本发明涉及一种黄瓜籽提取物及其应用。
背景技术：
骨质疏松症(Osteoporosis)是以骨组织微结构破坏(如骨小梁疏松、变细、变薄、断裂)为特征的全身性骨量减少的病症，易导致运动机能障碍及骨质疏松性骨折。骨质疏松症致病机制是多样性的，并且受遗传因素的影响。骨质疏松症影响着世界上数百万人的生活质量，尤其是大部分绝经后的老年妇女及少部分的老年男性。生活质量的提高使得骨质疏松症越来越受到人们的重视，并很大程度关系到社会老龄化问题。
骨是由钙离子和磷所构成的结晶沉着于由胶原所组成的基质上形成。骨组织中含有两种重要的细胞：成骨细胞(osteoblast)和破骨细胞(osteoclast)。成骨细胞和破骨细胞在骨重建过程中起着关键作用，破骨细胞贴附于旧骨区域，分泌酸性物质和蛋白酶分别溶解矿物质和骨基质，形成骨吸收陷窝；其后，成骨细胞移行至被吸收部位，分泌骨基质，然后骨基质矿化形成新骨。在健康人体内的骨基质与骨矿物质之比呈一定状态，但骨质疏松症患者体内骨基质与骨矿物质这两种物质同时减少，原因是骨在形成过程中，以清除受损碎片形成骨洞为主要作用的破骨细胞和以沉积钙质填充骨洞为主要作用的成骨细胞间的相互协调遭到破坏，使骨溶解超过骨形成。导致骨代谢失衡、骨量减少、骨密度下降、骨折率升高。
技术实现要素：
为了更好地治疗骨质疏松症，本发明提供了三种黄瓜籽提取物及其作为蛋白表达促进剂的应用。
本发明黄瓜籽黄酮提取物按以下步骤提取获得：
一、黄瓜籽粗粉压榨除油后的黄瓜籽渣用质量浓度为70％的乙醇回流提取、浓缩；
二、取步骤一浓缩液过聚酰胺层析柱，依次用3～5倍体积的质量浓度为70％的乙醇和质量浓度为50％的乙醇洗脱，收集洗脱流出液；
三、去除洗脱流出液中的乙醇，即得到黄瓜籽黄酮提取物。
上述黄瓜籽黄酮提取物作为骨形态发生蛋白II(BMP-2)、SPARC蛋白和OPG/RANKL蛋白表达促进剂。
本发明黄瓜籽多糖提取物按以下步骤提取获得：
黄瓜籽粗粉压榨除油后的黄瓜籽渣加水加热回流，然后抽滤合并滤液，再将滤液浓缩并除去蛋白，之后加入乙醇至浓缩液中乙醇浓度为80％～85％，4℃静置8～12h，然后抽滤，沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，之后烘干，即得到黄瓜籽多糖提取物；其中，烘干温度≤60℃。
上述黄瓜籽多糖提取物作为骨形态发生蛋白II、SPARC蛋白和OPG/RANKL蛋白表达促进剂。
本发明黄瓜籽皂苷提取物按以下步骤提取获得：
一、黄瓜籽粗粉压榨除油后的黄瓜籽渣用质量浓度为70％的乙醇回流提取、浓缩；
二、取步骤一浓缩液溶于水中，然后加入乙酸乙酯萃取，再收集水层用水饱和正丁醇萃取，收集合并正丁醇层萃取液；
三、去除正丁醇层萃取液中的正丁醇，即得到黄瓜籽皂苷提取物。
上述黄瓜籽皂苷提取物作为骨形态发生蛋白II、SPARC蛋白和OPG/RANKL蛋白表达促进剂。
骨形态发生蛋白II(BoneMorphogeneticProtein-2,BMP-2)是一种具有潜在活性的蛋白质，当骨形态结构完整时它处于休眠状态，当骨组织损伤时它大量分泌，活性迅速增强。BMP-2主要分布于骨胶原纤维，骨膜及骨髓基质中，软骨附近及间充质细胞中也有。BMP-2的诱导成骨作用表现在：1、自身促进分化：骨基质中的BMP-2可以诱导骨髓干细胞使其分化为成骨细胞及成软骨细胞，通过钙盐沉积形成新骨。2、促进其它成骨因子的表达，BMP-2能够增加成骨细胞分化标志酶碱性磷酸酶和骨钙蛋白等基因的表达，促进骨小节形成及随后的骨层次化。
SPARC蛋白是非胶原糖蛋白中一种高亲和力的钙离子结合蛋白，对于骨组织的维持和重建是必需的。SPARC蛋白对成骨细胞和破骨细胞的作用主要表现在：1、SPARC蛋白可调节间充质干细胞的分化方向，使之更趋向于成骨细胞的形成。2、SPARC蛋白可以调节Wnt/β-catenin信号通路，抑制脂肪形成，促进成骨分化。3、SPARC蛋白是Runx2的直接靶基因，Runx2能上调成骨细胞前体细胞和软骨细胞中各种矿化相关蛋白基因的转录，促使向成骨细胞方向分化。
OPG作用于破骨细胞有三条途径:1、RANKL与RANK结合后促进破骨细胞的分化、成熟及增强其活性，OPG能竞争性与RANKL结合，从而抑制破骨细胞成熟和活化。2、破骨细胞膜上存在一种分子质量为140KD的蛋白质，OPG可以与该蛋白特异结合直接抑制破骨细胞功能。3、通过干扰基质细胞与破骨细胞之间的相互作用，诱导破骨细胞凋亡。因此，OPG/RANKL的比例协调是维持局部骨代谢平衡的关键。
本发明黄瓜籽黄酮提取物中总黄酮含量达65％以上；本发明黄瓜籽皂苷提取物中皂苷含量达50％以上；本发明黄瓜籽多糖提取物中多糖含量达52％以上。
本发明黄瓜籽提取物具有提取物明确、含量高的优点，而且显著提高骨形态发生蛋白II、SPARC蛋白和OPG/RANKL蛋白的表达水平。
本发明黄瓜籽黄酮提取物、黄瓜籽多糖提取物和黄瓜籽皂苷提取物都具有促进成骨细胞增殖、提高碱性磷酸酶活性、促进成骨细胞外基质矿化的作用，而且单一使用的效果优于混合。
本发明黄瓜籽提取物可用于作为抗骨质疏松药物的活性成分使用。
附图说明
图1是实施例4中黄瓜籽黄酮提取物、黄瓜籽多糖提取物和黄瓜籽皂苷提取物对MC3T3-E1细胞中BMP-2蛋白的mRNA相对表达量的影响统计图。
图2是实施例4中黄瓜籽黄酮提取物、黄瓜籽多糖提取物和黄瓜籽皂苷提取物对MC3T3-E1细胞中SPARC蛋白的mRNA相对表达量的影响统计图。
图3是实施例4中黄瓜籽黄酮提取物、黄瓜籽多糖提取物和黄瓜籽皂苷提取物对MC3T3-E1细胞中OPG/RANKL蛋白的mRNA相对表达量的影响统计图。
图4是实施例6中不同黄瓜籽提取物及三种黄瓜籽提取物的混合物在不同浓度条件下对MC3T3-E1细胞的增殖效果，图4中“●”曲线为黄瓜籽黄酮提取物对MC3T3-E1细胞增殖曲线，“■”曲线为黄瓜籽多糖提取物对MC3T3-E1细胞增殖曲线，“▲”曲线为黄瓜籽皂苷提取物对MC3T3-E1细胞增殖曲线，“◆”曲线为黄瓜籽提取物的混合物对MC3T3-E1细胞增殖曲线。
图5是实施例7中黄瓜籽黄酮提取物对胞外碱性磷酸酶活性的影响。
图6是实施例7中黄瓜籽多糖提取物对胞外碱性磷酸酶活性的影响。
图7是实施例7中黄瓜籽皂苷提取物对胞外碱性磷酸酶活性的影响。
图8是实施例7中相同浓度条件下，不同提取物、混合物、对照组对胞外碱性磷酸酶活性的影响。
图9是实施例8中培养基中加入浓度为5×10-2mg/ml～1×10-3mg/ml的黄瓜籽黄酮提取物、黄瓜籽多糖提取物以及黄瓜籽皂苷提取物培养28天，MC3T3-E1细胞形成钙化结节的图片。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式黄瓜籽黄酮提取物按以下步骤提取获得：
一、黄瓜籽粗粉压榨除油后的黄瓜籽渣用质量浓度为70％的乙醇回流提取、浓缩；
二、取步骤一浓缩液过聚酰胺层析柱，依次用3～5倍体积的质量浓度为70％的乙醇和质量浓度为50％的乙醇洗脱，收集洗脱流出液；
三、去除洗脱流出液中的乙醇，即得到黄瓜籽黄酮提取物。
本实施方式步骤三中的乙醇可以回收再利用。
具体实施方式二：本实施方式黄瓜籽多糖提取物按以下步骤提取获得：
黄瓜籽粗粉压榨除油后的黄瓜籽渣加水加热回流，然后抽滤合并滤液，再将滤液浓缩并除去蛋白，之后加入乙醇至浓缩液中乙醇浓度为80％～85％，4℃静置8～12h，然后抽滤，沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，之后烘干，即得到黄瓜籽多糖提取物；
其中，烘干温度≤60℃。
本实施方式中加水量为黄瓜籽渣质量的8～12倍，加热回流为2～5次，每次2±0.5h。
本实施方式加入的乙醇可选用质量浓度为95％的乙醇。
具体实施方式三：本实施方式黄瓜籽皂苷提取物按以下步骤提取获得：
一、黄瓜籽粗粉压榨除油后的黄瓜籽渣用质量浓度为70％的乙醇回流提取、浓缩；
二、取步骤一浓缩液溶于水中，然后加入乙酸乙酯萃取，再收集水层萃取液用水饱和正丁醇萃取，收集合并正丁醇层萃取液；
三、去除正丁醇层萃取液中的正丁醇，即得到黄瓜籽皂苷提取物。
本实施方式加入乙酸乙酯萃取2～4次，水饱和正丁醇萃取次数为2～4次。
具体实施方式四：本实施方式黄瓜籽黄酮提取物作为骨形态发生蛋白II、SPARC蛋白和OPG/RANKL蛋白表达促进剂。
具体实施方式五：本实施方式黄瓜籽多糖提取物作为骨形态发生蛋白II、SPARC蛋白和OPG/RANKL蛋白表达促进剂。
具体实施方式六：本实施方式黄瓜籽皂苷提取物作为骨形态发生蛋白II、SPARC蛋白和OPG/RANKL蛋白表达促进剂。
实施例1
黄瓜籽黄酮提取物按以下步骤提取获得：
一、黄瓜籽粗粉压榨除油后的黄瓜籽渣500g用质量浓度为70％的乙醇回流提取、浓缩；
二、取步骤一浓缩液过聚酰胺层析柱，依次用3倍体积的质量浓度为70％的乙醇和质量浓度为50％的乙醇洗脱，收集洗脱流出液；
三、去除洗脱流出液中的乙醇，即得到黄瓜籽黄酮提取物2.73g。
采用紫外分光光度法，以芦丁为标准品，测得本实施例黄瓜籽黄酮提取物中总黄酮含量为67.98％。
实施例2
黄瓜籽多糖提取物按以下步骤提取获得：
黄瓜籽粗粉压榨除油后的黄瓜籽渣200g加水2000ml加热回流3次、每次2h，然后抽滤合并滤液，再将滤液浓缩并除去蛋白，之后加入质量浓度为95％的乙醇至浓缩液中乙醇浓度上升到80％，4℃静置8～12h，然后抽滤，沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，之后60℃烘干，即得到黄瓜籽多糖提取物5.67g。
采用紫外分光光度法，以葡萄糖为标准品，测得本实施例黄瓜籽多糖提取物中多糖的含量为53％。
实施例3
黄瓜籽皂苷提取物按以下步骤提取获得：
一、黄瓜籽粗粉压榨除油后的黄瓜籽渣500g用质量浓度为70％的乙醇回流提取、浓缩；
二、取步骤一浓缩液溶于水中，然后加入乙酸乙酯萃取3次，再收集水层萃取液用水饱和正丁醇萃取3次，收集合并正丁醇层萃取液；
三、去除正丁醇层萃取液中的正丁醇，即得到黄瓜籽皂苷提取物3.71g。
采用紫外分光光度法，以齐墩果酸为标准品，测得本实施例黄瓜籽皂苷提取物中皂苷含量为50.22％。
实施例4
实施例1、2和3获得的黄瓜籽提取物既可以口服，也可以注射使用。
接种1.0×106个小鼠颅顶成骨细胞(MC3T3-E1细胞)于6孔板12小时待细胞贴壁后，换为含药无血清α-MEM培养基，含药无血清α-MEM培养基分为3组，第一组培养基中黄瓜籽黄酮提取物终浓度为1×10-2mg/ml、第二组培养基中黄瓜籽多糖提取物终浓度为1×10-2mg/ml、第三组培养基中黄瓜籽皂苷提取物终浓度为1×10-2mg/ml，作用24小时后用TRIZOL提取总RNA，再用小鼠的BMP-2蛋白、SPARC蛋白和OPG、RANKL蛋白的cDNA引物进行RT-PCR，并选β-actin作为内参照物。
本实施例反转录反应：42℃、15min；85℃、5sec；4℃forever；反应结束后，-20℃冻存备用。
本实施例中小鼠MC3T3-E1细胞BMP-2蛋白、SPARC蛋白和OPG、RANKL蛋白cDNA引物如表1所示。
表1
本实施例RT-PCR反应体系为50μl，如表2所示。扩增条件：
预变性95℃、30s；变性95℃、5s，退火60℃、30s，延伸72℃、30s，循环40次，最后延伸72℃、300s。
表2
确认RealTimePCR的扩增曲线和融解曲线，制作定量PCR标准曲线。采用2-ΔΔCT方法来比较RNA水平上的表达差异，MC3T3-E1细胞中BMP-2蛋白、SPARC蛋白和OPG/RANKL蛋白的mRNA水平如图1～3所示。实验结果证明黄瓜籽黄酮提取物、黄瓜籽多糖提取物和黄瓜籽皂苷提取物都能够显著提高MC3T3-E1细胞中BMP-2、SPARC和OPG/RANKL的mRNA水平。
实施例5
接种1.0×106个小鼠颅顶成骨细胞(MC3T3-E1细胞)于6孔板12小时待细胞贴壁后，换为含药无血清α-MEM培养基，含药无血清α-MEM培养基分为3组，第一组培养基中黄瓜籽黄酮提取物终浓度为1×10-2mg/ml、第二组培养基中黄瓜籽多糖提取物终浓度为1×10-2mg/ml、第三组培养基中黄瓜籽皂苷提取物终浓度为1×10-2mg/ml，分别作用24、48、96小时后提取总蛋白，进行Westernblotting实验，并选β-actin作为内参。
黄瓜籽黄酮提取物、多糖提取物及皂苷提取物作用24h、48h、96h后MC3T3-E1细胞内BMP-2、OPG/RANKL、SPARC的蛋白表达量都明显高于空白对照组。说明黄瓜籽黄酮提取物、多糖提取物及皂苷提取物均可提高MC3T3-E1细胞BMP-2、OPG/RANKL、SPARC蛋白的表达。
实施例6
小鼠MC3T3-E1细胞培养于含10％胎牛血清的α-MEM培养基中，传代后进行下列试验。
MTT试验测定细胞增殖率：
1、将小鼠MC3T3-E1细胞悬浮在含10％胎牛血清的α-MEM培养基中，调整细胞浓度为5×104个/ml，接种于96孔培养板，每孔150μl，于37℃，5％CO2的培养箱中培养24小时；
2、更换含药的无血清α-MEM培养基，分为4组，每组梯度浓度加入黄瓜籽提取物，第一组培养基中加黄瓜籽黄酮提取物、第二组培养基中加黄瓜籽多糖提取物、第三组培养基中加黄瓜籽皂苷提取物、第四组培养基中按1:1:1的质量浓度混合加黄瓜籽多糖、黄瓜籽皂苷和黄瓜籽黄酮三种提取物，每个浓度设3个复孔，并设空白对照组；
3、继续培养24小时，每孔加入20μlMTT(5mg/ml)，继续孵育4小时，弃上清液，每孔加入150μlDMSO，低速振摇10～15min使紫色结晶颗粒完全溶解，于544nm处测吸收值(OD544)。
实验结果如图4所示，说明黄瓜籽黄酮提取物、黄瓜籽多糖提取物、黄瓜籽皂苷提取物均明显增加MC3T3-E1细胞增殖作用，上述三种黄瓜籽提取物的混合物也具有对MC3T3-E1细胞增殖作用，但细胞增殖效果均低于单一提取物，说明三种黄瓜籽提取物之间存在相互作用，从而降低对细胞的增殖作用。
实施例7
细胞外碱性磷酸酶的活性测定：
1、将小鼠MC3T3-E1细胞悬浮在含10％胎牛血清的α-MEM培养基中，调整细胞浓度为5×104个/ml，接种于24孔培养板，每孔600μl，于37℃，5％CO2培养箱中培养24小时；
2、更换含药的无血清α-MEM培养基分为4组，每组梯度浓度加入黄瓜籽提取物，第一组培养基中加黄瓜籽黄酮提取物、第二组培养基中加黄瓜籽多糖提取物、第三组培养基中加黄瓜籽皂苷提取物、第四组培养基中按1:1:1的质量浓度混合加黄瓜籽多糖、黄瓜籽皂苷和黄瓜籽黄酮三种提取物，每个浓度设3个复孔，并设空白对照组；
3、继续培养24小时，另取一块96孔板，吸取对应的培养液20μl，分别依次加入试剂盒提供的试剂，孵育混匀后在520nm下检测各孔吸光度值。
实验结果如图5～8所示，碱性磷酸酶是参与骨代谢的重要蛋白质，通过分解磷酸脂的无机磷，增加其局部浓度，促进成骨细胞分化使类骨质迅速钙化。本发明黄瓜籽黄酮提取物、黄瓜籽多糖提取物、黄瓜籽皂苷提取物在1×10-2mg/ml～1×10-3mg/ml浓度下培养24小时，能显著促进小鼠颅顶成骨细胞MC3T3-E1的碱性磷酸酶活性，可以通过增加碱性磷酸酶活性，促进成骨细胞的成骨作用。上述三种黄瓜籽提取物的混合物也具有促进小鼠颅顶成骨细胞MC3T3-E1的碱性磷酸酶活性的作用，但效果弱于单一黄瓜籽提取物。
实施例8
钙化结节形成检测实验：
1、将小鼠MC3T3-E1-14细胞悬浮在含10％胎牛血清的α-MEM培养基中，调整细胞浓度为5×104个/ml，接种于24孔培养板，每孔600μl，于37℃，5％CO2培养箱中培养24小时；
2、更换含不同浓度黄瓜籽提取物的诱导培养基，诱导培养基以α-MEM培养基为主体含10％胎牛血清、1％双抗、10mmol/Lβ-甘油磷酸盐和50μg/mlL-抗坏血酸；分成4组，第一组培养基中加黄瓜籽黄酮提取物、第二组培养基中加黄瓜籽多糖提取物、第三组培养基中加黄瓜籽皂苷提取物、第四组培养基中按1:1:1的质量浓度混合加黄瓜籽多糖、黄瓜籽皂苷和黄瓜籽黄酮三种提取物；
3、每3天更换一次步骤2诱导培养基，培养28天；
4、吸取上清，培养皿用PBS冲洗两次，90％乙醇固定10min，双蒸水冲洗3次；
5、0.5％茜素红-Tris-HCl(pH8.3)37℃，1小时；
6、蒸馏水冲洗3次，照相。
提取物浓度为5×10-2mg/ml～1×10-3mg/ml下培养28天的实验结果如图9所示，本发明黄瓜籽黄酮提取物、黄瓜籽多糖提取物、黄瓜籽皂苷提取物能显著促进MC3T3-E1-14细胞外基质矿化，说明黄瓜籽各提取物可通过增加细胞外基质矿化，促进成骨细胞的成骨作用。上述三种黄瓜籽提取物的混合物对成骨细胞也有矿化作用，但效果明显低于单一黄瓜籽提取物。