暴露直至7天评估AML细胞系中的IMGN779的细胞毒性效力。使用校准的流式细胞术方法测量CD33ABC水平。在癌症体细胞突变目录(catalogue of somatic mutations in cancer，COSMIC)数据库中报道了测试的细胞系的FLT3状态，并且通过测序研究确认。

IMGN779针对AML细胞系具有高的细胞毒性活性，IC₅₀值范围为2pM至3nM。对具有FLT3-ITD突变的两种细胞系MV4-11和MOLM-13的IC₅₀值分别为2和5pM，指示IMGN779针对FLT3-ITD AML细胞系在体外高度有活性(图14)。

除IMGN779外，还用WST-8存活力染色使用连续暴露直至7天在FLT3-ITD AML细胞系中评估索拉非尼(Sorafenib)和奎扎替尼(Quizartinib)的细胞毒性效力。索拉非尼是几种酪氨酸蛋白质激酶的小分子抑制剂，并且奎扎替尼是特异性靶向III类受体酪氨酸激酶(包括FLT3)的小分子激酶抑制剂。两者都用于在临床试验中治疗FLT3-ITD AML患者。IMGN779的IC₅₀值在MOLM13细胞系中低于索拉非尼和奎扎替尼的IC₅₀值(图15)，指示与其它相关化合物相比，IMGN779在FLT3-ITD AML细胞系中高度有活性。

实施例13：IMGN779在最小有效剂量针对MV4-11FLT3-ITD AML异种移植物展示有力的、抗原靶向性抗肿瘤活性

在FLT3-ITD AML的建立的皮下异种移植物模型评估IMGN779的抗肿瘤活性。用皮下注射到小鼠的右体侧中的MV4-11人FLT3-ITD AML细胞(1x10⁷个细胞/动物)接种SCID小鼠(n＝24)。当肿瘤的大小达到约100mm³时(肿瘤细胞接种后约13天)，使用chKTi抗体启动用过量的人IgG的FcR封闭，所述chKTi抗体在第0天(接种后第13天)以400mg/kg的剂量和在第5天和第10天(接种后第18天和第23天)以100mg/kg的剂量施用。基于小鼠中的约12天的血浆循环半衰期，血浆IgG浓度应当维持于约10mg/mL。此血浆浓度与人循环IgG水平相当，并且应当足以封闭MV4-11细胞上存在的所有FcR。在接种后第14天，基于肿瘤体积(约100mm³)将小鼠随机分成各6只动物的处理组，并且用基于DGN462浓度，10μg/kg剂量的非靶向性对照chKTi-sulfo-SPDB-DGN462或IMGN779的单次静脉内注射处理。肿瘤生长抑制(T/C％)以在对照中值肿瘤体积为约1000mm³当天的处理(T)和对照(C)组的中值肿瘤体积的比率计算(Bissery,M.等人,Cancer Res.51,4845-4852,1991年9月)。根据NCI标准，T/C≤42％是抗肿瘤活性的最小水平。认为T/C<10％是高的抗肿瘤活性水平。

用10μg/kg的IMGN779处理具有针对MV4-11异种移植物的高抗肿瘤活性，(T/C＝1％)在6/6只动物中有部分消退(PR)，并且在3/6只动物中有完全消退(CR)(图16)。用匹配剂量的非靶向性对照缀合物chKTi-sulfo-SPDB-DGN462的处理是无活性的(T/C＝95％)，没有肿瘤消退。

本研究的结果证明了靶向CD33的IMGN779在10μg/kg的剂量针对MV4-11FLT3-ITD AML异种移植物高度有活性。

总而言之，IMGN779是一种利用新颖的DNA烷化剂DGN462的CD33靶向性抗体药物缀合物(ADC)。质谱仪概貌指示每个抗体有约3个DGN462分子(图17)。它的有利的临床前可耐受性概貌指示IMGN779可能赋予相对于针对AML的现有临床药剂的治疗优点，所述临床药剂表明活性，但是具有重大的毒性。IMGN779在体外针对AML细胞系和原代患者AML细胞的高度有力的CD33靶向性活性，针对小鼠中的AML异种移植物观察到的抗肿瘤活性和有利的安全性概貌指示它是一种有希望的用于AML的治疗。

使用以下的方法和材料获得上文描述的结果。

体外方法

CD33定量和Pgp活性

通过流式细胞术分析来自骨髓或外周血的原代患者AML细胞。用缀合有藻红蛋白(PE)的抗CD33抗体(BD Biosciences)染色AML样品(CD34⁺/CD38⁺/CD33⁺祖细胞区室)，并且与BD Quantibrite珠校准曲线比较。通过Syto16±PSC833Pgp抑制剂的均值荧光强度(MFI)的比率计算Pgp的功能活性。

对原代AML细胞的体外效力

将细胞(或正常人骨髓样品)暴露于各个浓度的IMGN779或非靶向性ADC对照达24小时。将样品分到短期液体培养(STLC)测定法中以测量针对AML祖细胞的细胞毒性，和长期液体培养(LTLC)测定法中以测量对LSC和正常HSC的影响。在半固体MethoCult H4230培养基(Stemcell technologies)中铺板后10-14天，使用STLC测量细胞中的集落形成单位。通过添加生长因子进行长期培养5-7周，类似地进行LTLC测定法。在这两种测定法中，对集落计数以测定最初铺板的细胞的每个数目的集落形成单位。使用PCR或FISH分析对LTLC集落进一步分析AML分子标志物的存在。

对细胞系的体外效力

以每孔的2,000至5,000个细胞的密度将细胞铺板在96孔组织培养板中，并且在37℃与各个浓度的DGN462-SMe或IMGN779孵育5天。使用基于WST-8的比色测定法(Dojindo Molecular Technologies,Inc.)测定细胞的存活。

抗肿瘤活性

携带HL60/QC和EOL-1急性髓样白血病(AML)皮下异种移植物(约100mm³)的SCID小鼠接受IMGN779的单次IV注射。肿瘤生长抑制(T/C％)以在对照中值肿瘤体积为约1000mm³当天的处理(T)和对照(C)组的中值肿瘤体积的比率计算(Bissery,M.等人,Cancer Res.51,4845-4852,1991年9月)。根据NCI标准，T/C≤42％是抗肿瘤活性的最小水平。认为T/C<10％是高的抗肿瘤活性水平。CR＝完全肿瘤消退。

可耐受性/毒性

以描述的剂量给雌性CD-1小鼠(7周龄)静脉内(IV)注射IMGN779。每日测量体重。通过在给药后第5天(体重减轻最低点)时测量血清化学，包括肝酶丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)在最大耐受剂量(MTD)和约30％的MTD评估毒性。

药动学和生物活性

在CD-1小鼠中单次IV注射IMGN779(5mg/kg)后通过ELISA测定总抗体(Ab)(未缀合的Ab和完整的ADC)和完整的缀合物的血浆浓度。使用非区室分析程序(201)，WinNonlin,Professional 6.1版(Pharsight,Mountain View,CA)进行药动学(PK)分析。使用细胞毒性测定法测定小鼠血浆中的IMGN779的生物活性浓度。将细胞暴露于标准IMGN779样品的连续稀释物，或者暴露于来自用缀合物给药的小鼠的滴定的血浆样品。通过用每份血浆样品的IC₅₀稀释乘以IMGN779标准品的IC₅₀测定小鼠血浆中的IMGN779的生物学活性浓度。

其它实施方案

从以上描述看，应当明显的是，可以对本文中描述的发明进行改变和修改以使它适合于各种用途和条件。此类实施方案也在所附权利要求书的范围内。

本文中的变量的任何定义中的一批要素的叙述包括定义所述变量为所列要素的任何单一要素或组合(或亚组合)。本文中的实施方案的叙述包括作为任何单一实施方案或与任何其它实施方案或其部分组合的该实施方案。

本发明还涉及美国专利No.:7,557,189；7,342,110；8,119,787；8,337,855；和美国专利申请No.13/680,614中描述的主题，它们公开了抗CD33抗体(huMy9-6)的完全序列，每篇通过引用方式并入本文。本说明书中提及的所有专利和出版物通过引用方式并入本文，其程度就像每篇独立的专利和出版物明确并且单独指出通过引用方式并入一样。