治疗厄泼斯坦‑巴尔病毒相关疾病的双膦酸盐化合物和γδT细胞‑介导的疗法的制作方法

发明领域

本发明总体上涉及厄泼斯坦-巴尔病毒(ebv)相关疾病的治疗。

发明背景

厄泼斯坦-巴尔病毒(ebv)感染超过95%的世界人口，且与几种人类恶性肿瘤，例如何杰金氏病、伯基特氏淋巴瘤、鼻咽癌(npc)和ebv-阳性弥漫性大b-细胞淋巴瘤有关。ebv是在大多数成年个体中潜伏性感染人类b细胞的疱疹病毒。持久的ebv感染在具有免疫能力的宿主中通常是亚临床的(cohen,2000)。然而，免疫功能受损的患者处于发展具有显著发病率和死亡率的ebv-诱导的b细胞淋巴细胞增殖性疾病(ebv-lpd)的高风险中(shapiro等,1988)。目前对于ebv-lpd的治疗选项包括恢复对ebv的细胞免疫反应和用单克隆抗体或化学疗法耗尽b细胞(heslop等,2010;khanna等,2005;wagner-johnston和ambinder,2007)。通过离体-生成的ebv-特异性细胞毒性t淋巴细胞(ctl)的过继转移来恢复细胞免疫反应对于治疗ebv-lpd已取得了有前景的结果(kanakry和ambinder,2013;khanna等,1999;leen等,2007;long等,2011;rooney等,1995)。然而，它对治疗ebv-lpd的应用受到难以体外生成足够数量的ebv-特异性ctl和在罹患大块疾病的患者中缺乏输注ctl的体内扩增的限制(leen等,2007;louis等,2009)。抗体-介导的靶向ebv-感染的b细胞具有不需要的副作用，因为抗-cd20抗体也消耗正常的b细胞，引起长时间的低丙球蛋白血症；并且最终，化学疗法导致不需要的脱靶毒性并且还引起全身免疫抑制(leen等,2007)。

γδ-t细胞被视为具有nk细胞特征的先天-样t淋巴细胞(born等,2006;carding和egan,2002)。各种先天的信号，单独或者经由tcr与配体识别组合，诱导γδ-t细胞表现出先天-样免疫功能(bonneville和scotet,2006;born等,2006;zheng等,2013a)。γδ-t细胞在成人血液和外周器官中组成1-10%的t淋巴细胞。在健康成人的外周血液和淋巴器官中的大多数γδ-t细胞是vγ9vδ2-t细胞。vγ9vδ2-t细胞可以hla-不限制的方式，被小的非-肽磷酸抗原特异性地激活，所述非-肽磷酸抗原为类异戊二烯生物合成途径的代谢产物(beetz等,2008)。异戊烯焦磷酸(ipp)，一种通过甲羟戊酸途径产生的中间体，被发现在体外和体内选择性地激活和扩增人vγ9vδ2-t细胞(alexander等,2008;puan等,2007)。药用化合物，例如氨基二膦酸帕米膦酸盐，通常用来治疗骨质疏松症，可诱导ipp的细胞内聚集，导致人vγ9vδ2-t细胞的激活和扩增(bonneville和scotet,2006)。人vγ9vδ2-t细胞可以在体外和人源化小鼠体内发挥广泛的抗病毒和抗肿瘤活性(fournie等,2013;qin等,2011;qin等,2012;tu等,2011)。然而，尚不知道这些细胞是否对ebv和ebv-lpd具有类似的作用。

发明概述

氨基二膦酸帕米膦酸盐(pam)通常被用来治疗骨质疏松症。它也用作治疗癌症的症状例如高钙血症(高血钙水平)或减少由骨转移产生的并发症(例如骨折或疼痛)的支持药物。

如本文所示，pam-扩增的人vγ9vδ2-t细胞在体外和体内有效地杀死厄泼斯坦-巴尔病毒转化的自体同源的类淋巴母细胞b细胞系(ebv-lcl)。pam可通过vγ9vδ2-t-细胞依赖性机制，控制人源化小鼠中的ebv-相关疾病。这提出了使用pam以增强对抗ebv-相关疾病，例如淋巴细胞增殖性疾病(lpd)、移植后淋巴细胞增殖性疾病(plpd)、何杰金氏病、伯基特氏淋巴瘤和鼻咽癌(npc)的人vγ9vδ2-t-细胞免疫力的治疗方法的强大潜力。

因此，本发明公开了pam或pam-扩增的人vγ9vδ2-t细胞治疗ebv相关疾病的用途，和及其增强对抗lpd、plpd、何杰金氏病、伯基特氏淋巴瘤和npc的人vγ9vδ2-t-细胞免疫力的治疗用途。

在一个方面，本发明提供治疗患有ebv-相关疾病的受试者的方法，其包括给予受试者有效量的pam。

在另一方面，本发明提供治疗患有ebv-相关疾病的受试者的方法，其包括给予受试者有效量的pam-扩增的vγ9vδ2-t细胞。

在本发明的实施方案中，ebv-相关疾病选自lpd、plpd、何杰金氏病、伯基特氏淋巴瘤和npc。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，pam或pam-扩增的vγ9vδ2-t细胞与药学上可接受的载体一起给予。

在另一方面，本发明提供包含氨基二膦酸帕米膦酸盐的药用组合物。

在又一方面，本发明提供包含氨基二膦酸帕米膦酸盐-扩增的vγ9vδ2-t细胞的药用组合物。

在此描述的药用组合物还可包含药学上可接受的载体和/或药学上可接受的赋形剂、添加剂或辅助剂。

本发明的方面还提供用于激活和扩增免疫细胞的亚群的试剂盒。这样的试剂盒可包含扩增调节剂、固体支持物和选择剂。

在一些实施方案中，免疫细胞的亚群包含vγ9vδ2-t细胞。扩增调节剂可包含具有刺激t细胞扩增的能力的药物，例如氨基二膦酸帕米膦酸盐。固体支持物可包含微型磁珠。选择剂可具有对特定的免疫细胞群的亲和力并可包含一种或多种抗体、一种或多种肽，和/或一种或多种核酸分子。此外，选择剂可结合于固体支持物。在此提供的试剂盒的另外的实施方案可包含至少一种试剂和/或其使用的用法说明书。试剂盒可另外地提供一种或多种用于流式细胞术分析的试剂。

在此描述的方法、组合物和试剂盒可与药学、医学和兽医学应用，以及基础科学研究和方法学联合使用，如技术人员在阅读了本公开内容后将可识别的。本发明的这些和其它目标、特点和优势在考虑了附图以及详细的描述时将变得显而易见。

附图简述

图1a-1g显示vγ9vδ2-t细胞体外杀死ebv-lcl。(图1a)ebv-lcl和自体同源的正常人b细胞的表型。白色直方图代表mica/b、fas、fasldr4和dr5，和灰色直方图代表同种型对照。(图1b、1e、1f)帕米膦酸盐(pam)-扩增的vγ9vδ2t细胞通过用抗-tcrγ/δ单克隆抗体-轭合微型磁珠或tcrγ/δ⁺t细胞分离试剂盒阳性选择(p-γδ-t)或阴性选择(n-γδ-t)来纯化，然后与自体同源的ebv-lcl以不同的比例一起培养4小时。(图1c、1d、1g)使通过阳性选择纯化的pam-扩增的vγ9vδ2-t细胞与自体同源的ebv-lcl或正常的b细胞以不同的e:t比例(图1c)或10:1的e:t比例(图1d和1g)共同培养4-6小时。(图1d)vγ9vδ2t细胞通过使用一种跨孔系统，与自体同源的ebv-lcl一起直接共同培养6小时或与自体同源的ebv-lcl物理分离6小时。(图1e和1f)p-γδ-t或n-γδ-t细胞用或不用固定化mica/b预处理6小时，然后与自体同源的ebv-lcl以10:1的e:t比例共同培养4-6小时。显示了在整个靶细胞(cd3^-群体)中被鉴定为cd3^-pi⁺的死亡细胞的百分比(图1b-1d，和1f)和cd107a在vγ9vδ2-t细胞上的表面表达(图1e)。(图1g)穿孔素抑制剂cma、脱粒酶b失活剂bcl-2、抗-nkg2d(αnkg2d)、抗-trail(αtrail)和抗-fasl(αfasl)阻断抗体，或它们的相关同种型对照(小鼠igg1，migg1)被用于ebv-lcl及其自体同源的pam-扩增的vγ9vδ2-t细胞的共同培养。细胞毒性被显示为相对于没有任何处理的那些的抑制百分比。所有显示为均值±sem的数据代表了4次独立的实验。*p<0.05。

图2a-2g显示帕米膦酸盐对vγ9vδ2-t细胞的激活、扩增和细胞毒性活性的作用。(图2a-2c)体外帕米膦酸盐(pam)-扩增和激活的vγ9vδ2-t细胞。hupbmc在补充有9µg/mlpam的10%fbs-rpmi1640中培养；从培养后第3天加入500iu/mlrhil-2。vγ9vδ2-t细胞在整个培养细胞中的百分比和倍数变化用流式细胞术测定(图2a-2b)。显示为均值±sem的数据代表4次独立的实验。新分离的vγ9vδ2-t细胞和由pam/il2或il-2单独扩增的细胞(在培养20天后)的表型显示于图2c中。白色直方图代表cd69、nkg2d、fas、fasl、trail、穿孔素和脱粒酶b，而灰色直方图代表它们的同种型对照。数据代表4次独立的实验。(图2d)ebv-lcl单独不能有效地扩增vγ9vδ2-t细胞。cfse标记的-pbmc与或不与自体同源的ebv-lcl以10:1的比例共同培养3天。vγ9vδ2-t细胞在共同培养3天后的绝对数被示出(图2d)。显示为均值±sem的数据代表3次独立的实验。ns，无显著性差异。(图2e)固定化mica/b提高ebv-lcl识别受体和细胞毒性分子在vγ9vδ2-t细胞中的表达，特别是对于通过阳性选择分选的细胞。pam-扩增的vγ9vδ2-t细胞通过用抗-tcrγ/δ微型磁珠或tcrγ/δ⁺t细胞分离试剂盒阳性选择(p-γδ-t)或阴性选择(n-γδ-t)纯化，然后用或不用固定化mica/b预处理6小时。vγ9vδ2-t细胞的表型用流式细胞术确定(图2e)。数据代表4次独立的实验。(图2f)pam不显示任何对抗ebv-lcl的细胞毒性活性。ebv-lcl在有或无pam(9μg/ml)的培养基中培养24、48，和72小时。死亡细胞在全部细胞中的百分比被鉴定为pi⁺细胞。显示为均值±sem的数据代表4次独立的实验(图2f)。(图2g)pam提高ebv-lcl识别受体和细胞毒性分子在vγ9vδ2-t细胞中的表达。pbmc与自体同源的ebv-lcl以10:1的比例，在pam(9μg/ml)的存在或不存在下共同培养5天。vγ9vδ2-t细胞的表型用流式细胞术确定。白色直方图代表cd69、nkg2d、fas、fasl、trail、cd107a、穿孔素和脱粒酶b，而灰色直方图代表它们的同种型对照。数据代表4次独立的实验。

图3a-3d显示vγ9vδ2-t细胞预防rag2^-/-γc^-/-小鼠中的ebv-lpd。(图3a)ebv-lpd小鼠模型的建立方案和vγ9vδ2-t细胞在体内的抗肿瘤活性的评价。rag2^-/-γc^-/-小鼠用表达egfp的ebv-lcl经s.c.接种。在第0、7、14和21天，将pam-扩增的自体同源的vγ9vδ2-t细胞经i.v.过继转移到用ebv-lcl接种后的rag2^-/-γc^-/-小鼠中。用等体积的pbs处理的小鼠被用作对照组。皮下肿瘤用体内成像系统在指定的时间监测。准备用pam-扩增的vγ9vδ2-t细胞或pbs(n=5只/组)处理的小鼠的全身荧光图像。(图3b-3d)用pam-扩增的vγ9vδ2-t细胞(n=10)或pbs(n=11)处理后，测定存活率(图3b)、肿瘤发病率(图3c)和尸检的肿瘤体积(均值±sem)(图3d)。*p<0.05。

图4显示vγ9vδ2-t细胞在ebv-lcl-移植的rag2^-/-γc^-/-小鼠的外周血液中的频度。vγ9vδ2-t细胞在ebv-lcl-移植的rag2^-/-γc^-/-小鼠(n=5)中过继转移后，监测并显示vγ9vδ2-t细胞在外周血液有核细胞中的频度(均值±sem)。nd，未能检测。

图5a-5c显示在携带肿瘤的rag2^-/-γc^-/-小鼠中，vγ9vδ2-t细胞诱导ebv-lpd的消退。(图5a)评价vγ9vδ2-t细胞ebv-lpd在携带肿瘤的rag2^-/-γc^-/-小鼠中的治疗效果的方案。将egfp⁺ebv-lcl经s.c.接种到rag2^-/-γc^-/-小鼠中。21天后，这些携带肿瘤的小鼠的一半用pam-扩增的自体同源的vγ9vδ2-t细胞经i.v.在指定的时间过继转移，而这些小鼠的另一半用pbs处理作为对照。在用vγ9vδ2-t细胞或pbs处理之前，准备小鼠全身荧光图像。(图5b和5c)在用vγ9vδ2-t细胞(n=6)或pbs(n=6)处理后，在指定的时间测定携带肿瘤的rag2^-/-γc^-/-小鼠的肿瘤体积(图5b)和存活率(图5c)。数据为均值±sem。(图5e)ns，没有显著的差异；*p<0.05。

图6显示ebv-lcl-移植的人源化小鼠的外周血液中的vγ9vδ2-t细胞的频度。在ebv-lcl-移植的人源化小鼠中用帕米膦酸盐(pam,n=8)或pbs(n=7)处理后，监测并显示vγ9vδ2-t细胞在外周血液人cd45⁺细胞中的频度(均值±sem)。ns，无显著意义；*p<0.05。

图7a-7e显示vγ9vδ2-t细胞在携带肿瘤的rag2^-/-γc^-/-小鼠中的归巢程序。(图7a)dir-标记的pam-扩增的vγ9vδ2-t细胞在egfp⁺ebv-lcl接种后，被过继转移到患有皮下肿瘤的rag2^-/-γc^-/-小鼠。在注射后的指定时间监测肿瘤部位(egfp⁺)中的vγ9vδ2-t细胞(dir-标记)的迁移和聚集。在用虚线指示的区域测量dir信号的荧光强度(图7a)。数据为均值±sem。在vγ9vδ2-t细胞的过继转移后12小时，肿瘤组织内浸润的vγ9vδ2-t细胞(红)通过共焦荧光显微镜分析。(图7b)vγ9vδ2-t细胞与αccr5，或migg2a预培养30分钟并放置于上孔中。将来自ebv-lcl的上清液加入到下孔。4小时后从上孔已经迁移的细胞百分比(均值±sem)被显示(n=4)。(图7c)测定来自ebv-lcl的上清液中的趋化因子浓度(均值±sem)(n=4)。(图7d)在用抗-ccr5阻断抗体(αccr5)或其同种型对照(小鼠igg2a,migg2a)处理2小时后，显示出ccr5在vγ9vδ2-t细胞上的表面表达。(图7e)dir-标记的pam-扩增的vγ9vδ2-t细胞用αccr5或migg2a预处理2小时，然后过继转移到携带egfp⁺ebv-lcl皮下肿瘤的小鼠中。肿瘤部位(egfp⁺)中的vγ9vδ2-t细胞(dir-标记)的迁移和聚集在注射后24小时被检测到。测定在用虚线指示的区域中的dir信号的荧光强度(图7e)。数据为均值±sem。数据代表3-4次独立的实验。ns，无显著性差异。nd，未检测到；*p<0.05；**p<0.01。

图8a-8d显示帕米膦酸盐的给予控制人源化小鼠中ebv-lpd的发展。(图8a)帕米膦酸盐(pam)控制人源化小鼠中ebv-lpd的方案。人源化小鼠在接种ebv-lcl后第0、7、14、21、28天用pam或pbs处理。(图8b-8d)在用pam(n=8)或pbs(n=7)处理后，在指定的时间测定存活率(图8b)、肿瘤发病率(图8c)和肿瘤体积(图8d)。数据为均值±sem。*p<0.05。

图9a-9c显示帕米膦酸盐不能控制无vγ9vδ2-t细胞的人源化小鼠中的ebv-lpd。在通过用微型磁珠阳性选择进行vδ2-t细胞的双耗尽后，获得vγ9vδ2-t-细胞-耗尽的hupbmc。用来自同一健康人供体的全hupbmc或vγ9vδ2-t-细胞-耗尽的hupbmc移植rag2^-/-γc^-/-小鼠。与用全hupbmc重建的小鼠形成对比，在用vγ9vδ2-t-细胞-耗尽的hupbmc重建的小鼠中缺少或缺乏人vγ9vδ2-t细胞。用全hupbmc(pbmc)或vγ9vδ2-t-细胞-耗尽的hupbmc(pbmc-γδ-t)重建的人源化小鼠用ebv-lcl接种并根据在图8a中所示的方案用帕米膦酸盐或pbs处理。人源化小鼠(pbmc+pam，n=12；pbmc-γδ-t+pam，n=7；pbmc-γδ-t+pbs,n=6)的存活率(图9a)、肿瘤发病率(图9b)和肿瘤体积(图9c)被显示。数据为均值±sem；ns，无显著意义；*,p<0.05。

图10a-10b.vγ9vδ2-t细胞仅仅占来自随机选择的样本的外周血液pbmc的1-5%(均值，3%)(图10a)。(图10a)在pam和il-2的存在下体外培养20天后，vγ9vδ2-t细胞在pbmc中的百分比增加至67-95%(均值，82%)，而图10b显示vγ9vδ2-t细胞扩增了156-309倍(均值，198倍)。数据代表4次独立的实验(图10a和10b)。相比之下，在pam的不存在下，il-2不能诱导vγ9vδ2-t细胞的扩增(图10a和10b)。

图11a和11b.图11a显示在通过选择试剂a和b纯化前后，扩增试剂盒-扩增的vγ9vδ2-t细胞与自体同源的ebv-lcl以不同的比例一起培养4小时。图11b显示对于4次独立的实验，在靶细胞(cd3^-群体)中鉴定为cd3^-和pi⁺的死亡lcl的百分比。

发明详述

本发明提供用于治疗ebv-相关疾病的组合物、方法和试剂盒。

本发明的几个方面参考仅仅用于举例说明目的的实施例，在下文描述。应该理解，提出许多具体的细节、关系和方法以提供对本发明的全面理解。然而，具有相关领域普通技能的人员将容易地认识到本发明可在没有一或多个具体细节的情况下实施或用其它方法、方案、试剂、细胞系和动物实施。本发明不受所举例说明的行为或事件的顺序的限制，因为一些行为可与其它行为或事件以不同的次序和/或同时发生。此外，不是所有举例说明的行为、步骤或事件都需要实施根据本发明的方法。在此描述的或提及的许多技术和程序是本领域技术人员充分理解和使用常规方法通常采用的。

在详细阐明本发明之前，定义几个术语可能有助于其理解，因而这些在下文的下一个章节提出。除非另外限定，本文使用的所有术语、符号和其它科学术语或命名意欲具有本发明所属领域技术人员通常理解的意义。在一些情况下，为了清楚和/或为了容易参考，在此定义具有通常理解的意义的术语，而在此包括的这样的定义不应必然解释为代表与本领域通常理解的有实质上的差别。还应该理解术语，例如常用词典中定义的那些，应该被认为具有与它们在相关领域文献中的意义一致的意义，和/或如本文另外定义的。

i.定义

在此所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方案的目的，并不意欲限制本发明。如本文所用的，不定冠词“一”、“一个”和“该”应被理解为包括复数指代，除非文中另外清楚地指明。

如本文所用的词语"和/或"应被理解为意指如此结合的要素的"任何一个或二者"，即，要素在一些情况下结合地存在，而在其它情况下分开地存在。

如本文所用的，"或"应被理解为具有如上定义的"和/或"相同的意义。例如，当分开项目清单时，"和/或"或者"或"应被解释为包括，即包括许多项目的至少一个，但也包括一个以上的项目，并且任选地包括另外的未列出的项目。只有术语清楚地有相反的指定，例如"仅仅一个"或"正好一个"，或当用于权利要求书时"由…组成"，指包括许多或列出的要素的正好一个要素。一般来说，如本文所用的术语"或"当前面出现排他性术语，例如"任何一个"、"一个"、"仅仅一个"或"正好一个"时，才应被解释为表示排他性选择(即，"一个或另一个而不是二者")。

如本文所用的，术语"包括"、"包含"、"具有"、"含有"、"有"，或其变体，意欲类似于术语"包含"是包括性的。

如本文所用的，术语"受试者"指动物。通常地，术语"受试者"和"患者"在提及受试者时可在此互换使用。因此，“受试者”包括待治疗紊乱/疾病的动物或如在此描述的成分的混合物的接受者。术语“动物”包括，但不限于，小鼠、大鼠、狗、豚鼠、牛、马、鸡、猫、兔、猪、猴、黑猩猩，和人。

所谓“治疗”和"处理"意思是意欲治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状态或紊乱的受试者的医学管理。该术语包括积极治疗，即是说，特别针对疾病、病理状态或紊乱的改善的治疗，并且还包括病因治疗，即是说，针对消除有关的疾病、病理状态或紊乱的病因的治疗。此外，该术语包括姑息治疗，即是说，设计用于缓解症状而不是治愈疾病、病理状态或紊乱的治疗；预防性治疗，即是说，针对尽可能减少或部分地或完全地抑制相关疾病、病理状态或紊乱的发展的治疗；和支持治疗，即是说，用来补充针对相关疾病、病理状态或紊乱的改善的另一种特定疗法的治疗。要理解，治疗，虽然意欲治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状态或紊乱，但不必在实际上导致治愈、改善、稳定或预防。治疗效果可如本文所述和如本领域已知的，按所涉及的疾病、病理状态或紊乱所合适的，进行测量和评价。这样的测量和评价可根据定性和/或定量术语作出。因此，例如，疾病、病理状态或紊乱和/或疾病、病理状态或紊乱的症状的特征或特点可减少到任何影响或任何量。

细胞可以在体外存在。或者，细胞可以在体内并可存在于受试者中。“细胞”可以是来自任何生物体的细胞，包括，但不限于人。

术语组合物的“有效量”指无毒性的、但足以提供所需结果的组合物的量。所需的精确量将在不同的受试者之间变化，取决于受试者的种族、年龄和一般状况，给予模式等。因此，不可能规定精确的“有效量”。然而，适当的有效量可由本领域普通技术人员仅使用常规实验确定。

所公开的组合物的剂量或量大到足以在发生递药的方法中产生所需效果。剂量不应大到引起不利的副作用，如不需要的交叉-反应、过敏反应等。一般来说，剂量将随受试者的年龄、状况、性别和疾病的严重程度而变化并可由本领域技术人员确定。剂量可由各个医师根据受试者受累的临床病症进行调整。剂量、剂量进度和给药途径可以变化。

所谓“药学上可接受的”意指不是生物学上或其它方面不需要的材料，即，材料可与经选择的化合物一起给予受试者，而不引起任何不希望的生物学作用或以有害的方式与药用组合物中所含任何其它组分相互作用。

ii.方法

目前用于ebv-lpd的治疗策略包括恢复ebv-特异性细胞毒性t淋巴细胞(ctl)和用单克隆抗体或化学疗法耗尽b细胞。然而，ebv-特异性ctl的恢复受到难以体外生成足够数量的ebv-特异性ctl且缺乏输注ctl的体内扩增的限制。抗体-介导的靶向ebv-感染的b细胞和化学疗法具有不需要的副作用并导致全身免疫抑制。本发明显示，氨基二膦酸帕米膦酸盐(pam)(在此也称为“帕米膦酸盐”)可通过增强人vγ9vδ2-t-细胞免疫力控制ebv-lpd。由于pam已经用于骨质疏松症治疗几十年了，pam的这种新的应用有效地提供用于治疗ebv-lpd的安全和容易地获得的选项。

最近，建立了具有人外周血液单核细胞(hupbmc)的人源化小鼠。这些小鼠含有功能性人t和b细胞，包括如在人类中发现的、在外周血液中的类似百分比的vγ9vδ2-t细胞(tu等,2011；zheng等,2013b)。pam-扩增的人vγ9vδ2-t细胞对ebv-转化的自体同源的类淋巴母细胞b细胞系(ebv-lcl)在体外和在免疫缺陷rag2^-/-γc^-/-小鼠中的生长的影响被研究，并测定了pam在人源化小鼠中控制ebv-lpd的作用。

在一个方面，本发明提供治疗患有ebv-相关疾病的受试者的方法，其包括给予受试者有效量的pam。

在另一方面，本发明提供治疗患有ebv-相关疾病的受试者的方法，其包括给予受试者有效量的pam-扩增的vγ9vδ2-t细胞。

在本发明的实施方案中，ebv-相关疾病选自淋巴细胞增殖性疾病(lpd)、移植后淋巴细胞增殖性疾病(plpd)、何杰金氏病、伯基特氏淋巴瘤和npc。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，pam或pam-扩增的vγ9vδ2-t细胞与药学上可接受的载体一起给予。此外，本领域技术人员应该理解，描述的治疗方法将不仅应用于治疗受试者，而且可体内、离体或体外应用于细胞培养、器官、组织或单个细胞。

iii.组合物

在另一方面，本发明提供包含pam的药用组合物。

在又一方面，本发明提供包含pam-扩增的vγ9vδ2-t细胞的药用组合物。

在此描述的药用组合物还可包含药学上可接受的载体和/或药学上可接受的赋形剂、添加剂，或辅助剂，以供给予受试者用于治疗或预防。

与在此描述的组合物一起给予和/或包装的载体、辅助剂和添加剂可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些油，例如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等。盐水溶液和含水葡萄糖和甘油溶液也可用作液体载体，特别是可注射溶液。合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、蔗糖、明胶、乳糖、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、甘油、丙二醇、水、乙醇等。药用组合物也可含有湿润剂或乳化剂或助悬剂/稀释剂，或ph缓冲剂，或修饰或维持在此描述的组合物的释放速率的试剂。这些组合物可采取溶液、混悬液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、散剂、缓释制剂等形式。制剂可包括标准载体例如药用级的甘露醇、乳糖、糖精钠、淀粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁等。这样的组合物将含有与合适量的载体一起的有效量的化合物或细胞，以便基于要采用的给药模式提供给患者适当的形式。

如果用于静脉内给药，组合物/细胞被包装在无菌等渗水性缓冲液的溶液中。必要时，组合物也可包括增溶剂。组合物的组分分开地或者混合在一起以单位剂型供应，例如，作为在气封密闭容器(例如标明活性剂的量的安瓿或囊袋(sachette))中的干燥冻干粉末或浓缩液。如果组合物/细胞要通过输注给予，它们可用含有无菌药用级水或盐水的输注瓶分发。当组合物或细胞通过注射给予时，可提供无菌水或盐水的安瓿，以便各成分可在注射前混合。

iv.试剂盒

上述组合物，以及其它材料，可以任何合适的组合包装在一起，作为用来实施，或帮助实施所公开方法的试剂盒。如果在给定的试剂盒中的成分被设计且适合在所公开的方法中一起使用时，则它是有用的。例如，本发明的试剂盒被用于激活和扩增免疫细胞的亚群。试剂盒可包含扩增调节剂、固体支持物和选择剂。

在一些实施方案中，免疫细胞的亚群包含vγ9vδ2-t细胞。扩增调节剂可包含具有刺激t细胞扩增的能力的药物，例如氨基二膦酸帕米膦酸盐。固体支持物可包含微型磁珠。选择剂可具有对特定的免疫细胞群的亲和力并可包含一种或多种抗体、一种或多种肽，和/或一种或多种核酸分子。此外，选择剂可结合于固体支持物。同样，试剂盒可包括一或多个填充有试剂和/或本发明的一种或多种组分的容器。提供的试剂盒的一或多个容器也可包含抗体、肽，或核酸分子，优选呈现纯化的形式。在一些实施方案中，组分可以分开的容器提供，以便在使用前混合。试剂盒也可包含对照组合物以便用作实验中的对照试剂。如将为本领域技术人员所理解的，当用于实验或实验室设置时，检测或标记方法可用于提供的试剂盒。为此目的，试剂盒可另外地提供用于流式细胞术分析的一种或多种试剂。

以下是可包括在试剂盒中的用法说明书的实例并且也提供所公开的材料、试剂和方法的实施例的描述。

1.1背景

γδ-t细胞组成在成人的血液和外周器官中的1-10%的t淋巴细胞。在健康成人的外周血液和淋巴器官中的大多数γδ-t细胞是vγ9vδ2-t细胞(chien等,annrevimmunol32:121-155(2014))。药用化合物，例如通常用来治疗骨质疏松症的氨基二膦酸帕米膦酸盐，可诱导ipp的细胞内聚集，导致人vγ9vδ2-t细胞的激活和扩增。人vγ9vδ2-t细胞可在体外和在人源化小鼠体内发挥广泛的抗病毒和抗肿瘤活性(xiang等,cancercell26(4):565-576(2014)；li等,cellmolimmunol10(2):159-164(2013)；qin等,jinfectdis205(11):1646-1653(2012)；tu等,jexpmed208(7):1511-1522(2011)；qin等,jvirol85(19)10109-10116(2011)；qin等,jinfectdis200(6):858-865(2009))。氨基二膦酸帕米膦酸盐可通过增强人vγ9vδ2-t-细胞免疫力控制ebv-lpd。帕米膦酸盐提供一种治疗ebv-lpd的安全和容易地获得的选项(dharnidharka等,nejm372(6):569-571(2015)；xiang等,cancercell26(4):565-576(2014))。

这种试剂盒尤其用于扩增和选择具有高纯度和显著激活水平的人vγ9vδ2-t细胞，以供临床应用于治疗ebv-相关疾病，例如ebv-引起的b细胞淋巴细胞增殖性疾病(ebv-lpd)。首先，在人外周血液单核细胞(hpbmc)中的vγ9vδ2-t细胞特别地通过使用扩增试剂a(帕米膦酸盐)扩增，然后vγ9vδ2-t细胞的增殖受到扩增试剂b(人重组白介素-2)的支持。其次，扩增的-人vγ9vδ2-t细胞通过使用选择试剂a(抗-tcrγ/δ半抗原抗体)和b(抗-半抗原微型磁珠)进行选择和纯化。最后，vγ9vδ2-t细胞的纯度或百分比通过检测试剂(a与b或a与c)检测。在一优选的实施方案中，检测试剂a由pe抗-人cd3抗体组成，检测试剂b由apc抗-人tcrvγ9抗体组成，和检测试剂c由fitc抗-人tcrvd2抗体组成。

1.2应用实施例

•使用帕米膦酸盐自体外-扩增的细胞培养物扩增、纯化和激活人vγ9vδ2-t-细胞。大量的高度纯化的-人vγ9vδ2-t-细胞被收集以供临床用于治疗ebv-相关疾病，特别是ebv-lpd。

•具有高度激活和细胞毒性活性的人vγ9vδ2-t-细胞的功能性分析，如有关细胞因子分泌、抗原识别和细胞信号传导的研究。

1.3基本试剂和器械

•细胞培养基：含有10%热灭活的胎牛血清(fbs；invitrogen)的roswellparkmemorialinstitute(rpmi)-1640(invitrogen)。

•缓冲液：磷酸盐缓冲的盐水(pbs)ph7.2。在选择步骤中，pbs补充有0.5%fbs并在执行实验期间保持冷却。

•选择柱和分离器：使用ls柱(macs)纯化vγ9vδ2-t-细胞，并可通过磁性分离器(macs)富集vγ9vδ2-t-细胞。

2.方案

2.1人外周血液单核细胞准备

通过ficoll-paque(gehealthlifescience)梯度离心，从血沉棕黄层制备物或抗凝外周血液，分离hpbmc。

2.2扩增人vγ9vδ2-t细胞

1.用预热的pbs洗涤分离的pbmc，用50ml预热的pbs再悬浮细胞沉淀。

2.测定细胞数。

3.对于各孔(6-孔板)等分10~20×10⁶个细胞的试样并再悬浮于补充有15μl扩增试剂a的5ml细胞培养基中。

4.于37℃、5%co2培养细胞2天。

5.在第3天，收集细胞并以1200rpm离心10min。然后使细胞再悬浮于含有15ul扩增试剂a和25ul扩增试剂b的新鲜细胞培养基中。

6.从第3天起，每3天加入25ul扩增试剂b。在15~20天培养后，可收集扩增的vγ9vδ2-t-细胞以供将来使用。

2.3人vγ9vδ2-t细胞的选择

1.用温热的pbs洗涤扩增的vγ9vδ2-t-细胞，然后再悬浮于补充有0.5%fbs的pbs中。

2.测定细胞数。

3.通过以1200rpm离心10min收集细胞。完全弃去上清液。

4.使细胞再悬浮（40μlpbs/10⁷个总细胞）。

5.对于10⁷个细胞需要10μl选择试剂a。

6.充分混合并于4℃培养10min。

7.加入30μlpbs和20μl选择试剂b/10⁷个细胞。

8.充分混合并于4℃培养15min。

9.通过加入1-2mlpbs/10⁷个细胞洗涤细胞并以1200rpm离心10min。完全吸掉上清液。

10.将至多10⁷个细胞再悬浮于500μlpbs中。

11.将选择柱放置在选择分离器的磁场中。

12.通过用3mlpbs淋洗准备柱。

13.用pbs洗涤柱3次。

14.从分离器移除柱并将其置于合适的收集管上。

15.将5mlpbs吸入柱上。通过稳固地应用随柱提供的活塞，立即冲洗出具有vγ9vδ2-t-细胞的流分。

16.测定细胞数。

2.4检测人vγ9vδ2-t细胞

1.从细胞培养物或纯化的-vγ9vδ2-t-细胞收集1.0×10⁶个细胞，以供检测vγ9vδ2-t-细胞的百分比或纯度。

2.用1mlpbs洗涤细胞并以1200rpm离心10min。

3.弃去上清液并再悬浮细胞于100μlpbs中。

4.将5μl检测试剂a和b(a和c或b和c)加入到溶液中。然后于室温下、暗处培养15min。

5.用1mlpbs洗涤细胞并以1200rpm离心10min。

6.将细胞再悬浮于200μlpbs中，然后通过流式细胞术(bdlsrii)收集数据。

7.使用flowjo软件(treestar)分析数据。

实施例

材料和方法

体外建立ebv-lcl

在获得知情同意后，从ebv-血清阳性健康供体的血沉棕黄层分离hupbmc。该研究方案由香港大学机构审查委员会/香港西部医院管理局(institutionalreviewboardoftheuniversityofhongkong/hospitalauthorityhongkongwestcluster)批准。ebv-lcl如前所述建立(lacerda等,1996)。简言之，用来自携带增强的绿色荧光蛋白(egfp，由dianehayward,johnshopkinsuniversity,baltimore友情提供)的ebv-分泌细胞系b95-8或b95.8ebfav-gfp的上清液感染hupbmc(speck和longnecker,1999)，然后在补充有15%热灭活的fbs的rpmi1640中培养。

vγ9vδ2-t细胞的体外扩增和纯化

如前所述生成帕米膦酸盐-扩增的vγ9vδ2-t细胞(tu等,2011)。简言之，在补充有10%fbs的rpmi1640培养基中培养hupbmc。在第0天和第3天加入帕米膦酸盐至最终浓度9μg/ml。从第3天起，每3天加入重组人il-2(invitrogen)至最终浓度500ui/ml。在培养14天后，通过用抗-tcrγ/δ微型磁珠或tcrγ/δ⁺t细胞分离试剂盒(miltenyibiotec)阳性选择或阴性选择，纯化vγ9vδ2-t细胞。如通过流式细胞术，使用抗-cd3和抗-vδ2mabs所确定的，vγ9vδ2-t细胞的纯度始终>97%。

ebv-lpd模型的建立和ebv-lpd在人源化和rag2^-/-γc^-/-小鼠中的处理

所有动物研究被批准并按照香港大学，教学和研究中活动物使用委员会的实验动物使用指南执行。通过ebv血清阳性全hupbmc或vγ9vδ2-t-细胞-耗尽的hupbmc的重建，在4-5周龄雄性或雌性rag2^-/-γc^-/-小鼠中生成人源化小鼠，如我们之前所述(tu等,2011)。在hupbmc移植4周后，小鼠成功地接受移植物并用功能性人免疫系统稳定(tu等,2011)，然后用来建立ebv-lpd。人源化小鼠或6-8周龄rag2^-/-γc^-/-小鼠经s.c.接种ebv-lcl或egfp-表达ebv-lcl(0.1×10⁶/小鼠)。对于rag2^-/-γc^-/-小鼠，在指定的时间，将在200μlpbs中的帕米膦酸盐-扩增的自体同源的vγ9vδ2-t细胞(10×10⁶/小鼠)经i.v.过继转移至用ebv-lcls接种后的小鼠。对于人源化小鼠，在指定的时间，经i.p.注射人等效剂量的pam(10mg/kg体重；pamisol；hospiraaustriliaptyled)。用等体积的pbs处理的小鼠被用作对照。监测疾病的体征(活动丧失、体重减轻、毛发竖起、可触及的肿瘤，和腹水)和小鼠的存活率。处死具有超过17mm直径的皮下肿瘤的小鼠并作为垂死计算。否则，小鼠继续100或170天，然后处死。检查所有的小鼠的肿瘤的尸检证据。收集肿瘤和器官以供组织学和免疫组织化学分析。

用dir-标记的vγ9vδ2-t细胞的体内跟踪

用dir(invitrogen)对vγ9vδ2-t细胞染色，然后将这些dir-标记的细胞经静脉内过继转移至携带皮下egfp-ebv肿瘤的小鼠中。目测vγ9vδ2-t细胞的迁移和聚集并在指定的时间用tm2体内成像系统(crimaestro)分析。在12hr后，杀死一些小鼠，肿瘤切片被急速冻结并用抗-人tcrγ/δmab(5μg/ml；b-1,biolegend)染色。这些低温冷冻切片用共焦激光扫描显微镜(lsm700,carlzeiss)分析。

趋化性分析

纯化的vγ9vδ2-t细胞的体外迁移以跨孔系统(24-孔；孔径，5.0μm；聚碳酸酯膜；corning-costar)评价，如我们之前所述的(qin等,2011)。简言之，收集得自ebv-lcl在rpmi1640培养基中培养24hr后的上清液，并加载到下部隔室中。将无血清的rpmi1640培养基中的总共100μl自体同源的vγ9vδ2-t细胞(4x10⁵)加入到所述室的上部隔室中。4hr后，收集已通过膜迁移至下部隔室的细胞并用通过流式细胞术，用计数珠计数。vγ9vδ2-t细胞在对照组(仅γδ-t细胞)中的迁移被设定为100%，而从其它处理组或同种型对照组获得的结果表示为对照的百分比。在阻断实验中，vγ9vδ2-t细胞与抗-ccr5mab(20μg/ml；克隆2d7，bd)或者同种型对照小鼠igg2a(20μg/ml)mab一起预培养30min。

细胞毒性分析

ebv-lcl的死亡(目标)在与自体同源的vγ9vδ2-t细胞(效应子)以不同的e:t比例共同培养4-6hr后，用流式细胞术分析。在一些实验中，如发明人先前所做的，使用跨孔系统(24孔；孔径，0.4mm；corning-costar)分离vγ9vδ2-t细胞与ebv-lcl(qin等,2009)。在一些实验中，使用中和抗体抗-nkg2d(10μg/ml；149810,r&d系统)、抗-fas-l(10μg/ml；nok-1,biolegend)、抗-trail(10μg/ml；rik-2,biolegend)和同种型对照小鼠igg1(10μg/ml)以阻断nkg2d-、fasl-和trail-介导的途径(qin等,2009)。对于mica/b固定化，用重组mica/b蛋白(sinobiologicalinc.)涂布24-孔板过夜。仔细洗涤板以除去未结合的蛋白，然后与vγ9vδ2-t细胞一起培养6hr。为阻断穿孔素和脱粒酶b，如发明人先前所做的，使用穿孔素抑制剂刀豆素a(concanamycina)(cma)(1μg/ml；sigma)和脱粒酶b失活剂bcl-2(1μg/ml；r&dsystems)(qin等,2009)。细胞毒性用流式细胞术分析并计算为相对于对照的抑制作用的百分比。细胞用抗-cd3染色以鉴定vγ9vδ2-t细胞，而pi被用来鉴定死亡细胞。ebv-lcl的死亡被显示为pi+细胞在cd3-群体中的百分比(qin等,2009)。

组织病理学和免疫组织化学

待分析的肿瘤和器官的样本在10%福尔马林中固定，包埋在石蜡中，切片并用苏木精和伊红染色。为研究ebv的存在，组织用小鼠抗ebvlmp1(ab58938,abcam)染色，而人b细胞在组织中的存在使用兔抗人cd20(ep459y，abcam)，通过免疫过氧化物酶技术评价。淋巴瘤细胞的增殖率和侵袭性通过ki67(ab136912,abcam)的组织学染色指示。通过二氨基联苯胺检测试剂盒(dab-0031,maixin)进行免疫染色的可视化，然后切片用苏木精复染色。

原位杂交

检测厄泼斯坦-巴尔编码的小rnas1和2型(eber-1/2)的得自肿瘤和小鼠器官的石蜡切片的原位杂交，根据制造商的方案，使用dig-hrprembrandt®eberish试剂盒(tzartos等,2012)(a500k.9901,panpath)进行。

流式细胞术分析

用以下抗体染色细胞的表面标记物：抗-cd3(hit3a)、抗-tcrvδ2(b6)、抗-cd69(fn50)、抗-nkg2d(1d11)、抗-fas(dx2)、抗-cd107a(h4a3)、抗-fasl(nok-1)、抗-trail(rik-2)、抗-mica/b(6d4)、抗-dr4(djr1)、抗-dr5(djr2-4)、抗-ccr5(2d7)。对于细胞内染色，细胞被固定，渗透化，然后用抗-穿孔素(δg9)和抗-脱粒酶b(gb11)抗体(bd)或它们的相关同种型对照染色，如前所述的(qin等,2009；tu等,2011)。所有的样本在facslsrii(bd)上获得并用flowjo软件(treestar)分析。

flowcytomix分析

检测趋化因子在得自ebv-lcl培养的上清液中的浓度并用人趋化因子分析试剂盒(bendermedsystems)分析，如前所述的(zheng等,2013b)。

统计学分析

数据表示为均值±sem。用于体外实验的细胞死亡和病毒拷贝的差别，和pbs和治疗组之间的荧光强度、肿瘤发病率、肿瘤大小用非配对双尾student’st检验分析。对于存活率差异的p值用kaplan-meier对数秩检验确定。p<0.05被认为是有显著意义的。

本文提及或引用的所有的专利、专利申请、临时申请和出版物通过参考以其全文，包括所有的附图和表格，结合到本文中，至与本申请的明确教导完全一致的程度。

以下是说明实施本发明的程序的实施例。这些实施例不应被视为是限制。所有的百分比均以重量计并且所有的溶剂混合比例以体积计，除非另外指明。

在移植后，厄泼斯坦-巴尔病毒-诱导的淋巴细胞增殖性疾病(ebv-lpd)仍然是严重的和威胁生命的并发症。在提供的实施例中，显示氨基二膦酸帕米膦酸盐(pam)-扩增的人vγ9vδ2-t细胞通过γ/δ-tcr和nkg2d受体触发，和fas和trail结合(engagement)，有效地杀死ebv-转化的自体同源的类淋巴母细胞b细胞系(ebv-lcl)。通过ebv-lcl在rag2^-/-γc^-/-小鼠和人源化小鼠中的接种，建立具有接近于人类疾病特征的致死性ebv-lpd。pam-扩增的vγ9vδ2-t细胞单独的过继转移有效地防止rag2^-/-γc^-/-小鼠中的ebv-lpd并在携带ebv⁺肿瘤的rag2^-/-γc^-/-小鼠中诱导ebv-lpd消退。pam治疗通过vγ9vδ2-t细胞的选择性激活和扩增抑制ebv-lpd在人源化小鼠中的发展。该研究提供了通过vγ9vδ2-t-细胞靶向，使用pam控制ebv-lpd的治疗方法的原理证明。

实施例1.vγ9vδ2-t细胞体外杀死ebv-lcl

ebv-lcl当与其正常的自体同源的b细胞比较时，显示升高的压力诱导的主要组织相容性复合体i型-相关蛋白a和b(mica/b)的表达、fas和tnf-相关的细胞凋亡-诱导的配体(trail)受体2(dr5)表达(图1a)。相反，正常的b细胞和ebv-lcl二者有很少的甚或没有fasl和trail受体1(dr4)在细胞表面上的表达(图1a)。与发明人先前的报道(li等,2013；tu等,2011)一致，帕米膦酸盐诱导vγ9vδ2-t细胞的选择性激活和扩增，和cd69、nkg2d、fas配体(fasl)、trail和细胞内溶胞性颗粒、穿孔素和脱粒酶b在vγ9vδ2-t细胞中的表面表达的上调(图2a-2c)。相反，ebv-lcl单独不能有效地扩增来自ebv-血清阳性供体的vγ9vδ2-t细胞(图2d)。

帕米膦酸盐-扩增的vγ9vδ2-t细胞通过用抗-tcrγ/δ微型磁珠或tcrγ/δ⁺t细胞分离试剂盒阳性或阴性选择纯化，然后与自体同源的ebv-lcl共同培养。如在图1b中所示，通过阴性选择分选的帕米膦酸盐-扩增的vγ9vδ2-t细胞只具有对抗ebv-lcl的较少细胞毒性活性，而通过阳性选择分选的帕米膦酸盐-扩增的vγ9vδ2-t细胞具有明显更高的对抗ebv-lcl的细胞毒性活性。此外，通过阳性选择分选的vγ9vδ2-t细胞比通过阴性选择分选的那些具有更高的cd69、fas、fasl、trail、脱粒酶b表达(图2e)。这些结果表明最近的γ/δ-t细胞受体(tcr)结合提高它们对抗ebv-lcl的激活作用和细胞毒性。

通过阳性选择分选的帕米膦酸盐-扩增的vγ9vδ2-t细胞以剂量依赖性方式呈现有效的对抗ebv-lcl的细胞毒性，但如果任何对抗正常b细胞的杀死活性则显示有限性(图1c)。这种细胞毒性需要细胞-细胞直接接触，如由跨孔实验所表明的(图1d)。固定化重组mica/b促进vγ9vδ2-t细胞激活，特别是对于根据cd69、nkg2d、fas、fasl、trail、穿孔素或脱粒酶b的表达，通过阳性选择分选的细胞(图2e)。明显的颗粒胞外分泌，如通过增加cd107a的表面表达所证实的，在固定化mica/b刺激时，也在vγ9vδ2-t细胞中检测到(图1e)。与颗粒胞外分泌同时，固定化mica/b显著提高vγ9vδ2-t细胞对抗ebv-lcl的细胞毒性活性(图1f)。事实上，通过阳性选择分选的vγ9vδ2-t细胞的颗粒胞外分泌和细胞毒性的水平比在固定化mica/b刺激时通过阴性选择分选的细胞的水平高得多(图1e和1f)。这些数据提示mica/b表达的ebv-lcl可提高vγ9vδ2-t细胞，尤其是通过阳性选择分选的那些细胞的激活作用和细胞毒性活性。因此，用γ/δ-tcr阳性选择纯化的帕米膦酸盐-扩增的vγ9vδ2-t细胞被用于随后的实验。

使用适宜的中和抗体阻断nkg2d、fasl和trail显著地抑制vγ9vδ2-t细胞对抗ebv-lcl的溶胞活性(图1g)。为证实涉及在ebv-lcl被vγ9vδ2-t细胞杀死时的溶胞颗粒释放，使用了穿孔素-特异性抑制剂刀豆素a(cma)和脱粒酶b失活剂bcl-2。如在图1g中所示，vγ9vδ2-t细胞对抗ebv-lcl的溶胞活性在cma或bcl-2处理后被强烈地抑制。这些结果表明vγ9vδ2-t细胞对抗ebv-lcl的细胞毒性依赖于nkg2d激活，并由fas-fasl、trail-dr5和穿孔素-脱粒酶b途径介导。此外，帕米膦酸盐单独并未显示任何对抗ebv-lcl的细胞毒性活性(图2f)，但它能提高ebv-lcl识别受体和细胞毒性分子在vγ9vδ2-t细胞中的表达(图2g)。合起来说，发明人的结果表明帕米膦酸盐-扩增的vγ9vδ2-t细胞可有效地杀死ebv-lcl。

实施例2.vγ9vδ2t细胞在rag2^-/-γc^-/-小鼠中预防ebv-lpd

用egfp-标记的ebv感染的人b细胞被用来建立egfp⁺ebv-lcl，以监测ebv-lcls的体内生长。ebv-lpd模型还在皮下(s.c.)接种egfp-表达ebv-lcl(0.1x10⁶/小鼠)后的rag2^-/-γc^-/-免疫缺陷小鼠中建立(图3a)(lacerda等,1996)。为确定人vγ9vδ2-t细胞是否能体内预防ebv-lpd，高度纯化(>97%)的帕米膦酸盐-扩增的自体同源的vγ9vδ2-t细胞(10x10⁶个细胞/小鼠)在egfp-表达ebv-lcl接种后第0、7、14和21天经静脉内(i.v.)过继转移到rag2^-/-γc^-/-小鼠中(图3a)。pbs-处理的小鼠用作对照。

在用ebv-lcl接种后，所有对照小鼠发生ebv-lpd。在用ebv-lcl接种后，ebv-lcl的快速生长在pbs-处理的小鼠中经皮下通过体内成像检测到，并且所有的对照小鼠产生皮下实体肿瘤。在组织学上，这些肿瘤是免疫母细胞淋巴瘤且衍生自人b细胞，如通过对人cd20阳性染色所证实的。肿瘤细胞具有高表达水平的ebv隐藏膜蛋白1(lmp1)和小ebv-编码的rnas1/2型(eber-1/2)表达。此外，肿瘤在肝、肾和肺中的转移通过cd20、lpm1和eber-1/2表达的组织学和免疫表型分析所证实。结果，11只pbs-处理的小鼠中的9只(82%)在ebv-lcl接种后60天内死亡(图3b)。

vγ9vδ2-t细胞的过继转移显著地提高ebv-lcl-移植的免疫缺陷小鼠的存活率(图3b)。事实上，具有过继转移vγ9vδ2-t细胞的10只小鼠中只有1只在100天的观察期间死亡(图3b)，而10小鼠中只有2只在ebv-lcl接种90天后产生皮下实体肿瘤(图3c)。在过继转移vγ9vδ2-t细胞后，这些细胞可在ebv-lcl-移植小鼠的外周血液中持续至多98天(图4)。cd20、lpm1和eber-1/2表达的组织学和免疫表型分析显示，除了1只小鼠在第60天死亡外，在ebv-lcl接种后100天后，在vγ9vδ2-t细胞-处理的小鼠的肝、肾和肺的尸检中未有肿瘤转移的证据。重要的是，当与pbs-处理的小鼠比较时，接受vγ9vδ2-t细胞的小鼠的皮下肿瘤体积显著地减小(图3d)。残留肿瘤的组织学和免疫表型分析进一步显示，接受vγ9vδ2-t细胞的小鼠中的b-细胞淋巴瘤具有比pbs-处理的小鼠更少的ki67-阳性细胞，表明在vγ9vδ2-t细胞-处理的小鼠中残留的肿瘤细胞具有比pbs-处理的小鼠更低的增殖能力。这些数据证实帕米膦酸盐-扩增的vγ9vδ2-t细胞单独可有效地预防rag2^-/-γc^-/-小鼠中的ebv-lpd。

实施例3.vγ9vδ2-t细胞诱导ebv-lpd在携带肿瘤的rag2^-/-γc^-/-小鼠中的消退

为确定vγ9vδ2t细胞是否对小鼠的ebv-lpd具有治疗效果，将egfp-表达ebv-lcl(0.1x10⁶/小鼠)经s.c.接种到rag2^-/-γc^-/-小鼠中(图5a)。21天后，所有的小鼠发生大的皮下肿瘤(中位数表面面积，137mm²)，如通过体内成像检测的(图5b)。然后这些携带肿瘤小鼠的一半在第21、28、35和42天，用高度纯化的帕米膦酸盐-扩增的自体同源的vγ9vδ2-t细胞(10x10⁶个细胞/小鼠)经i.v.过继转移，而这些携带肿瘤小鼠的另一半用pbs处理作为对照(图5a)。pbs-处理的小鼠具有进行性生长的皮下肿瘤并延及腹腔、肝和肾(数据未显示)，最终在ebv-lcl接种后43天内造成死亡(图5b-5c)。相比之下，vγ9vδ2-t-细胞治疗抑制肿瘤生长，且6只小鼠中只有1只在ebv-lcl接种后第107天死亡(图5b和5c)。6只vγ9vδ2-t-细胞-处理的小鼠中的其它5只在ebv-lcl接种后超过170天仍存活(图5c)。此外，vγ9vδ2-t细胞治疗显著地减少这5只小鼠的皮下肿瘤的体积(图5b)。在第170天，处死存活的5只小鼠并进行完整的尸检，在这些存活的小鼠中未发现肿瘤在其它器官中转移的证据。与在pbs-处理的小鼠中具有大量ki67-阳性细胞的完整的b-细胞淋巴瘤形成对比，组织学和免疫表型分析显示在得自vγ9vδ2-t细胞-处理的小鼠的一些残留肿瘤中的大面积的坏死伴有钙化和交错的纤维组织和罕见的ki67-阳性细胞。这些结果表明帕米膦酸盐-扩增的vγ9vδ2-t细胞可诱导rag2^-/-γc^-/-小鼠中的ebv-lpd的消退。

实施例4.vγ9vδ2-t细胞优先归巢至皮下肿瘤部位

为评价vγ9vδ2-t细胞归巢至皮下肿瘤部位，高度纯化的帕米膦酸盐-扩增的自体同源的vγ9vδ2-t细胞用亲脂性染料(dir)标记，然后经i.v.注射到用egfp-表达ebv-lcl建立的携带肿瘤小鼠中。体内成像显示，dir-标记的vγ9vδ2-t细胞从注射后12hr开始迁移到肿瘤部位并在注射vγ9vδ2-t细胞后72hr在肿瘤部位周围积聚至峰水平(图7a)。肿瘤切片的共焦荧光显微镜分析揭示在注射后12hr，vγ9vδ2-t细胞浸润肿瘤。这些数据证实vγ9vδ2-t细胞可优先地迁移至小鼠的皮下肿瘤部位。

为测定与vγ9vδ2-t细胞的迁移有关的机制，检查趋化因子在ebv-lcl中的产生和趋化因子受体在vγ9vδ2-t细胞中的表达。ebv-lcl分泌相对高水平的ccr5配体，即mip-1α(ccl3)、mip-1β(ccl4)和rantes(ccl5)，但仅有很少的甚或没有其它趋化因子(mcp-1、il-8、g-csf、mig和ip-10)(图7c)。大多数vγ9vδ2-t细胞表达ccr5。由得自ebv-lcl的上清液诱导的迁移被ccr5中和抗体在跨孔趋化性试验中被废除(图7b)。体内成像进一步显示，当ccr5被其中和抗体阻断时，vγ9vδ2-t细胞向肿瘤部位的迁移被明显地阻止(图7d和7e)。这些结果证实vγ9vδ2-t细胞向肿瘤部位的迁移主要由ccr5及其配体介导。

实施例5.帕米膦酸盐控制ebv-lpd在人源化小鼠中的发生

先前已证实帕米膦酸盐可选择性地扩增人vγ9vδ2-t细胞，但在体外和在人源化小鼠中对任何其它细胞子群，例如cd4、cd8、b或nk细胞没有这样的作用(tu等,2011)。发明人然后研究了帕米膦酸盐在通过体内扩增vγ9vδ2-t细胞而具有稳定的hupbmc重建的人源化小鼠中是否可控制ebv-lpd。在用ebv-lcl(1x10⁵/小鼠)经s.c.接种后，人源化小鼠在ebv-lcl接种后第0、7、14、21和28天用帕米膦酸盐(10mg/kg体重)经腹腔内(i.p.)注射(图8a)。pbs-处理的小鼠被用作对照。类似于rag2^-/-γc^-/-小鼠，所有的pbs-处理的人源化小鼠在ebv-lcl接种后产生具有皮下肿瘤的ebv-lpd。这些肿瘤细胞对于人cd20、lmp1和eber-1/2是阳性的。如在rag2^-/-γc^-/-小鼠中，在人源化小鼠的肝、肾和肺中发现肿瘤转移。由于ebv-lpd，所有人源化小鼠在观察的100天内死亡。

用帕米膦酸盐治疗显著地增加vγ9vδ2-t细胞在外周血液中的频度，而在ebv-lcl-移植的人源化小鼠中，细胞可持续至多98天(图6)。帕米膦酸盐治疗也显著地延长人源化小鼠的存活率(图8b)。在帕米膦酸盐治疗组中，8只小鼠中只有1只(12.5%)死亡和8只小鼠中的3只(37.5%)在100天内具有皮下肿瘤生长。重要的是，接受帕米膦酸盐治疗的人源化小鼠具有与pbs-处理的人源化小鼠相比明显更低的肿瘤发病率并减少的肿瘤体积(图8c和8d)。在第100天，杀死存活的7只小鼠，全部尸检未能显示肿瘤在其它器官中转移的任何证据。残留的肿瘤的组织学和免疫表型分析显示，接受vγ9vδ2-t细胞的小鼠中的b-细胞淋巴瘤比pbs-处理的小鼠具有更少的ki67-阳性细胞，表明在vγ9vδ2-t细胞-处理的小鼠中的残留的肿瘤细胞比pbs-处理的小鼠具有更低的增殖能力。这些数据证实帕米膦酸盐可有效地控制人源化小鼠中ebv-lpd的产生。

实施例6.帕米膦酸盐不能控制无vγ9vδ2-t细胞的人源化小鼠的ebv-lpd

为进一步确定帕米膦酸盐控制ebv-lpd是否通过人源化小鼠中的vγ9vδ2-t细胞介导，使用重建vγ9vδ2-t-细胞-耗尽的hupbmc的小鼠(tu等,2011)。用全hupbmc或vγ9vδ2-t-细胞-耗尽的hupbmc重建的小鼠用ebv-lcls经s.c.接种并用帕米膦酸盐(10mg/kg体重)在ebv-lcl接种后第0、7、14、21和28天经i.p.注射。用帕米膦酸盐治疗在具有全hupbmc的人源化小鼠中显著地延长存活率(图9a)，减少肿瘤的发生(图9b)和减少肿瘤体积(图9c)。相反，帕米膦酸盐在用vγ9vδ2-t-细胞-耗尽的hupbmc重建的人源化小鼠中没有这样的效果。这些结果证实，用帕米膦酸盐控制人源化小鼠中的ebv-lpd主要由vγ9vδ2-t-细胞依赖性机制介导。

实施例7.扩增vγ9vδ2-t细胞

通过ficoll-paque(gehealthlifescience)梯度离心，从血沉棕黄层制备物或抗凝外周血液分离人pbmcs。pbmcs在补充有15ul扩增试剂a的10%fbs-rpmi1640中培养；从培养后第3天加入25ul扩增试剂b。vγ9vδ2-t细胞在整个培养细胞中的百分比和倍数变化通过流式细胞术，使用检测试剂a和c检查(图10a-10b)。vγ9vδ2-t细胞仅占得自随机选择的样本的外周血液pbmc的1-5%(均值,3%)(图10a)。(图10a)在pam和il-2的存在下体外培养20天后，vγ9vδ2-t细胞在pbmcs中的百分比增加至67-95%(均值,82%)和图10b显示vγ9vδ2-t细胞扩增156-309倍(均值，198倍)。数据代表4次独立的实验(图10a和10b)。比较起来，il-2在pam的存在下，不能诱导vγ9vδ2-t细胞的扩增(图10a和10b)。

新鲜的pbmcs在扩增试剂的存在下培养20天。细胞经选择试剂a和b被进一步纯化。在选择试剂盒后体外扩增的vγ9vδ2-t细胞的纯度始终超过97%。

在用选择试剂a和b纯化之前和之后，扩增试剂盒-扩增的vγ9vδ2-t细胞与自体同源的ebv-lcls以不同的比例一起培养4小时(图11a)。通过选择试剂纯化的扩增试剂盒-扩增的vγ9vδ2-t细胞与自体同源的ebv-lcl或正常的b细胞以不同的e:t比例共同培养。对于4次独立的实验，在靶细胞(cd3^-群体)中鉴定为cd3^-和pi⁺的死亡lcls的百分比在图11b中示出。因此，选择的vγ9vδ2-t细胞有效地识别和杀死体外肿瘤细胞(ebv-lcls)。vγ9vδ2-t细胞显示有效的对抗自体同源的ebv-lcls的杀灭功能。细胞毒性也呈现剂量依赖性方式(图11b)。对于ebv-转化的人b细胞(目标，t)，vγ9vδ2-t细胞(效应子，e)甚至在共同培养4h后，以20:1的e/t比例杀死至多35%的ebv-lcls。然而，激活的vγ9vδ2-t细胞当与正常人b细胞共同培养时，未显示显著的细胞毒性活性。

讨论

免疫缺陷小鼠被广泛用作ebv研究的临床前模型，这是由于用人ebv-lcl接种的这些小鼠可快速地产生具有类似于出现于免疫功能受损患者的那些的特征的致死性人ebv-lpd(funakoshi等,1994；lacerda等,1996)。通过在免疫缺陷rag2^-/-γc^-/-小鼠中接种人ebv-lcl，发明人在这些小鼠中建立了致死性ebv-lpd。使用这种模型，发明人证实帕米膦酸盐-扩增的人vγ9vδ2-t细胞单独的过继转移不仅有效地预防rag2^-/-γc^-/-小鼠的ebv-lpd，而且还在携带ebv-诱导的肿瘤的rag2^-/-γc^-/-小鼠中引起ebv-lpd的消退。rag2^-/-γc^-/-小鼠中缺乏人免疫系统妨碍ebv-lpd的发病机理、预防和治疗的评价，但这可通过用hupbmc或cd34⁺干细胞重建来回避(lim等,2007；ma等,2011)。最近发明人通过在rag2^-/-γc^-/-小鼠中的hupbmc的重建，建立了具有功能性人免疫系统的人源化小鼠(tu等,2011；zheng等,2013b)。这些人源化小鼠含有功能性人t和b细胞，包括如在人体中见到的vγ9vδ2-t细胞在外周血液中的类似百分比(tu等,2011；zheng等,2013b)。在这项研究中，发明人还通过接种人ebv-lcl在这些人源化小鼠中诱导致死性ebv-lpd，并且在这个模型中显示通过体内选择性激活和扩增vγ9vδ2-t细胞，帕米膦酸盐治疗抑制了ebv-lpd的产生。

虽然已经显示人γδ-t细胞具有抗病毒和抗肿瘤活性(bonneville等,2010；kabelitz等,2007)，支持它们对ebv的反应性的数据仍然是缺乏的(kong等,2009；kotsiopriftis等,2005)。虽然一项研究已经描述了用vδ1+γδ-t细胞克隆体外识别ebv-lcl(orsini等,1994)，但ebv-lcl通常在使用vγ9vδ2-t细胞的体外细胞毒性分析中被用作阴性对照。因此，发明人用通过阴性选择分选的帕米膦酸盐扩增的vγ9vδ2-t细胞证实ebv-lcl杀灭的缺乏，但出人意料地揭示了在使用抗-tcrmab阳性分选后，由相同的细胞子群对抗ebv-lcl的显著的细胞毒性。这提示最近激活的vγ9vδ2-t细胞可在tcr结合后不久，引发对抗ebv-lcl的细胞毒性活性。发明人的结果进一步表明该过程需要细胞-细胞接触并包括vγ9vδ2-t细胞上的nkg2d与在ebv-lcl上表达的mica/b的结合。事实上，发明人还发现固定化mica/b促进vγ9vδ2-t细胞激活，颗粒胞外分泌和细胞毒性活性。重要的是，在固定化mica/b刺激后，通过阴性选择分选的vγ9vδ2-t细胞的颗粒胞外分泌和细胞毒性的水平比在使用抗-tcrmab阳性分选后的相同细胞的要低得多。因此，tcr-γ/δ和nkg2d二者对于识别vγ9vδ2-t细胞是需要的，并且tcr-γ/δ结合对于引发它们的对抗ebv-lcl的细胞毒性活性是必要的。

根据发明人的先前使用流感病毒-感染细胞的结果(qin等,2009)，发明人还发现vγ9vδ2-t细胞对抗ebv-lcl的细胞毒性活性涉及死亡诱导fas受体的结合，和细胞毒性效应分子，例如穿孔素和脱粒酶的释放。发明人进一步证实由ebv-lcl表达的另一种死亡诱导受体dr5与在vγ9vδ2-t细胞上表达的trail的相互作用也提高vγ9vδ2-t细胞-介导的ebv-lcl杀灭作用。重要的是，这些帕米膦酸盐-扩增的vγ9vδ2-t细胞可迁移至肿瘤部位并在体内浸润进入肿瘤组织，因此有助于控制小鼠的ebv-lpd。与发明人先前在趋化性分析中使用流感病毒-感染的细胞的结果一致(qin等,2011)，使用跨孔趋化性分析和体内成像分析二者，发明人在此还显示vγ9vδ2-t细胞向肿瘤部位的迁移主要由ccr5及其配体介导。合在一起，发明人的结果表明帕米膦酸盐-扩增的vγ9vδ2-t细胞可以通过杀死ebv-lcl控制ebv-lpd。

先前的数据显示，帕米膦酸盐-扩增的vγ9vδ2-t细胞可产生大量的ifn-γ(qin等,2011)。一项研究也证实，从nk细胞分泌的ifn-γ可延迟隐藏的ebv抗原表达，因而导致ebv-诱导的b细胞增殖降低(strowig等,2008)。事实上，在此发明人还发现与对照小鼠中的肿瘤细胞比较，在vγ9vδ2-t-细胞-和帕米膦酸盐-处理的小鼠中的肿瘤细胞的增殖能力降低。因此，除了它们的直接杀死作用外，vγ9vδ2-t细胞也可通过它们分泌的ifn-γ，经抑制ebv-lcl的增殖，有助于防止癌症转移。

已经显示了帕米膦酸盐-诱导的vγ9vδ2-t细胞(但不是其它t细胞子群)在体外和在人源化小鼠中的扩增(das等,2001；kunzmann等,1999；sicard等,2005；tu等,2011)。虽然非-vγ9vδ2γδt细胞也可被帕米膦酸盐激活，cd69+、穿孔素+，和脱粒酶b+细胞在非-vγ9vδ2γδt细胞中的频度显著地低于vγ9vδ2-t细胞中的频度(tu等,2011)。事实上，在rag2^-/-γc^-/-小鼠中的过继转移实验还显示，帕米膦酸盐-扩增的vγ9vδ2-t细胞在体内容易控制ebv-lpd，而无需来自其它人和鼠科动物t、b和nk细胞的帮助，这些细胞在rag2^-/-γc^-/-小鼠中是缺乏的。重要的是，帕米膦酸盐有效地控制ebv-lpd在用全hupbmc重建的人源化小鼠中的发生，但在用vγ9vδ2-t-细胞-耗尽的hupbmc重建的小鼠中没有这样的有益作用。此外，帕米膦酸盐不显示对抗ebv-lcl的任何细胞毒性活性。因此，这表明由帕米膦酸盐控制人源化小鼠中的ebv-lpd主要由vγ9vδ2-t细胞介导。

如在人类中，vγ9vδ2-t细胞组成人源化小鼠中的小百分比的淋巴细胞(tu等,2011)。vγ9vδ2-t细胞的抗肿瘤活性取决于vγ9vδ2-t细胞频度和激活程度二者(bonneville和scotet,2006)。因此，发明人不能观察到用全hupbmc和vγ9vδ2-t-细胞-耗尽的hupbmc重建的小鼠之间的疾病严重性的差异。事实上，体外结果也显示，ebv-lcl单独不能有效地扩增在ebv-血清阳性供体中的vγ9vδ2-t细胞。仅在帕米膦酸盐的存在下，vγ9vδ2-t细胞能够扩增并且还诱导表达足够水平的ebv-lcl识别受体以及细胞毒性分子，以控制ebv-lcl的生长。

通过对比导致肿瘤持久根除的ebv-特异性ctl的过继转移的结果(kanakry和ambinder,2013；khanna等,1999；leen等,2007；rooney等,1995)，发明人在此显示，在一些小鼠中基于vγ9vδ2-t-细胞的疗法不能完全地根除原发性肿瘤。vγ9vδ2-t细胞在不同的小鼠中的频度和激活的变化可说明这一点。因此，根据通过监测vγ9vδ2-t细胞的治疗效果和频度的结果，实时调整帕米膦酸盐的剂量是重要的。然而，本研究中提出的通过增加体内vγ9vδ2-t-细胞免疫力，使用帕米膦酸盐控制ebv-lpd的策略具有明显的优点，因为可避免体外生成ebv-特异性ctl的复杂程序。

总之，本研究证实帕米膦酸盐-扩增的vγ9vδ2-t细胞可在体外和体内直接杀死ebv-lcl，并且帕米膦酸盐可通过vγ9vδ2-t-细胞依赖性机制，控制人源化小鼠的ebv-lpd。本研究提供使用帕米膦酸盐提高对抗ebv-lpd的人vγ9vδ2-t-细胞免疫力的新治疗方法原理的强有力的临床前证据。帕米膦酸盐通常在临床上用来治疗骨质疏松症和佩吉特氏病(paget’sdisease)，并且使用人等效剂量的帕米膦酸盐可有效地控制人源化小鼠中的ebv-lpd，提示人临床试验的快速转译。这种“老药新用”潜在地提供一种治疗ebv-lpd的安全和容易获得的选项。

应该理解，在此描述的实施例和实施方案仅仅是为了举例说明的目的，且将提示本领域技术人员依据其的各种修饰或变化，并被包括在本申请的精神和范围内以及所附权利要求书的范围内。此外，本文公开的任何发明或其实施方案的任何要素或限制可与本文公开的任何和/或所有其它要素或限制(单独地或以任何组合)或任何其它发明或其实施方案组合，且所有这样的组合均不受限制地包括在本发明范围内。

虽然在前述说明书中，已结合其某些实施方案描述了本发明，并且为了举例说明的目的已提出许多细节，但对本领域技术人员显而易见的是，本发明容许另外的实施方案，并且在此描述的某些细节可有相当的变化，而不背离本发明的基本原理。

本文引用的所有参考文献通过参考以其全文结合到本文中。本发明可以其它特定的形式体现，而不背离其精神或基本属性，因此，在指明本发明的范围时，应该参照所附权利要求书，而不是前述说明书。