基于交联型玻尿酸和羧甲基纤维素的真皮填充剂的制作方法

本发明涉及一种呈胶体的形式的注射型真皮填充剂组合物，该注射型真皮填充剂组合物包括交联型玻尿酸(ha)、羧甲基纤维素(cmc)、以及任选地微粒子(诸如钙羟基磷灰石(cahap)微粒子)。注射型真皮填充剂组合物具有改善的流变性质，同时具有低挤出力。本发明还涉及制备此类注射型真皮填充剂组合物的方法以及其关于美容与治疗目的的应用。
背景技术：
：目前普遍期望实现并保有年轻的外表，这是美丽的共同特征。然而，随着时间流逝，皮肤开始失去其年轻的外表，特别是脸部。脸部老化的最普遍的审美指标包括可见的皮肤皱纹、深鼻唇沟、皱眉纹、木偶纹、颊接合纹和口围皱纹。这些老化的改变通常通过真皮填充剂的注射进行治疗，以增大组织的体积。近来，存在许多可用的真皮填充剂，其可大致分为2个类别。第一个类别的填充剂通过产生体积来提供长期的效果，并且包括填充剂诸如交联型玻尿酸(ha)填充剂。第二个类别的填充剂通过刺激胶原蛋白新生来提供长期的效果。最著名且最广为使用的示例为微晶瓷其包括cahap微球体、羧甲基纤维素(cmc)的胶体载体、以及丙三醇。理想的真皮填充剂应具备生物相容性、具有低的不良事件数据、并且提供合理的长期持续(持久)、有效的体积增大能力，并易于注射。玻尿酸基的填充剂提供许多真皮填充剂的这些期望的特性。由于玻尿酸几乎存在于所有的物种中，因此其不具有抗原性，并且表现出优异的耐受性。另外，玻尿酸的交联使得形成交联型玻尿酸产品，其具有良好的拉提能力并且稳定性可达大于12个月至2年。然而，玻尿酸基的填充剂的主要缺点在于时常难以注射。有鉴于此原因，通常加入非交联型的玻尿酸(“自由型”玻尿酸)作为润滑剂，以利于注射。遗憾的是，通过添加“自由型”玻尿酸而导致的期望的挤出力减少损害胶体的其他期望的物理特性。特别是，弹性模量(gprime,g')的参数下降，由此导致体积增大的效果降低，并且动态黏度降低。微晶瓷是真皮填充剂，其还提供真皮填充剂的期望特性，包括可接受的持久性、生物相容性、以及良好的增大体积的能力。当进行注射时，少量的cahap微球体作为支架，促进类似于其周围环境的新组织形成。然而，由于微晶瓷的cmc载体在活体中被快速吸收(大约3个月内)，胶原蛋白新生与cmc的消除可能不会同时发生，因此造成填充效果的潜在和短暂的降低。此外，目前还没有能够在填充剂的施加后对cmc进行部分修复的解毒剂(逆转剂)。1993年提交的欧洲专利1080698公开了注射型软组织填充材料，其包括微细地分开的陶瓷粒子(例如cahap)，并且除此之外涵盖陶晶瓷。此外，wo2014/056723描述了一种粘弹性的胶体，其包括浓度介于1％和4％(w/v)之间的交联型玻尿酸以及浓度介于10％和70％(w/v)之间的羟基磷灰石粒子。技术实现要素：鉴于以上所述，本发明的目的是提供持久型的真皮填充剂组合物，其具有改善的流变性质，同时能够易于注射。上述问题是通过提供一种呈胶体形式的注射型真皮填充剂组合物来解决的，该注射型真皮填充剂组合物利用羧甲基纤维素作为润滑剂。这种新型的真皮填充剂提供良好的持久性，易于注射，并且具有改善的流变性质(即，弹性模量和动态黏度)，从而导致产生体积的优异能力。在第一方面中，本发明提供呈胶体形式的注射型真皮填充剂组合物，该注射型真皮填充剂组合物包括交联型(例如，bdde交联型)玻尿酸(ha)和羧甲基纤维素(cmc)。交联型ha通常以0.1％至4.0％重量/体积(例如，0.5％至4.0％或1.0％至4.0％重量/体积)的浓度存在，并且提供交联型基质，而cmc通常以1.0％至25％体积/体积的浓度存在，并且作为润滑剂/润滑相添加。在优选实施方案中，注射型真皮填充剂组合物还包括可吸收生物相容性微粒子，特别是钙羟基磷灰石微粒子。在第二方面中，本发明提供试剂盒，该试剂盒包括根据本发明的第一方面的注射型真皮填充剂组合物。在第三方面中，本发明提供一种制备根据本发明的第一方面的注射型真皮填充剂组合物的方法，包括以下步骤：(a)提供交联型玻尿酸胶体，(b)提供羧甲基纤维素胶体，(c)将交联型玻尿酸胶体与羧甲基纤维素胶体混合。在第四方面中，本发明涉及根据本发明的第一方面的注射型真皮填充剂组合物或根据本发明的第二方面的试剂盒在美容应用中的使用，诸如脸部细纹的治疗。在第五方面中，本发明提供用于治疗的根据本发明的第一方面的注射型真皮填充剂组合物或根据本发明的第二方面的试剂盒，特别是用于治疗压力性尿失禁、膀胱输尿管逆流、声门闭合不全、以及声带内移。在第六方面中，本发明提供一种用于替换或填充生物组织或增大生物组织的体积的方法，该方法包括对有需要的受治疗者施用有效量的根据本发明的第一方面的注射型真皮填充剂组合物。本发明的特定实施方案描述于随附的权利要求书中。在参见本发明的下列具体实施方式、附图和实施例之后，本发明的其他目的、优点、和特征对于本领域的技术人员将变得显而易见。附图说明图1示出根据本发明的ha/cmc真皮填充剂组合物(具有15％(v/v)cmc的mhag胶体；灰色长条)、以及ha/自由型ha真皮填充剂组合物(具有15％(v/v)自由型ha的mhag胶体；阴影长条)，相比于“仅有玻尿酸”的胶体(mhag胶体；黑色长条)的挤出力的示意图。图2示出根据本发明的ha/cmc真皮填充剂组合物(具有15％(v/v)cmc的mhag胶体；灰色长条)、以及ha/自由型ha真皮填充剂组合物(具有15％(v/v)自由型ha的mhag胶体；阴影长条)，相比于“仅有玻尿酸”的胶体(mhag胶体；黑色长条)的弹性模量(g’)的示意图。图3示出根据本发明的ha/cmc真皮填充剂组合物(具有15％(v/v)cmc的mhag胶体；灰色长条)、以及ha/自由型ha真皮填充剂组合物(具有15％(v/v)自由型ha的mhag胶体；阴影长条)，相比于“仅有玻尿酸”的胶体(mhag胶体；黑色长条)的黏度的示意图。图4示出根据本发明的ha/cahap/cmc真皮填充剂组合物(具有10％(v/v)cmc的mhai胶体；黑色长条)，相比于ha/cahap胶体(mhai胶体；灰色长条)、ha/cahap/自由型ha胶体(具有10％自由型ha的mhai胶体；阴影长条)、以及稀释的mhai胶体(具有稀释的ha(15mg/mlha)的mhai胶体；空白长条)的挤出力。图5示出根据本发明的ha/cahap/cmc真皮填充剂组合物(具有10％(v/v)cmc的mhai胶体；黑色长条)，相比于ha/cahap胶体(mhai胶体；灰色长条)、ha/cahap/自由型ha胶体(具有10％自由型ha的mhai胶体；阴影长条)、以及稀释的mhai胶体(具有稀释的ha(15mg/mlha)的mhai胶体；空白长条)的弹性模量(g’)。图6示出根据本发明的ha/cahap/cmc真皮填充剂组合物(具有10％(v/v)cmc的mhai胶体；黑色长条)，相比于ha/cahap胶体(mhai胶体；灰色长条)、ha/cahap/自由型ha胶体(具有10％自由型ha的mhai胶体；阴影长条)、以及稀释的mhai胶体(具有稀释的ha(15mg/mlha)的mhai胶体；空白长条)的黏度。图7示出不同浓度的cmc对于ha/cahap/cmc真皮填充剂组合物(mhai胶体；黑色长条)、具有5％cmc的ha/cahap胶体(具有5％cmc的mhai胶体；灰色长条)、具有10％cmc的ha/cahap胶体(具有10％cmc的mhai胶体；阴影长条)、以及具有15％cmc的ha/cahap胶体(具有15％cmc的mhai胶体；空白长条)的影响。具体实施方式本发明的注射型真皮填充剂相较于熟知的填充剂提供许多优点，包括优异的生物相容性、改善的持久性、高保湿力、无免疫性、以及能够被身体安全吸收、同时作为真皮填充剂保持期望的机械和流变性质。尤其，本发明的发明人已发现，将少量的羧甲基纤维素(cmc)添加至交联型玻尿酸胶体惊喜地导致持久的真皮填充剂组合物展现低的挤出力，同时具有改善的机械特性(即，高弹性模量(g’)与高动态黏度)，提供高的体积增大能力。换句话讲，根据本发明的真皮填充剂预想不到地被发现其提供持久性、拉提能力和易注射性的最佳平衡。此外，在本发明的优选实施方案中，真皮填充剂组合物另外包括微粒子(例如钙羟基磷灰石(cahap)微粒子)，由于可利用玻尿酸酶来降解和分解交联型玻尿酸载体，微晶瓷的优点(即，cahap粒子所造成的胶原蛋白新生)可与部分可逆性/可修复性的优点相结合。另一优点在于，交联型玻尿酸载体相较于近来所使用(例如用于微晶瓷中)的非交联型cmc载体而言，能够持续更久。这将防止表现/体积增大效果的熟知差距(可见于cmc的溶解时间与微粒子的胶原蛋白新生的刺激之间)。在第一方面，本发明涉及一种呈胶体的形式的注射型真皮填充剂组合物，其包括交联型玻尿酸和cmc。如本文所用，术语“真皮填充剂”泛指被设计为在缺乏软组织的区域增大体积的材料或组合物。如本文所用，术语“真皮填充剂”与术语“软组织填充剂”具有相同的意思并且可互换使用。即，术语“真皮填充剂”不应理解为强加关于注射的位置和类型的任何限制，并且一般包括使用于真皮之下的多个层，例如骨膜之上的肌肉下以及皮下平面中。在本发明的意思中，术语“软骨组织”一般涉及连接、支撑或围绕其他结构和身体器官的组织。在本发明中，软组织包括例如肌肉、肌腱(连接肌肉与骨头的纤维条)、纤维组织、脂肪、血管、神经、以及滑液组织(关节周围的组织)。根据本发明，注射型真皮填充剂组合物为胶体。如本文所用，术语“胶体”一般是指在室温下具有介于液体与固体之间的流动性的材料。此外，术语“胶体”意在表示能够吸收水的材料(即“水胶”)。在本发明中，注射型真皮填充剂一般包括生理上可接受的载体流体，诸如非致热性等张缓冲液，特别是具有优选缓冲的生理食盐水溶液。此外，本发明的真皮填充剂组合物是“注射型”。这表示真皮填充剂组合物适合于注射至皮肤或其他组织中，以将真皮填充剂组合物带到期望的目标部位。本发明意义中的“注射型”组合物可从注射器在正常条件在常压下施加。根据本发明，cmc的浓度优选介于1.0％至25.0％之间，更优选介于5.0％至20％之间，并且最优选介于10％至15％体积/体积(v/v)之间。在本发明中，其一般用作润滑剂或润滑相。本文所使用的合适的cmc可具有在5.0×104道尔顿(da)(低黏度cmc)至1.5×106da(高黏度cmc)范围内的分子量，例如在9.0x104da至7.0×105da范围内，特别是在1.5×105至5.0×105da范围内。此外，本文所用的合适的cmc可选自低黏度cmc、中等黏度cmc、以及高黏度cmc。低黏度cmc是使用布氏黏度剂(brookfieldspindleviscosimeter(型号lvt)在25℃，旋转速度为60每分钟转速(rpm)，转轴尺寸为第1或第2号，使用2％水溶液进行测量的，具有75至750毫帕斯卡·秒(mpa·s)的黏度。中等黏度cmc是使用布氏黏度剂(型号lvt)在25℃，旋转速度为30rpm，转轴尺寸为第2或第3号，使用2％水溶液进行测量的，具有750至4,000mpa·s的黏度。高黏度cmc是使用布氏黏度剂(型号lvt)在25℃，旋转速度为30rpm，转轴尺寸为第3或第4号，使用1％水溶液进行测量的，具有4,000至25,000mpa·s的黏度。此外，cmc的取代度通常为0.20至1.50，优选为0.40至1.10，更优选为0.60至0.95，并且最优选为0.70至0.90。如本文所用，“取代度”(醚化度)定义如下：[c6h7o2(oh)x(och2coom)y]n，其中n是聚合度(例如450至4.000)并且x+y＝3，其中y是取代度。取代度可由本领域已知的方法确定(例如根据国际酒类规则(internationaloenologicalcodex)coei-1-cmc:2009所述的方法)。玻尿酸在组合物中的浓度优选为0.1％至5.0％、或0.2％至4.5％、或0.3％至4.0％、或0.4％至4.0％、或0.5％至4.0％、或0.7％至4.0％、或1.0％至4.0％，更优选为0.5％至3.0％、或1.0％至3.0％、或1.5％至3.0％、或2.0％至3.0％，最优选为1.0％至2.5％、或2.0％至2.5％重量/体积。本发明中，交联型玻尿酸形成“基质”。如本文所用，术语“基质”用于表示呈溶液或胶体形式的交联或非交联的多醣网络。此外，如本文所用，术语“玻尿酸”或“ha”表示玻尿酸、玻尿酸盐、以及任何的玻尿酸盐类，诸如玻尿酸钠。在本发明的上下文中，交联型玻尿酸并非以任何方式限制，并且包括由单一玻尿酸或由分子量不同的两种或更多种玻尿酸制备的交联型玻尿酸(参照例如us2010/0316683a1或wo2013/185934a1，其以引用方式并入本文)。并且，在本发明的范围内，交联型玻尿酸可形成“多密度”胶体(特征为在胶体中的交联度的变化)。即，“多密度”胶体具有(至少)两种不同的密度水平，具有密度较高的部分(交联度较高)和密度较低的部分(交联度较低)。例如，多密度胶体可通过第一交联反应以交联第一一个或多个多醣，接着通过第二交联反应以交联第二一个或多个多醣，以形成双交联胶体。例如，所述第一一个或多个多醣和所述第二一个或多个多醣可以独立地为相同的玻尿酸或两种不同的玻尿酸(平均分子量不同，例如低分子量和高分子量玻尿酸)。此双交联制程(动态交联技术)为本领域所熟知的，并且描述于例如ep1711552b1，其以引用方式并入本文。在本发明中，交联型玻尿酸可通过交联单一的玻尿酸，或通过交联第一玻尿酸与第二玻尿酸、以及任选地至少一个另外的玻尿酸来制备，其中第一玻尿酸、第二玻尿酸、和至少一个另外的玻尿酸的平均分子量不同。优选地，所述单一的玻尿酸的平均分子量是0.1×106至4.0×106da、或0.3×106至4.0×106da、或0.5×106至4.0×106da，特别是1.0×106至3.0×106da、或1.5×106至2.5×106da。所述第一玻尿酸优选的平均分子量是1.0×105da至小于1.0×106da，更优选3.0×105da至9.0×105da，并且最优选5.0×105da至8.0×105da。所述第二玻尿酸的平均分子量通常大于1.0×106da、最高至5.0×106da，特别是介于1.5×106da和4.0×106da之间，并且优选介于2.0×106da和3.0×106da之间。本发明的注射型真皮填充剂中的第一玻尿酸与第二玻尿酸的重量比率在0.001:99.999至99.999:0.001的范围内，但并不以此为限，优选约70:30至约99.9:0.1，并且最优选90:10至约99.0:1.0。本文可使用不同的方法来确定玻尿酸的分子量，诸如特性粘度测量(例如，根据中国药典(chinesepharmacopoeia)，第2版，2006年)，毛细管电泳(ce)(例如，根据kinoshita等人,biomed.chromatogr.,2002,16:141-45)，高效凝胶渗透层析(hpgpc)(根据kim等人,foodchem.,2008,109:63-770)，以及结合多角度激光散射与尺寸排除层析(sec-malls)(例如，根据hokputsa等人,eur.biophys.j.biophys.lett.,2003,32:450-456)。优选地，根据本发明的注射型真皮填充剂组合物与bdde(1,4-丁二醇二环氧丙酯)交联。该bdde-交联型玻尿酸可具有修饰度，其表示为单交联和双交联的bdde交联剂的总和与玻尿酸双醣单元的总和的比率，为0.5％至25％，优选为1.0％至15％，更优选为2.0％至10％，并且最优选为3.0％至8.0％或4.0％至7％。修饰度可通过核磁共振(nmr)根据本领域所熟知的方法来确定(edsman等人，玻尿酸真皮填充剂的胶体特性(gelpropertiesofhyaluronicaciddermalfillers),dermatol.surg.2012,38:1170-1179；guarise等人，尺寸排除层析所确定的玻尿酸填充剂的交联效率(secdeterminationofcross-linkefficiencyinhyaluronanfillers),carbohydratepolymers2012,88:428-434；kenne等人，玻尿酸水凝胶的修饰和交联参数-定义与分析方法(modificationandcross-linkingparametersinhyaluronicacidhydrogels-definitionsandanalyticalmethods),carbohydratepolymers2013,91:410-418)。简言之，经透析且灭菌的胶体在进行nmr测量之前已被降解。降解可通过硫酸软骨素酶ac(edsman等人,supra；kenne等人,supra)，氢氧化钠(naoh)(guarise等人,supra)，添加玻尿酸酶(例如，对1克(g)的胶体加150u的羊玻尿酸酶)，或通过在90℃下培养至少35小时来进行。所得溶液接着被冷冻干燥，溶解于重水(d2o)中，并受到充分的均质化。nmr测量可在20度脉冲在环境温度下在例如500mhz下重复多次进行测量，以接收具有合适分辨率的光谱。根据文献，修饰度(mod)是通过计算玻尿酸的n-乙酰的信号与bdde的亚甲基的信号的比率而评估的。当溶解于重水中时，对于n-乙酰而言，关键信号位于约2.0ppm，对于bdde而言，则位于大约1.6ppm。为了计算修饰度，积分值受到确认，并且根据文献(edsman等人,supra以及kenne等人,supra)，需采纳n-乙酰的3个氢(h)(ch3)与bdde的亚甲基的4个氢(ch2ch2)的质子的比率。根据本发明的优选实施方案，注射型真皮填充剂还包括可吸收生物相容性微粒子。如本文所用，术语“微粒子”一般涉及基本上圆形或球形的粒子。此外，微粒子的平均直径优选为5微米(μm)至500μm，更优选为10μm至200μm，特别优选为15μm至100μm或20μm至75μm，并且最优选为25μm至45μm。在本发明的上下文中，术语“可吸收”一般是指可被分解并被吸收至组织和/或体液中的材料。存在于组合物中的微粒子的浓度优选为0.5％至50％、或1.0％至50％，更优选为1.0％至40％，特别优选为5.0％至35％，特别是15.0％至30％，或20％至25％，并且最优选为25.0％至35％体积/体积。在本发明的上下文中，可吸收生物相容性微粒子可由磷酸钙基的材料、氧化铝基的材料、可生物分解的天然多醣类、或它们的衍生物、或可生物分解聚酯、聚原酸酯、或聚酐合成聚合物组成。如本文所用，术语“天然多醣类”一般涉及天然存在的多醣类。如本文所用，“衍生物”在结合天然多醣类使用时，是指从天然多醣体通过化学修饰所衍生的，诸如羧化作用、醚化作用、甲基化作用、磺化作用等等。如本文所用，术语“可生物分解”泛指能够被活着的人类在活体中分解的材料，并且不应理解为限制于特定分解时间或持续时间。磷酸钙基的材料可选自cahap、钙氟磷灰石、钙氯磷灰石、碳酸钙磷灰石、磷酸四钙、焦磷酸钙、磷酸三钙、以及磷酸八钙。优选地，磷酸钙基的材料是cahap。可生物分解的聚酯、聚原酸酯、或聚酐合成聚合物可以是乙交酯、乳酸交酯、己内酯、以及对二氧环己酮的同源聚合物或共聚物，或者是三亚甲基碳酸酯、或聚羟基丁酸酯或聚羟基戊酸酯聚合物。优选地，可生物分解的聚酯、聚原酸酯、或聚酐合成聚合物选自聚己内酯、聚乙交酯、聚乳酸交酯、聚二氧环己酮、聚乳酸-甘醇酸、聚甘醇酸-己内酯、以及聚甘醇酸-三亚甲基碳酸酯，并且最优选为聚己内酯或聚二氧环己酮。根据本发明，注射型真皮填充剂组合物还可包括一种或多种化合物，其选自由聚醇、维生素、胺基酸、金属、抗氧化剂、以及矿物盐类组成的组。本文所使用的合适的聚醇包括但不限于丙三醇、己六醇、山梨醇、丙二醇、丁四醇、木醣醇、麦芽糖醇、以及乳醣醇。本文中特别适于使用的是己六醇和丙三醇。此外，聚醇优选为乙二醇，任选地与一种或多种前述聚醇化合物结合，特别是己六醇。例如，聚醇包括于注射型真皮填充剂组合物中的浓度可以是1％至25％，或2％至17％，或3％至13％体积/体积，特别是浓度为5％至11％，或7％至10％体积/体积。合适的维生素包括维生素c、维生素e、以及维生素b群，即一个或多个维生素b1、b2、b3、b5、b6、b7、b9和b12。维生素c或维生素e的浓度优选为约0.01毫克/毫升(mg/ml)至约10.0mg/ml，更优选为约0.1mg/ml至约5.0mg/ml，并且维生素b群的总浓度优选为约0.01mg/ml至约10.0mg/ml，更优选为约0.1mg/ml至约5.0mg/ml。维生素的存在可刺激并维持细胞代谢，因而促进胶原蛋白的产生。具体地，优选本文使用的是维生素c、维生素e和维生素b6。此外，根据本发明的注射型真皮填充剂组合物可还包括麻醉剂，特别是局部麻醉剂，优选为利多卡因，浓度例如是0.05重量百分比(wt.％)至5.0wt.％，0.1wt.％至4.0wt.％，0.2wt.％至3.0wt.％，0.3wt.％至2.0wt.％，或0.4wt.％至1.0wt.％。本文进一步设想，除了交联型玻尿酸和cmc之外，注射型真皮填充剂组合物可包括交联型和/或非交联型聚合物。特别是，注射型真皮填充剂组合物可还包括0.001％至15％，特别是1％至10％体积/体积非交联型玻尿酸。所述非交联型玻尿酸的分子量优选介于3.0×105da和4.0×106da之间，特别是介于1.0×106da和3.0×106da之间。其他交联型或非交联型聚合物(诸如硫酸软骨素、角质素、硫酸角质素、肝素、硫酸肝素、纤维素以及它们的衍生物，几丁聚醣、鹿角菜胶、三仙胶、和藻酸盐，或它们的盐类中的一种)也可少量(例如，少于10％，通常是少于5％，或少于1％体积/体积)包括于本发明的注射型真皮填充剂组合物中。然而，本文还设想到，除了本文所述的交联型ha之外，注射型真皮填充剂组合物缺少任何交联型聚合物，并且/或者除了本文所述的cmc之外，缺少任何非交联型聚合物。在该上下文中，如本文所用，术语“聚合物”是指任何天然的或合成的聚合化合物，具有重复的结构单元，包括多醣(诸如ha)。在本发明的优选实施方案中，根据本发明的注射型真皮填充剂组合物，其包括包含微粒子(例如，cahap微粒子)的组合物，还包括麻醉剂，优选为利多卡因，和/或上述的一种或多种聚醇。特别优选地，根据本发明的注射型真皮填充剂组合物，其包括包含cahap微粒子的组合物，还包括利多卡因和丙三醇。此外，根据本发明，注射型真皮填充剂组合物可具有以下特性中的一个或多个：(i)在0.4赫兹(hz)的频率(f)下，25℃时，弹性模量g'是50帕(pa)至4.500pa，优选为100pa至4000pa，更优选为150pa至2,500pa。(ii)在0.4赫兹(hz)的频率下，25℃时，黏度是20pa·s至1,400pa·s，优选为25pa·s至1,000pa·s，更优选为30pa·s至900pa·s。(iii)在0.4赫兹(hz)的频率下，25℃时，损耗角正切值(g"/g')是0.20至0.8，优选为0.25至0.6。此外，如通过25g×5/8"的针头(例如neoject)，使用标准的1ml注射器(例如，1mlbd注射器)在约50mm/分钟的挤出速率下测量的，根据本发明的不具有任何微粒子(例如，cahap微粒子)的注射型真皮填充剂组合物的挤出力一般在10n至30n的范围内。如通过25gtw3/4的针头(例如，泰尔茂可沛注射针(terumokpackii))，使用标准的1.5ml注射器(例如，1.5ml塑料注射器)在约50mm/分钟的挤出速率下测量的，根据本发明的具有微粒子(例如，cahap微粒子)注射型真皮填充剂组合物的挤出力一般在35n至70n的范围内。此外，注射型真皮填充剂组合物一般包括缓冲液，例如磷酸缓冲液，以调整ph值。由于本发明的注射型真皮填充剂组合物用于插入人体中，ph值一般在6.5至7.5的范围内，优选在6.8至7.4的范围内。此外，渗透压优选为约200mosmol/l至约400mosmol/l，更优选为约280mosmol/l至约330mosmol/l。在第二方面，本发明涉及包括根据本发明的第一方面的注射型真皮填充剂组合物的试剂盒。该试剂盒还可包括使用说明。在第三方面，本发明涉及制备根据本发明的第一方面的注射型真皮填充剂组合物的方法，包括以下步骤：(a)提供交联型玻尿酸胶体。(b)提供cmc胶体。(c)将交联型玻尿酸胶体与cmc胶体混合。提供于步骤(a)的交联型玻尿酸胶体和/或提供于步骤(b)的cmc胶体优选包括一种或多种如上所述的聚醇，特别是丙三醇。除此之外或另选地，一种或多种如上所述的聚醇，特别是丙三醇，也可在步骤(c)中或步骤(c)之后添加。此外，在本发明中，微粒子可悬浮于提供于步骤(b)的cmc胶体中，或另选地，微粒子可在步骤(c)中与交联型玻尿酸胶体和cmc胶体混合。此外，微粒子可添加到在步骤(c)中获得的混合物。优选地，步骤(a)的交联型玻尿酸胶体和/或步骤(b)的cmc胶体包括麻醉剂(例如利多卡因)。更优选地，麻醉剂(例如利多卡因)在步骤(c)中或在步骤(c)之后添加到在步骤(c)中获得的混合物。在第四方面中，本发明涉及根据本发明的第一方面的注射型真皮填充剂组合物或根据本发明的第二方面的试剂盒在美容应用中的使用。根据第四方面的使用，优选地包括皮肤的皱纹和细纹(例如，脸部细纹和脸部皱纹)、皱眉纹、鼻唇沟、下巴纹、木偶纹、颊接合纹、口围皱纹、鱼尾纹、皮肤下垂、疤痕、鬓角、眉毛的皮下支撑、颧骨和颊脂垫、泪沟、鼻子、嘴唇、脸颊、口周围区域、眼框区域、脸部不对称、下颚轮廓和下巴的美容治疗。在第五方面中，本发明涉及用于治疗的根据本发明的第一方面的注射型真皮填充剂组合物。特别是，根据本发明的第一方面的注射型真皮填充剂组合物可用于治疗压力性尿失禁、膀胱输尿管逆流、声门闭合不全、声带内移。在第六方面中，本发明涉及一种用于替换或填充生物组织，或增大生物组织的体积的方法，包括对有需要的受治疗者施用有效量的根据本发明的第一方面的注射型真皮填充物组合物。通常，注射型真皮填充剂是通过注射而施用的，诸如通过皮下或皮内注射。例如，该组合物可使用连续穿刺注射法来进行皮内或皮下注射。术语“有效量”是指足以实现有益的或期望的美容(美感)或治疗结果的注射型真皮填充剂的量。“受治疗者”在本发明的意思中是需要治疗特定情况或疾病的任何个体或患者。在本发明的架构中，受治疗者通常是人类。该组合物优选施用用于治疗美容状况，诸如皱纹或皮肤细纹(例如，脸部细纹或脸部皱纹)的治疗、皱眉纹、鼻唇沟、下巴纹、木偶纹、颊接合纹、口围皱纹、鱼尾纹、皮肤下垂、疤痕、鬓角、眉毛的皮下支撑、颧骨及颊脂垫、泪沟、鼻子、嘴唇、脸颊、口周围区域、眼框区域、脸部不对称、下巴外形和下巴。然而，该组合物也可施用用于治疗治疗上的症状，诸如压力性尿失禁、膀胱输尿管逆流、声门闭合不全、声带内移。以上所提供的关于本发明的第一方面的所有解释和评论(例如，关于包括于注射型真皮填充剂组合物中的成分或物质、其制造方法、以及一些技术名词的定义)相同地应用于根据本发明的第六方面的方法。本发明现在将进一步通过以下非限制性实施例进行说明。实施例以下提供的实施例说明根据本发明的真皮填充剂组合物具有显著降低的挤出力，而机械性质(即，弹性模量(g')和黏度)出人意料地维持或甚至改善。挤出力的测量玻尿酸(ha)胶体的挤出力(具有或不具有cmc或自由型玻尿酸的润滑相)是使用1.0mlbd注射器和25g×5/8"(neoject)的针头来确定的。为此，使用物性测试仪(textureanalyzer,ta.xtplus)。测试是使用0.500nd的预加载进行的，并且测试速度为2in/分钟。ha/cahap胶体的挤出力(具有或不具有cmc或自由型玻尿酸的润滑相)是使用1.5ml塑料注射器和泰尔茂可沛注射针27gtw3/4的针头来确定的。为此，使用物性测试仪(ta.xtplus)。测试是使用0.500nd的预加载进行的，并且测试速度为2in/分钟。弹性模量(g’)和动态黏度的测量弹性模量和黏度是使用由配备有直径20mm的平板系统的流变仪(antonpaarmcr302)测量的。在ha胶体的实例中(具有或不具有cmc或自由型玻尿酸的润滑相)，弹性模量g'和黏度是使用以下设定来确定的：温度30℃间隙尺寸1.0mm平板尺寸pp35tau(应力)5pa频率范围0.1-10hz频率/十进数6在ha/cahap胶体的实例中(具有或不具有cmc或自由型玻尿酸的润滑相)，弹性模量g'和黏度是使用以下设定来确定的：温度25℃间隙尺寸2mm平板尺寸pp20tau(应力)30pa频率范围0.1-10hz频率/十进数6实施例1不具润滑相且具有或不具有cahap粒子的ha胶体(mhag胶体和mhai胶体)的制备(比较胶体)交联溶液的制备ha“块”(“cake”)是通过将43g的玻尿酸钠(平均分子量约2.8mda)溶解于270.35g的磷酸缓冲液中制备而成的。所得的ha块可储存于冰箱中直到需要。另外，碱性溶液是通过将3.31g的固体氢氧化钠溶解于10ml的缓冲液中制备而成的。此外，bdde溶液是通过将12.5g的2m的氢氧化钠溶液与88.5g的磷酸缓冲液进行混和，接着再将8.21ml的所得溶液与3.395ml的bdde混合制备而成的。交联将ha块手工地分为小碎片，将所有的碱性溶液加入杯，接着于12rpm下混合30至40分钟。接着，将bdde溶液加入杯中，并于25rpm下持续混合10至15分钟。温度设定点改为33.33℃，并且混合物在该温度下持续4小时。中和和纯化中和溶液是通过添加920.99g的缓冲液到84.62g1m氯化氢(hcl)制备而成的。接着将整个中和溶液加入杯中，并在5℃下搅拌2小时。此后，胶体根据本领域熟知的方法进行纯化。接着使用所得的胶体(“mha胶体”)制备下述的mhag(不具有cahap)和mhai(具有cahap)胶体制剂。mhag胶体为了制备mhag胶体，浓缩的利多卡因溶液“ls1”是通过添加2g利多卡因至2g磷酸缓冲液，接着使用磁搅拌器温和搅拌至完全溶解制备而成的。接着，使用合适的混合器将实施例1中所制备的467g的mha胶体与2116μl的“ls1”溶液混合15分钟。此后，加入33g的丙三醇，并且适度地混和化合物1.5小时。在另外的脱气步骤之后，装填1ml注射器，并在127℃下灭菌4分钟。mhai胶体此外，对应于mhag胶体但另外包含cahap粒子的胶体是根据上述针对mhag胶体的制程进行制备的，其与实施例4至6所制备的胶体的量相同。该交联的ha胶体与cahap在下文中命名为“mhai”。实施例2具有15％cmc作为润滑相的ha胶体的制备(本发明的胶体)溶液“lb1”是通过添加62.75g的丙三醇至2.150g的利多卡因氢氟酸，并将该混合物溶解于135.142g的磷酸缓冲液中所制备而成的。接着，使用磁搅拌器进行温和搅拌直到完全溶解。接下来，将2.764g的羟甲基纤维素钠(nacmc)与105.24g的lb1在杯中强烈混合1小时。脱气之后，加入392.025g的实施例1所制备的mhag胶体，并适度混合1.5小时。在另外的脱气步骤之后，装填1ml注射器，并且在127℃下灭菌4分钟。实施例3具有15％(v/v)的自由型ha作为润滑相的ha胶体的制备(比较胶体)溶液“lb2”是通过将1.131g的利多卡因氯化氢溶解于72.743g的磷酸缓冲液中所制备而成的。接着，加入1.170g的玻尿酸钠(2.5-3.0mda)。完全溶解之后，加入33.005g的丙三醇。该混合物接着在适当的速度下搅拌1小时30分钟，并在使用之前维持在5℃下。具有15％(v/v)自由型ha润滑剂的ha胶体是通过将106.721g的lb2与387.357g的实施例1中所制备的mhag胶体混合所制备而成的。维持2小时的适度混合。脱气之后，混合物转移至1ml的注射器中，并在127℃下灭菌4分钟。实施例4具有5％(v/v)cmc作为润滑相的ha/cahap胶体的制备(本发明的胶体)溶液“lb3”是使用与lb1相同的方式制备的，不同的是使用了以下材料和量：4.633g的nacmc，274.16g的丙三醇，以及121.3g的磷酸缓冲液。通过将280.02g的cahap(25μm至45μm)、48.22g的lb3、以及171.84g的实施例1中所制备的mhag胶体放置于混合杯中来制备具有5％(v/v)cmc润滑剂的ha/cahap胶体。接着，加入2.120ml的利多卡因溶液(2g的利多卡因溶于2g的磷酸缓冲液中)。在合适的速度下搅拌混合物1.5小时。在真空下脱气之后，装填1ml注射器，并且在121℃下灭菌20分钟。实施例5具有10％(v/v)cmc作为润滑相的ha/cahap胶体的制备(本发明的胶体)溶液“lb4”是使用与lb1相同的方式制备的，不同的是使用了以下材料和量：7.039g的nacmc、208.527g的丙三醇、以及184.46g的磷酸缓冲液。具有10％(v/v)cmc润滑剂的ha/cahap胶体是如同实施例4所述的方式制备的，除了使用了以下量：280.02g的cahap(25μm至45μm)、63.29g的lb4、以及156.79g的实施例1中所制备的mhag胶体。实施例6具有15％(v/v)cmc作为润滑相的ha/cahap胶体的制备(本发明的胶体)溶液“lb5”是使用与lb1相同的方式制备的，不同的是使用了以下材料和量：8.529g的nacmc、168.266g的丙三醇、以及223.29g的磷酸缓冲液。具有15％(v/v)cmc润滑剂的ha/cahap胶体是如同实施例4所述的方式制备的，除了使用了以下量：280.02g的cahap(25μm至45μm)、78.46g的lb5、以及141.562g的实施例1中所制备的胶体mhag。实施例7具有10％(v/v)自由型ha作为润滑相的ha/cahap胶体的制备(比较胶体)溶液“lb6”是使用与lb2相同的方式制备的，不同的是使用了以下材料和量：208.548g的丙三醇、3.108g的玻尿酸钠、以及188.581g的磷酸缓冲液。具有10％(v/v)自由型ha润滑剂的ha/cahap胶体是通过将156.781g的实施例1中所制备的mhag胶体与63.32g的lb6以及2120μl的利多卡因溶液(2g的利多卡因溶于2g的磷酸缓冲液中)混合而制备的。接着，加入280.02g的cahap(25μm至45μm)，并且适度混合1.5小时。脱气之后，装填1ml注射器，并且在121℃下灭菌20分钟。实施例8cmc润滑剂或自由型ha润滑剂对于交联型ha胶体的挤出力的效果在此实施例中，检测添加cmc或自由型ha作为润滑剂对于ha胶体的挤出力的效果。为此，测量以下胶体的挤出力：mhag胶体(实施例1)、具有15％cmc的mhag胶体(实施例2)、以及具有15％自由型ha的mhag胶体(实施例3)。结果发现，使用cmc作为润滑剂显著降低了挤出力。该降低类似于自由型ha所观察到的降低(参见图1)。实施例9cmc润滑剂或自由型ha润滑剂对于胶联型ha胶体的弹性模量(g')的影响在此实施例中，检测cmc润滑剂和自由型ha润滑剂对于ha胶体的弹性模量(g')的影响。为此，测量与实施例8相同的胶体的弹性模量g'(在1hz，25℃下)。据发现，添加cmc稍微增大g'，而添加自由型ha则降低g'(参见图2)。由于g'的参数影响填充剂的拉提能力，因此g'的维持相当重要。因此，由于相对于cmc观察到甚至稍微的增大，预期具有15％(v/v)cmc的mhag胶体一旦位于皮肤之下便较不可能移位，由此导致更加“拉提”。实施例10cmc润滑剂或自由型ha润滑剂对于胶联型ha胶体的黏度的影响在此实施例中，检测cmc润滑剂和自由型ha润滑剂对于黏度的影响。为此，对与实施例8相同的胶体进行黏度测定(在0.4hz，25℃下)。据发现，cmc的添加增大黏度，而ha的添加则稍微降低黏度(参见图3)。由于增大的黏度将限制胶体在软组织中的扩展，并且还将有助于体积增大的效果，因此黏度也是填充剂组合物的重要参数。实施例11cmc润滑剂或自由型ha润滑剂对于交联型ha/cahap胶体的挤出力的效果为了研究添加cahap粒子是否改变上述添加cmc或自由型ha至交联型ha胶体所得的结果，制备以下胶体：mhai(包括交联型ha和cahap粒子；参加实施例1)，具有10％cmc的mhai(实施例5)，以及具有10％自由型ha的mhai(实施例7)。此外，除了“稀释的mhai”胶体的ha浓度为15mg/g之外，稀释的mhai胶体对应于mhai胶体进行制备。接着，测量上述胶体的挤出力。据发现，添加10％cmc润滑剂显著降低挤出力。该降低稍微大于自由型ha所观察到的降低。此外，应注意的是，cmc或自由型ha润滑剂的使用提供挤出力的降低，类似于具有较低浓度的ha基质的“稀释的mhai胶体”所观察到的挤出力的降低(参见图4)。因此，将cahap粒子加入交联型ha胶体并不改变针对不具有cahap粒子的交联型ha胶体所观察到的基本结果。然而，在ha胶体具有cahap粒子的情况下，挤出力的降低甚至更为明显。实施例12cmc润滑剂或自由型ha润滑剂对于交联型ha/cahap胶体的弹性模量(g')的影响在此实施例中，检测cmc润滑剂或自由型ha润滑剂对于交联型ha/cahap胶体的弹性模量(g')的影响。为此，对于与实施例11相同的胶体进行弹性模量(g')测定(在1hz,25℃下)。据发现，添加10％的cmc导致g'的极大增大。相对地，添加10％的自由型ha却伴随着g'的轻微下降，并且ha基质的稀释造成弹性模量的巨幅下降，这将剧烈改变胶体的性质和临床结果(参见图5)。如同上述，具有高弹性模量g'的胶体将导致更优良的体积增大效果。因此，此实施例显示将cmc润滑剂添加至交联型ha/cahap胶体造成更优异的提升能力。实施例13cmc润滑剂或自由型ha润滑剂对于交联型ha/cahap胶体的黏度的影响在此实施例中，检测cmc润滑剂或自由型ha润滑剂对于交联型ha/cahap胶体的黏度的影响。为此，使用与实施例11相同的胶体对黏度进行测定(在0.4hz，25℃下)。据发现，添加10％cmc导致黏度的显著增大，而添加ha仅有微小的影响。如所预期的，ha基质的稀释造成不小于约75％的黏度损失。在此方面，需指出的是，所添加的cmc润滑剂的浓度可根据所需的挤出力进行调整，如下文实施例14所示。实施例14改变cmc润滑剂的浓度对于交联型ha/cahap胶体的挤出力的影响在此实施例中，检测所添加的cmc润滑剂的浓度改变与挤出力之间的关系。为此，测量以下胶体的挤出力：mhai(交联型ha/cahap胶体，实施例1)、具有5％cmc的mhai(实施例4)、具有10％cmc的mhai(实施例5)、以及具有15％cmc的mhai(实施例6)。据发现，仅添加5％的cmc导致挤出力的显著减小，这可通过添加10％的cmc而进一步地减小，并且通过添加15％的cmc而再进一步地减小(参见图7)。总的来讲，上述实施例1至14显示ha胶体的稀释导致挤出力的下降，但还与弹性模量和黏度的显著下降相关，这将显著地损害填充剂的临床结果。实验进一步显示，如果添加自由型ha作为润滑剂，挤出力降低，但遗憾的是，弹性模量和黏度也出现轻微至中等的降低。相比之下，根据本发明，如果使用cmc作为润滑剂，则惊喜地发现，不仅导致挤出力的显著降低，还造成弹性模量g'和黏度的增大，特别是在具有分散粒子(cahap粒子)的交联型ha胶体的情况下。弹性模量g'的增大和黏度的增大均在注射时导致真皮填充剂组合物的改善的拉提效果。此外，由于ha胶体的交联性质，将在人体中获得长期的持久性。因此，上文所呈现的实验提供证据，根据本发明的真皮填充剂组合物提供持久性、拉提能力和易注射性的最佳平衡。当前第1页12