本发明涉及血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)、脑啡肽酶抑制剂与叶酸类化合物的药物组合物及其用途，属于医药领域。
背景技术：
高血压是最常见的慢性疾病之一，也是心脑血管病最主要的危险因素，其脑卒中、心肌梗塞、心力衰竭及慢性肾脏病等主要并发症的致残、致死率高，严重消耗医疗资源，给家庭和社会带来沉重负担。高血压的主要治疗目标是最大限度地降低心血管并发症的发生与死亡的总体危险，需要治疗所有可逆性心血管危险因素、亚临床靶器官损害以及各种并存的临床疾病【中国高血压防治指南修订委员会.中国高血压防治指南2010.中华心血管病杂志，2011；39(7)：579】。
心力衰竭(简称心衰)是高血压后期的常见并发症，其病理机制是心室泵血或充盈功能低下，心排血量不能满足机体代谢的需要，组织、器官血液灌注不足，出现肺循环和/或体循环淤血，其实也是各种心脏病发展到严重阶段的临床综合症，也称为充血性心力衰竭。心衰的特点是左室肥厚或扩张，导致神经内分泌失常、循环功能异常，出现典型的临床症状，如心悸气促、呼吸困难、体液潴留(浮肿)、乏力(特别是运动时)等。慢性心衰是指持续存在的心力衰竭状态，可以稳定、恶化或失代偿。
心衰是心血管病患者丧失劳动力及死亡的重要原因之一，全球估计有2600万人患有心衰。据世界卫生组织的统计资料，心衰的发生率已达1.9％，人类终生患病几率达20％，心衰的两年病死率为37％，6年死亡率高达82％。在美国，卫生统计显示国家医疗费用支出的1-2％用于心衰治疗。我国心衰发病率亦比较高，心衰患病率预计在1.26％，估计约400万人左右。
临床上治疗心衰的常用药物包括利尿剂、强心苷类、非苷类正性肌力药、肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)抑制剂、β受体阻断剂等。血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)是临床上控制高血压的常用药物，它主要抑制血管紧张素转化酶(ACE)的活性，降低血管紧张素II(Ang II)和醛固酮的含量，同时能减少缓激肽降解，促进 前列腺素释放，从而舒张血管、降低血压。临床上常用的ACEI有卡托普利、依那普利、贝那普利、赖诺普利、雷米普利、福辛普利、西拉普利、培哚普利等。
Ang II是RAAS中关键的一种生物学效应物，它和特异受体AT1结合可介导血管平滑肌收缩、抗利尿激素及醛固酮分泌释放(钠水潴留)、交感神经儿茶酚胺释放增多等一系列效应。心衰的病理生理机制涉及RAAS激活、醛固酮增加等，故ACEI不仅用于治疗高血压，同时也是治疗心衰(尤其是伴有低射血分数时)的基础药物。左心室肥厚是心衰的重要病理基础，ACEI兼有抗增生作用，能逆转高血压患者的心脏肥厚。ACEI逆转心室重构主要通过降低心室前后负荷、抑制Ang II的增生作用和交感神经活性、抑制醛固酮诱导的心脏肥厚及间质和血管周围纤维化等【中华医学会血管病学分会.血管紧张素转换酶抑制剂在心血管病中应用中国专家共识.中华心血管病杂志，2007，35(2)：97】。循证医学研究显示，在轻、中度心衰患者中，长期用依那普利可减低死亡相对风险16％。总体看，ACEI是RAAS抑制剂中心衰疗效相对较好的一类，但仍有1/2以上的顽固心衰疗效反应不佳，亟待改进。
脑啡肽酶抑制剂是一类能够抑制脑啡肽酶活性的化合物或其前体。脑啡肽酶是一种中性内肽酶，在体内降解几种内源性血管活性肽，包括心房利钠肽(ANP)、缓激肽和肾上腺髓质素。抑制脑啡肽酶即可以增加这些物质的水平，对抗血管收缩、钠潴留、心肌重构和神经内分泌的过度激活【Buggey J，et al.Angiotensin receptor neprilysin inhibition in heart failure：mechanistic action and clinical impact.J Card Fail.2015；21(9)：741】。特别强调的是，脑啡肽酶抑制的重要效应是ANP的浓度增加，ANP具有强大的扩血管、排钠、利尿、抑制RAAS和抑制交感神经系统兴奋进而降低循环血量、减轻心脏负荷以及调节水电解质平衡的作用，是体内最重要的RAAS拮抗激素，在心衰的治疗机制中占有重要地位。目前市场有个别单一的脑啡肽酶抑制剂类药物，但主要用于治疗儿童腹泻；沙库比曲(sacubitril，又称AHU-377)是一种脑啡肽酶抑制剂的实验性前体药物，曾试用于治疗高血压。
叶酸类化合物包括叶酸、5-甲基四氢叶酸、甲酰四氢叶酸、亚叶酸、左亚叶酸钙等，它们均属于水溶性维生素，经由肠道吸收，由尿排出体外，在人体内存留时间短暂，很少蓄积，所以必须经常从体外摄取以满足营养和代谢需要。人体内叶酸缺乏时影响同型半胱氨酸(Hcy)的代谢，目前认为Hcy是一种心血管危险因素，与血管内皮损伤、诱导血栓形成等可能有关。【Herrmann W.Significance of hyperhomo- cysteinemia.Clin Lab.2006，52(7-8)：367-374.】
当前临床上心衰治疗总体有效率不甚理想，而且长期心衰使机体循环系统血流缓慢、瘀滞，易导致脑血栓形成。因此，为提高ACEI治疗慢性心衰的疗效，进一步降低心衰患者住院率、住院时间和死亡风险，本发明专利提供ACEI、脑啡肽酶抑制剂与叶酸类化合物的组合物，通过三者的协同效应，达到更有效(多靶点)治疗慢性心衰、降低脑血管事件和死亡风险的目的。
技术实现要素：
本发明的目的是克服ACEI药物和脑啡肽酶抑制剂存在的不足，提供一种在心衰治疗有效率方面表现更优的复方药物组合物。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种药物组合物，包括
(1)药用剂量的血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)；
(2)药用剂量的脑啡肽酶抑制剂；
(3)药用剂量的叶酸类化合物；
(4)药剂学上可接受的载体。
所述ACEI选自卡托普利(Captopril)、依那普利(Enalapril)、贝那普利(Benazepril)、赖诺普利(Lisinopril)、雷米普利(Ramipril)、福辛普利(Fosinopril)、西拉普利(Cilazapril)、培哚普利(Perindopril)、咪达普利(Imidapril)、喹那普利(Quinapril)、地拉普利(Delapril)、螺普利(Spirapril)、阿拉普利(Alacepril)的一种，含量为1.25～75mg。
所述脑啡肽酶抑制剂是沙库比曲(sacubitril)，含量为10～120mg。
所述叶酸类化合物选自叶酸、5-甲基四氢叶酸、甲酰四氢叶酸钙、亚叶酸、左亚叶酸钙、叶酸可药用盐、其它可在体内释放或生成叶酸的物质，含量为0.1～5mg，优选含量为0.2～2mg。
通过进一步研究，ACEI的含量分别为卡托普利(12.5～75mg)、依那普利(2.5～30mg)、贝那普利(5～30mg)、赖诺普利(2.5～30mg)、雷米普利(1.25～15mg)、福辛普利(10～30mg)、西拉普利(1.25～5mg)、培哚普利(2～8mg)、咪达普利(2.5～10mg)、喹那普利(10～30mg)、地拉普利(7.5～45mg)、螺普利(6～25mg)、阿拉普利(25～75mg)等，上述物质的活性代谢产物或盐类含量与相应的上述物质含量等同。
通过进一步研究，脑啡肽酶抑制剂的含量为沙库比曲10～120mg，进一步优选20～100mg，上述物质的活性代谢产物或盐类含量与相应的上述物质含量等同。
通过进一步研究，叶酸类化合物的含量为0.2～2mg，进一步优选0.4～1.6mg，上述物质的活性代谢产物或盐类含量与相应的上述物质含量等同。
通过研究发现，脑啡肽酶抑制剂单用有轻度降压作用，能显著提升血浆ANP浓度，当与ACEI合用时，能增强后者的抗心衰作用(详见实施例)。在本发明中，引起心衰的基础疾病以原发性高血压及高血压性心脏病为主，也可以由其它疾病引起，如冠心病、风湿性心脏病等。
术语“药用剂量”是指为达到有效控制或治疗疾病的目的，临床医生根据患病个体病情严重程度对患病个体施与药物的剂量。应当理解本发明提供的药物药用剂量不是对本发明的限制，而是对本发明的优选，通常情况下，在该剂量优选范围内，该药物能够对患病个体产生有效的治疗效果。患病个体是指患有疾病的独立存在的生命体，在本发明中，生命体尤指人类。应当理解，现有技术中，人类药用剂量或药用剂量范围可与哺乳动物，如大鼠、小鼠等进行换算以得出适合相应动物适用的药用剂量或剂量范围。
本发明提供的药物组合物中的化合物在相同的制剂中可以同时施与患病个体，也可分别地相继施与患病个体。若是相继施与患病个体，则第二个(或附加的)活性成分施与的延迟不应当导致活性成分联合带来的有益效果的损失。若是同时施与患病个体，组合物中的化合物可以混合存在于同一个药物制剂形式中，也可以以同样的制剂形式分别独立存在。若是以同样的制剂形式分别独立存在，则药物组合物可以变通的以“组合药盒”形式存在。“组合药盒”是一种盒状容器，内置一种或多种剂量形式的药物组合及其使用说明书，在本发明中优选所述的ACEI类药物、脑啡肽酶抑制剂沙库比曲及叶酸类化合物。
本发明的另一个目的是提供含有药用剂量的ACEI及其活性代谢产物中的一种、药用剂量的脑啡肽酶抑制剂及其活性代谢产物或其盐类中的一种、药用剂量的叶酸类化合物和可药用载体的药物组合物在制备用于治疗心衰和预防脑卒中的药物中的用途。
本发明提供的药物组合物的剂型包括但不限于普通片剂、双层片剂、多层片剂、缓释片剂、单室控释片剂、双室控释片剂、微孔型控释片剂、舌下含片、口腔速崩片、分散片、肠溶片、颗粒剂、丸剂、肠溶胶囊、延迟释放片、定时/位释放片、普通胶囊、 缓释胶囊、控释胶囊、含有微丸或小片的胶囊、含有微丸或小片的pH依赖型胶囊、颗粒剂、口服液、膜剂或贴剂等剂型，其中优选片剂、胶囊或颗粒剂。
本发明的复方制剂可以每天服用一次或两次，或者以缓释或控释方式每天或隔天服用一次，其中优选每日服用1-2次。
本发明的有益效果是：本发明提供的药物组合物具有明显协同作用，即协同治疗慢性心力衰竭和预防脑卒中的作用。本发明还提供了上述药用剂量ACEI、脑啡肽酶抑制剂、叶酸类化合物组成的药物组合物在制备用于治疗心力衰竭和预防脑卒中的药物中的用途。
下面结合具体实施方式对本发明做进一步说明，并非对本发明的限定，凡依照本发明内容进行的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
具体实施方式
实施例1.制备沙库比曲20mg/依那普利5mg/叶酸0.4mg片(1000片量)
制备方法：将辅料过80目筛，干燥备用。取25g无水磷酸氢钙、5g马来酸依那普利按照等量递增法混合均匀，按照处方量分别加入沙库比曲、叶酸、微晶纤维素、羧甲淀粉钠、交联聚维酮和无水磷酸氢钙，用2％羟丙基甲基纤维素溶液制成软材，20目筛制粒，40℃干燥约2h，20目筛整粒，控制颗粒的含水量为2-3％，将干燥后的颗粒与硬脂酸镁、滑石粉混合均匀，半成品进行检测，测定含量，用压片机压制成1000片。制备过程中注意避光，制成的片剂需铝塑泡罩包装，避光保存。
实施例2.制备沙库比曲30mg/雷米普利2.5mg/叶酸0.4mg片(1000片)
制备方法：辅料为直压辅料，干燥备用。取处方量的雷米普利、叶酸及微晶纤维素30g按照等量递增法混合均匀，得到混粉1；称取剩余处方量的微晶纤维素、乳糖、交联羧甲基纤维素钠、胶态二氧化硅，与沙库比曲充分混匀，得到混粉2；将混粉1和混粉2与处方量的山愈酸甘油酯混合均匀，得最终混粉中间体，检测混粉中间体，压制成1000片。制备过程中注意避光，制成的片剂需铝塑泡罩包装，避光保存。
实施例3.制备沙库比曲40mg/贝那普利10mg/叶酸0.4mg胶囊(1000粒量)
制备方法：将原辅料80目筛，干燥备用。取40g沙库比曲、10g贝那普利、0.4g叶酸按照等量递增法混合均匀，分别加入乳糖、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠和低取代羟丙纤维素，混合均匀，用2％羟丙甲纤维素溶液制成软材，20目筛制粒，40℃干燥约2h，20目筛整粒，控制颗粒的含水量为2-3％，将干燥后的颗粒与滑石粉混合均匀，半成品进行检测，测定含量，装入空心胶囊即得。
实施例4.依那普利/沙库比曲/叶酸组方对心衰大鼠的治疗作用
一、方法
1.动物：Wistar大鼠40只，雌雄各半，体重200--240g，购自中国科学院上海实验动物中心。
2.造模方法：采用腹主动脉缩窄法(心脏后负荷增加)制作慢性心衰大鼠模型。大鼠行4％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，每公斤体重注射40mg，剑突下腹正中切口，分层打开腹腔，在肾动脉分支以上钝性游离腹主动脉，将7#注射器针头平行置于腹主动脉上，用4#手术丝线将腹主动脉和注射器一同结扎，然后缓慢将注射器撤出，关腹，分层缝合。使大鼠腹主动脉直径缩窄为0.7mm。正常对照组开腹后将手术丝线穿过腹主动脉，除不缩窄腹主动脉以外，其他操作与手术组完全相同。正常喂养3周，测定血液动力学指标，以确定慢性心衰模型是否成功。
3.分组给药及指标检测：将上述造模成功后的心衰大鼠随机分组，另设正常对照组大鼠10只，各组给药或处理情况见表1。采用灌胃给药，每天1次，连续3周。分别测定给药前、给药后不同时间大鼠心率(HR)、射血前期(PEP)、左室舒张时间(LVET)、每搏心输出量(SV)、每分心输出量(CO)。采用无创性心功能血流动力学监测系统。接好心电图的肢体导联，同步记录心电图和心阻抗-阶微分图。记录8-10个心动周期，求其平均值。系统自动采用Kubicek公式计算相关指标。另取大鼠静脉血1ml，用来检测血浆ANP浓度(ELISA法)。
4.统计学处理：所有实验数据，计量资料用均数±标准差(X±S)表示，两组间均数比较用t检验，计数资料用卡方检验。全部数据采用SPSS10.0软件进行分析。
二、结果
1、造模情况：(1)一般情况：于手术后第3周观察大鼠一般情况，以评价心衰程度，结果显示：腹主动脉缩窄法造成大鼠3周后出现明显心衰症状，模型组大鼠活动明显减少，爪背紫绀，水肿，尿量减少，与正常对照组有显著差异。(2)血流动力学变化：第3周手术组和对照组大鼠心功能变化情况见表2。模型组HR由381+52.4次/分上升到471±57.8次/分，LVET由80.3+24.0ms缩短至52.5+22.3ms，SV和CO均显著下降，提示模型组大鼠手术后3周心脏功能明显下降，而对照组心功能各项指标均无变化。组间比较HR、LVET、CO、SV均有显著性差异，说明模型组造模成功。(3) 病理观察：模型组电镜所见：心肌T-管及肌浆网池均呈高度至极度扩张成大串，有处大串连接成蔟。心肌线粒体于肌膜下增生成蔟、有的线粒体灶性溶解。心肌肌膜局部溶解、水肿，局部肌纤维溶解。散在的肌纤维有小灶性溶解。心肌束间微血管扩张，内皮细胞胞饮泡增多。正常对照组电镜所见：为正常心肌组织，均符合下列条件：核常染色质和异染色质分明，有大圆核仁。有丰富核仁协同染色质，有染色质周围及间颗粒。核周间隙狭窄而一致。线粒体完整，大而嵴清晰。心肌T-管及肌浆网少而不扩张。肌膜下无水肿。
表1：第3周手术组和对照组大鼠心功能变化情况
【注】最初用30只大鼠造模，造模后死亡4只，即最后有26只存活。
每组第3周测量值分别与本组第1周比较：*P＜0.05，**P＜0.01；模型组与对照组的比较：ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01。
2、依那普利/沙库比曲/叶酸与依那普利的比较：经3周治疗后，与模型组比较，依那普利组、依那普利/沙库比曲/叶酸组心衰大鼠第6周的血流动力学均得到显著改善，表现为心率及PEP下降、LVET及CO上升，依那普利组、依那普利/沙库比曲/叶酸组均提示对心衰的显著治疗作用。此外，与依那普利组比较，依那普利/沙库比曲/叶酸组血浆ANP浓度明显增高，血流动力学PEP下降、CO上升更为显著，提示对心衰的治疗作用有一定优势。
表2：第6周各组大鼠心功能及血浆ANP情况比较(n＝10)
与对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较：ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；
与依那普利组比较：#P＜0.05。
三、讨论
本研究采用腹主动脉缩窄法制作慢性心衰大鼠模型。心衰时血液动力学异常是产生临床充血症状的病理生理基础。左室功能障碍引起CO降低和左室舒张时间延长，前者导致组织器官血液灌注不足，后者引起肺血管嵌压升高。采用缩窄大鼠腹主动脉，造成压力负荷病理性增高，心脏作功增加，引起左心衰，最终导致全心衰。实验结果显示：腹主动脉缩窄3周后出现明显心衰症状，与正常对照组有显著性差异。模型组大鼠活动明显减少，爪背紫绀、水肿，与对照组比较有显著性差异。提示造模组大鼠心功能下降，全身血液灌注减少。心脏功收缩和舒张功能障碍分别引起CO降低和左室舒张末压力(LVEDP)增高。随着心输出量的减少，激活了各种神经内分泌的调节机制，使外周循环阻力增加，外周血液重新分配。
实验结果显示：模型组HR显著加快；LVET缩短，SV和CO均显著下降，提示模型组大鼠手术后3周心脏功能明显下降，而对照组心功能各项指标均无变化，说明造模成功。本实验采用无创性心功能血流动力学监测系统，在大鼠清醒状态下测量心功能血液动力学指标，克服了在麻醉状态下使用创伤性测量方法，从而避免了动物所处状态(清醒或麻醉)以及操作方法(有创或无创)不同而造成的对大鼠心功能的干扰。模型组大鼠手术3周后心脏收缩和舒张功能均明显降低，说明模型组大鼠心脏收缩和舒张功能明显下降。
本研究初步证实依那普利/沙库比曲/叶酸组方在对心衰治疗的显著疗效：经3周治疗后，与模型组比较，依那普利/沙库比曲/叶酸组心衰大鼠第6周的血流动力学均得到显著改善，表现为心率及PEP下降、LVET及CO上升，大鼠血浆ANP浓度亦明显增高，这些结果的综合提示对心衰的显著治疗作用。此外，与依那普利组比较，依那普利/沙库比曲/叶酸组ANP浓度明显增高，PEP下降、CO上升也更为显著，提示本组方对心衰的治疗作用有一定优势。
实施例5.雷米普利/沙库比曲/叶酸组方对心衰大鼠的治疗作用
一、方法
1.动物：Wistar大鼠48只，雌雄各半，体重205--245g，购自中国科学院上海实验动物中心。
2.造模方法：同实施例4。
3.分组给药及指标检测：将上述造模成功后的心衰大鼠随机分组，另设正常对照组大鼠12只，各组给药或处理情况见表4。采用灌胃给药，每天1次，连续3周。分别测定给药前、给药后不同时间大鼠心率(HR)、射血前期(PEP)、左室舒张时间(LVET)、每搏心输出量(SV)、每分心输出量(CO)。采用无创性心功能血流动力学监测系统。接好心电图的肢体导联，同步记录心电图和心阻抗-阶微分图。记录8-10个心动周期，求其平均值。系统自动采用Kubicek公式计算相关指标。另取大鼠静脉血1ml，用来检测血浆ANP浓度(ELISA法)。
4.统计学处理：所有实验数据，计量资料用均数±标准差(X±S)表示，两组间均数比较用t检验，计数资料用卡方检验。全部数据采用SPSS 10.0软件进行分析。
二、结果
1、造模情况：(1)一般情况：于手术后第3周观察大鼠一般情况，结果显示：腹主动脉缩窄法造成大鼠3周后出现明显心衰症状，模型组大鼠活动明显减少，爪背紫绀，水肿，尿量减少，与正常对照组有显著差异。(2)血流动力学变化：第3周手术组和对照组大鼠心功能变化情况见表3。模型组HR上升，LVET缩短，SV和CO显著下降，提示模型组大鼠手术后3周心脏功能明显下降，而对照组心功能各项指标均无变化，提示造模成功。(3)病理观察：模型组电镜见心肌T-管及肌浆网池均呈高度至极度扩张成大串，有处大串连接成蔟。心肌线粒体于肌膜下增生成蔟、有的线粒体灶性溶解。心肌肌膜局部溶解、水肿，局部肌纤维溶解。散在的肌纤维有小灶性溶解。正常对照组电镜未见上述病理改变。
表3：第3周手术组和对照组大鼠心功能变化情况
【注】最初用36只大鼠造模，造模后死亡5只，即最后有31只成功。
每组第3周测量值分别与本组第1周比较：*P＜0.05，**P＜0.01；模型组与对照组的比较：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。
2、雷米普利/沙库比曲/叶酸与雷米普利的比较：经3周治疗后，与模型组比较，雷米普利组、雷米普利/沙库比曲/叶酸组心衰大鼠第6周的血流动力学均得到显著改善，表现为心率及PEP下降、LVET及CO上升，雷米普利组、雷米普利/沙库比曲/叶酸组均提示对心衰的显著治疗作用。此外，与雷米普利组比较，雷米普利/沙库比曲/叶酸组血浆ANP浓度明显增高，血流动力学PEP下降、CO上升更为显著，提示对心衰的治疗作用有一定优势。
表4：第6周各组大鼠心功能及血浆ANP情况比较
与对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较：ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；
与雷米普利组比较：#P＜0.05。
三、讨论
实验结果显示：模型组HR显著加快；LVET缩短，SV和CO均显著下降，提示模型组大鼠手术后3周心脏功能明显下降，而对照组心功能各项指标均无变化，说明造模成功。本实验采用无创性心功能血流动力学监测系统，在大鼠清醒状态下测量心功能血液动力学指标，克服了在麻醉状态下使用创伤性测量方法，从而避免了动物所处状态(清醒或麻醉)以及操作方法(有创或无创)不同而造成的对大鼠心功能的干扰。模型组大鼠手术3周后心脏收缩和舒张功能均明显降低，说明模型组大鼠心脏收缩和舒张功能明显下降。
本研究初步证实雷米普利/沙库比曲/叶酸组方用于大鼠心衰时有显著疗效：经3周治疗后，与模型组比较，雷米普利/沙库比曲/叶酸组心衰大鼠第6周的血流动力学均得到显著改善，表现为心率及PEP下降、LVET及CO上升，大鼠血浆ANP浓度亦明显 增高，这些结果的综合提示对心衰的显著治疗作用。此外，与雷米普利组比较，雷米普利/沙库比曲/叶酸组ANP浓度明显增高，PEP下降、CO上升亦更为显著，提示本组方对心衰的治疗作用具有一定优势。