技术领域本发明提供一种纳米金CT造影剂及其制备方法，该方法制备的造影剂适用于肝癌早期的CT检测，属于生物医药技术领域。
背景技术：
目前，全球的原发性肝癌死亡率在恶性肿瘤中居第三位，我国肝癌的发病率和死亡率均占全球的半数以上(L.A.Torre,F.Bray,R.L.Siegel,J.Ferlay,J.Lortet-Tieulent,A.Jemal,Globalcancerstatistics,2012,CA.CancerJ.Clin.65(2015)87–108.doi:10.3322/caac.21262.)。肝癌高死亡率的原因主要有两个：一是早期诊断困难，肝癌属于深层肿瘤(深度为2.5-10厘米)，常存在于肝脏深部，一经发现往往已属中晚期；二是病情进展快，化疗效果差，加大化疗药物剂量，易伤及其它脏器。因此，实现肝癌的早期诊断(提高检测灵敏度)十分重要。计算机断层扫描技术(CT)在肝癌的诊断中具有广泛应用。其中，成像造影剂可以加强组织之间、正常组织与病灶之间的信号对比度(H.Lusic,M.W.Grinstaff,X-ray-ComputedTomographyContrastAgents,Chem.Rev.113(2013)1641–1666.doi:10.1021/cr200358s.)，为肝癌的早期诊断、准确诊断及后期治疗提供必要的依据。目前临床上CT的造影剂主要是碘类小分子类造影剂，它的特异性差、信号强度较低，很难实现对肝癌的早期诊断，同时存在一定的毒性(D.Kim,S.Park,J.H.Lee,Y.Y.Jeong,S.Jon,AntibiofoulingPolymer-CoatedGoldNanoparticlesasaContrastAgentforinVivoX-rayComputedTomographyImaging,J.Am.Chem.Soc.129(2007)7661–7665.doi:10.1021/ja071471p.)。因此发展高效、灵敏、安全的造影剂对实现肝癌的早期诊断、准确诊断至关重要。纳米金是近年来被广泛研究的纳米材料之一，具有较高的电子密度和X射线吸收系数(在100KeV下，金的吸收系数为5.16cm2/g，是传统碘造影剂的2-3倍)，因此若能将纳米金用于CT造影剂，就有助于实现肝癌的准确诊断和早期诊断。研究表明，纳米金的衰减系数与纳米金的质量浓度相关，即纳米金在造影部位的浓度越高，CT成像效果越好(R.D.Ross,L.E.Cole,J.M.R.Tilley,R.K.Roeder,EffectsofFunctionalizedGoldNanoparticleSizeonX-rayAttenuationandSubstrateBindingAffinity,Chem.Mater.26(2014)1187–1194.doi:10.1021/cm4035616.)。因此，如何提升纳米金造影剂在造影部位的靶向能力，实现其在造影部位的高浓度富集是研究人员致力解决的问题。而单纯引入靶向配体(即主动靶向)并不能显著提高纳米金在肝脏的富集量。活体实验数据表明，能够富集到肿瘤组织的纳米粒子通常不足注射量的5％，大部分在进入肿瘤细胞之前即被清除出体外(S.Mura,J.Nicolas,P.Couvreur,Stimuli-responsivenanocarriersfordrugdelivery,Nat.Mater.12(2013)991–1003.doi:10.1038/nmat3776.)。除靶向配体修饰外，纳米粒子粒径对其在肿瘤组织富集也有重要影响(H.Maeda,H.Nakamura,J.Fang,TheEPReffectformacromoleculardrugdeliverytosolidtumors:Improvementoftumoruptake,loweringofsystemictoxicity,anddistincttumorimaginginvivo,Adv.DrugDeliv.Rev.65(2013)71–79.doi:10.1016/j.addr.2012.10.002.)。众所周知，100-200nm左右的粒子能较好地利用EPR效应(即被动靶向)聚集到肿瘤部位，但研究表明这些尺寸的纳米粒子大多分布在肿瘤部位的血管内，只有很少的部分能渗透进入肿瘤组织(C.Wong,T.Stylianopoulos,J.Cui,J.Martin,V.P.Chauhan,W.Jiang,etal.,Multistagenanoparticledeliverysystemfordeeppenetrationintotumortissue,Proc.Natl.Acad.Sci.108(2011)2426–2431.doi:10.1073/pnas.1018382108.)。而诸多研究表明，小粒径的纳米金对肿瘤组织的渗透滞留性能更好。本课题组已有工作表明，在小粒径纳米金表面连接肝靶向配体及恰当的酸敏感基团和疏水基团，使纳米金的聚集与分散呈现pH响应性。pH7.4时(血液)纳米金以聚集形式存在，组装体对其上的靶向配体具有很好的屏蔽作用；pH6.8时(肿瘤部位)解组装，靶向配体暴露，显示主动靶向功能(见图1)。重要的是，如此的配体被“屏蔽-去屏蔽”过程具有很好的可逆性，这样就可以延长血液循环时间，反复利用主动及被动靶向作用，有利于增大纳米金显影剂在靶部位的浓度。但是该体系在CT造影所需的浓度(0.1M)下稳定性差，不适宜动物CT实验。因此，如何构建既有以上可逆的配体屏蔽-去屏蔽的性质，同时又能适宜动物成像的纳米金CT造影剂，是本发明致力解决的问题。
技术实现要素：
本发明目的是设计并提供一种具有CT造影剂功能的纳米金CT造影剂及其制备方法，制备出具有pH响应的配体可逆屏蔽-去屏蔽肝靶向纳米金CT造影剂。本发明技术方案一种用于肝癌早期诊断的纳米金CT造影剂，该造影剂结构为AuNPsLA-N(iPr)2,LA-PEG3.5k-GA,LA-PEG2k。其中，纳米金粒径为18-25nm，表面修饰的三种物质的摩尔比为n(LA-N(iPr)2)∶n(LA-PEG3.5k-GA)∶n(LA-PEG2k)＝1∶1∶(3-5)。一种用于肝癌早期诊断的纳米金CT造影剂的制备方法，本发明在具有配体可逆屏蔽-去屏蔽的纳米金表面，修饰连接有硫辛酸(LA)的聚乙二醇两千(LA-PEG2k)，获得了适宜体内CT成像功能的纳米金CT造影剂；CT成像实验表明，本发明设计制备的纳米金CT造影剂可对荷瘤鼠(小鼠H22肝癌肿瘤)皮下异位瘤与肝癌原位瘤进行CT成像。本发明方法的具体步骤如下：第1、纳米金(AuNPs)制备：采用柠檬酸钠还原法，制备出水合粒径为18-25nm(动态光散射(DLS)方法测试)的纳米金溶液，金元素浓度为0.18mg/mL。第2、硫辛酸修饰的N-二异丙基乙二胺(LA-N(iPr)2)制备：使用硫辛酸(LA)与N-二异丙基乙二胺，在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)催化下进行酰胺化反应，20-40℃下反应6-12小时。反应结束后，使用蒸馏水进行水洗与分液，然后使用无水硫酸钠对二氯甲烷相进行过夜干燥。最后将二氯甲烷旋干，得到黄色固体即胺分子LA-N(iPr)2。利用高分辨质谱(ESI-HRMS)确认其结构。第3、硫辛酸聚乙二醇修饰的甘草次酸(LA-PEG3.5k-GA)制备：采取丁二酰化改性GA，使用二环己基碳二亚胺(DCC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)做催化剂，并取NH2-PEG3.5k-OH加入到GA、DCC以及NHS的二氯甲烷溶液中，进行酰胺化反应，0℃下搅拌20-40分钟，20-40℃下反应两天。将反应混合液在冰乙醚中沉淀，过滤得到白色固体，真空过夜干燥。然后将产物与硫辛酸(LA)进行酯化反应，使用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)与4-二甲氨基吡啶(DMAP)进行催化，于二氯甲烷溶液中0℃下搅拌20分钟，然后35℃下反应两天。旋干二氯甲烷，固体透析两天(截留分子量3.5k)，冻干，得到白色粉末。利用核磁共振(NMR)确认其结构。第4、硫辛酸修饰的聚乙二醇(LA-PEG2k)的合成：通过酯化反应，制备硫辛酸修饰的聚乙二醇两千(LA-PEG2k)，并通过核磁共振(NMR)确认了硫辛酸-聚乙二醇两千(LA-PEG2k)的结构。以上4步为相互独立的步骤，可以分别同时进行，其先后顺序也可以互换而对本发明方法没有任何影响。第5、纳米金CT造影剂AuNPsLA-N(iPr)2,LA-PEG3.5k-GA,LA-PEG2k制备：通过金硫键将第4步制备的硫辛酸-聚乙二醇两千(LA-PEG2k)与第2步制备的胺分子(LA-N(iPr)2)、第3步制备的靶向配体甘草次酸(LA-PEG3.5k-GA)按照摩尔比为1∶1∶(3-5)的比例共同修饰在第1步制备的纳米金(AuNPs)表面，得到AuNPsLA-N(iPr)2,LA-PEG3.5k-GA,LA-PEG2k；即纳米金CT造影剂。第6、小鼠CT实验：通过分批离心对第5步得到的纳米金CT造影剂AuNPsLA-N(iPr)2,LA-PEG3.5k-GA,LA-PEG2k进行离心处理，首次离心25000转/分钟，45分钟；二次离心15000转/分钟，60分钟，得到了具备小鼠CT成像能力所需浓度的纳米金CT造影剂浓缩液，其中金元素浓度为0.15M。H22荷瘤鼠异位瘤模型建立：取腹腔传代H22肝癌细胞的昆明小鼠，无菌抽取腹水，生理盐水调整肝癌细胞数至1×108/mL的细胞悬液，直接注射接种于小鼠腋下体侧皮下，待肿块生长至1.5cm3时，即形成H22荷瘤鼠异位瘤模型。异位瘤荷瘤鼠CT成像实验：向浓缩后的纳米金造影剂溶液中加入葡萄糖，将葡萄糖调制成5％质量浓度，以适应体内注射。经荷瘤鼠尾静脉注射(每组3只)，注射体积300μL，浓度0.15M。荷瘤鼠经100-140μL水合氯醛(质量分数10％)腹腔麻醉后，使用CT机进行CT扫描，分别在注射前、注射后0.5h、1h、2h、4h以及6h进行扫描，记录皮下瘤位置的测试值，其单位为CT值，即HounsfieldUnit(HU)。H22荷瘤鼠原位瘤模型建立：接种前，无菌状态下完整取出步骤1中荷瘤鼠的瘤组织，放入生理盐水中，剔除外周的纤维组织、血管及中央坏死组织，切成约1mm3瘤块备用。利用肝内隧道植入法构建原位肝癌。原位瘤荷瘤鼠CT成像实验：方法同异位瘤荷瘤鼠CT成像实验，对肝脏原位肿瘤进行CT成像。两组CT成像实验结果表明，较无靶向能力对照组以及不具备配体可逆屏蔽的靶向对照组，本发明制备的纳米金CT造影剂具备更好的肿瘤靶向能力，即具备更好的CT成像能力。本发明的优点和积极效果：本发明通过合理设计，向连有靶向配体甘草次酸以及pH敏感胺分子的纳米金表面修饰聚乙二醇两千(PEG2k)，显著地提高了体系在CT成像所需浓度(0.1M)下的稳定性，获得了适宜体内CT成像所需浓度的CT造影剂。同时保证体系具有pH敏感的配体可逆屏蔽-去屏蔽的功能，将主动靶向与被动靶向结合，提高纳米金在肿瘤成像部位的富集与组织渗透，获得优异的CT成像效果。小鼠CT成像实验表明，本发明造影剂具有良好的生物相容性，并可对荷瘤鼠(小鼠H22肝癌肿瘤)皮下异位瘤与肝癌原位瘤进行CT成像。附图说明图1是背景技术部分中，已有工作即具有pH敏感的纳米金组装-解组装用于配体屏蔽-去屏蔽的示意图。图2是实施例2中，纳米金CT造影剂(AuNPsLA-N(iPr)2,LA-PEG3.5k-GA,LA-PEG2k)组装-解组装示意图。图3是实施例1中LA-PEG2k的NMR谱图。图4是实施例1中AuNPs的粒径图(DLS测试)。图5是实施例1中LA-PEG3.5k-GA的NMR谱图。图6是实施例1中纳米金CT造影剂((AuNPsLA-N(iPr)2,LA-PEG3.5k-GA,LA-PEG2k)的粒径图(DLS表征)。图7是实施例2中纳米金CT造影剂(实验组1∶4)的粒径-pH图以及粒径与pH循环变化关系图。图8是实施例2中纳米金CT造影剂(对照组1)的粒径-pH图。图9是实施例2中BCA法测定纳米金CT造影剂对于配体屏蔽性质的蛋白吸附图。图10是实施例3中纳米金CT造影剂浓缩稳定性的效果图。图11是实施例4中纳米金CT造影剂用于异位瘤荷瘤鼠CT成像的HU-时间图。图12是实施例4中纳米金CT造影剂用于原位瘤荷瘤鼠CT成像的HU-时间图。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1：用于肝癌早期诊断的纳米金CT造影剂的制备1)LA-PEG2k的合成：称取2g单端甲氧基mPEG2k-OH与0.206g硫辛酸(LA)(其摩尔量比为LA：mPEG2k-OH＝5∶1)加入到50mL圆底烧瓶中，向其中加入960mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)与610mg4-二甲氨基吡啶(DMAP)，使用30mL二氯甲烷(DCM)溶解。冰水浴中搅拌30分钟，而后35℃水浴下反应2天。反应结束后，将二氯甲烷旋蒸除去。使用蒸馏水将剩余固体溶解，转移至透析袋(截留分子量2k)透析两天。冻干，得到LA-PEG2k白色粉末状固体。利用NMR表征，见附图3。2)LA-PEG4k和LA-PEG10k的合成：方法同步骤1。3)AuNPs制备：称取59mg三水合四氯金酸，溶于150mL去离子水中，于250mL圆底烧瓶中加热至沸腾30分钟。称取171mg柠檬酸钠，溶于15mL去离子水中，快速加入到氯金酸的沸腾水溶液中，继续加热至沸腾30分钟，降至室温，得到AuNPs水溶液，金元素质量浓度为0.18mg/mL。利用DLS表征，见附图4。4)胺分子LA-N(iPr)2制备：称取硫辛酸(LA)206mg与N-二异丙基乙二胺144mg溶于20mL二氯甲烷中，室温下搅拌30分钟。然后加入200mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)，35℃下反应6小时。反应结束后，使用蒸馏水进行水洗与分液，然后使用无水硫酸钠对有机相进行过夜干燥。最后将二氯甲烷旋干，得到LA-N(iPr)2黄色固体。高分辨质谱(ESI-HRMS):333.2030(M+1)表征合成成功。5)胺分子LA-N(Me)2制备：方法同步骤4，将N-二异丙基乙二胺换成N-二甲基乙二胺。6)LA-PEG3.5k-GA制备：称取320mg丁二酰化改性GA，103mg二环己基碳二亚胺(DCC)与57mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于30mL二氯甲烷并至于冰水浴中，称取1.7gNH2-PEG3.5k-OH加入到上述混合溶液中，0℃下搅拌30分钟，35℃下反应两天。将反应混合液在冰乙醚中沉淀，过滤得到白色固体，真空过夜干燥。然后称取515mg硫辛酸(LA)，479mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)与305mg4-二甲氨基吡啶(DMAP)，加入到白色固体的二氯甲烷溶液中，0℃下搅拌20分钟，然后35℃下反应两天。旋干二氯甲烷，固体透析两天(截留分子量3.5k)，冻干，得到LA-PEG3.5k-GA白色粉末。利用NMR表征，见附图5。7)纳米金CT造影剂(AuNPsLA-N(iPr)2,LA-PEG3.5k-GA,LA-PEG2k)的制备：取0.1mgLA-N(iPr)2溶于1mL蒸馏水中，加入100μLHCl溶液(pH1)，室温下搅拌30分钟。然后加入0.12mL浓度为10mg/mL的LA-PEG3.5k-GA溶液与0.12mL浓度为20mg/mL的LA-PEG2k溶液，即三种物质的物质的量的比为n(LA-N(iPr)2)∶n(LA-PEG3.5k-GA)∶n(LA-PEG2k)＝1∶1∶4，继续搅拌5min。加入6mLAuNPs溶液，室温搅拌过夜，即得到纳米金CT造影剂，将其标记为实验组1∶4。利用DLS表征，见附图6。对于LA-PEG3.5k-GA与LA-PEG2k的摩尔比为1∶2和1∶6两组，制备方法同1∶4，将得到的纳米金CT造影剂分别标记为实验组1∶2与实验组1∶6。8)纳米金CT造影剂(AuNPsLA-N(iPr)2,LA-PEG3.5k-GA)的制备：方法同步骤7。将其标记为实验组1∶0。9)纳米金CT造影剂(AuNPsLA-N(iPr)2,LA-PEG3.5k-GA,LA-PEG4k)的制备：方法同步骤7，其中n(LA-N(iPr)2)∶n(LA-PEG3.5k-GA)∶n(LA-PEG4k)＝1∶1∶4，将其标记为实验组1∶4(PEG4k)。10)纳米金CT造影剂(AuNPsLA-N(iPr)2,LA-PEG3.5k-GA,LA-PEG10k)的制备：方法同步骤7，其中n(LA-N(iPr)2)∶n(LA-PEG3.5k-GA)∶n(LA-PEG10k)＝1∶1∶4，将其标记为实验组1∶4(PEG10k)。11)纳米金CT造影剂(AuNPsLA-N(Me)2,LA-PEG3.5k-GA,LA-PEG2k)的制备：方法同步骤7，将其标记为对照组1。12)纳米金CT造影剂(AuNPsLA-PEG4k)的制备：加入0.12mL浓度为10mg/mL的LA-PEG4k溶液，继续搅拌5min。加入6mLAuNPs溶液，室温搅拌过夜，即得到纳米金CT造影剂，将其标记为对照组2。实施例2：纳米金CT造影剂配体屏蔽-去屏蔽考察：1)纳米金CT造影剂组装-解组装考察对纳米金CT造影剂，考察其在正常组织(pH7.4)与肿瘤条件(pH6.8)下的组装-解组装性质。以实验组1∶4(见附图2)与对照组1为例，具体如下：向纳米金溶液中逐滴加入NaOH溶液(pH13)至pH8-9，待体系出现显著增强的丁达尔现象后，分别取组装体溶液400μL，加入800μL缓冲溶液HEPESpH7.4与HEPESpH6.8，利用动态光散射(DLS)考察在不同pH下的粒径，组装体粒径100-200nm，解组装粒径30-40nm，用以说明体系的组装-解组装性质。然后反复调节溶液pH在pH7.4与pH6.8之间变化，测试体系的粒径变化，用以考察pH敏感的可逆组装-解组装。见附图7(实验组1∶4)与附图8(对照组1)。将组装-解组装结果汇总(见表1)。表1具备组装性质不具备组装性质实验组1∶0√实验组1∶2√实验组1∶4√实验组1∶4(PEG4k)√实验组1∶4(PEG10k)√实验组1∶6√对照组1√对照组2√2)纳米金CT造影剂配体屏蔽性考察牛血清白蛋白(BSA)与甘草次酸(GA)具有较强的疏水结合能力，纳米粒子表面GA越多，则吸附蛋白越多。喹啉甲酸法(BCA法)是最常用的检测蛋白浓度方法之一，其灵敏度高，且检测不受绝大多数化学物质的影响。为比较两种状态粒子表面GA含量差异，选用BCA试剂盒来测定两种状态纳米金的蛋白吸附量(即向一定浓度BSA溶液中加入纳米金溶液，待蛋白吸附平衡后，测定溶液中剩余的蛋白浓度)，用以评价体系组装-解组装对于靶向配体甘草次酸(GA)的屏蔽效果。测试结果见附图9。附图9的BCA测试结果表明，实验组1∶0、实验组1∶2与实验组1∶4在pH7.4下具备对GA的屏蔽效果，而pH6.8下解组装有利于配体GA的去屏蔽。实施例3：纳米金CT造影剂浓缩稳定性考察：采用批次离心，对修饰后的纳米金溶液(即纳米金CT造影剂)进行浓缩。首次离心(25000转/分钟，45分钟)，将批量纳米金液体进行约20倍浓缩；二次离心(15000转/分钟，60分钟)，将首次离心得到的浓缩液进一步约8倍浓缩。最终得到适宜荷瘤鼠CT成像所需浓度(0.1M)的纳米金浓缩液(0.15M)。实验组1∶0与实验组1∶2出现沉淀，说明造影剂在造影浓度下稳定性差，不适宜体内CT成像。测试结果见附图10。综合实施例2与实施例3，确认适合体内造影的纳米金CT造影剂为实验组1：4(2k)(即AuNPsLA-N(iPr)2,LA-PEG3.5k-GA,LA-PEG2k)、对照组1(即AuNPsLA-N(Me)2,LA-PEG3.5k-GA,LA-PEG2k)以及对照组2(即AuNPsLA-PEG4k)。实施例4：小鼠CT成像实验1)H22荷瘤鼠异位瘤模型建立：取腹腔传代H22肝癌细胞的昆明小鼠，无菌抽取腹水，生理盐水调整肝癌细胞数至1×108/mL的细胞悬液，直接注射接种于小鼠腋下体侧皮下，待肿块生长至1.5cm3时，即形成H22荷瘤鼠异位瘤模型。2)异位瘤荷瘤鼠CT成像实验：以实验组1：4为例，将浓缩后的纳米金造影剂溶液调制成5％葡萄糖溶液浓度，经荷瘤鼠尾静脉注射(n＝3)，注射体积300μL，浓度0.15M。荷瘤鼠经100-140μL水合氯醛(质量分数10％)腹腔麻醉后，使用CT机进行CT扫描，分别在注射前、注射后0.5h、1h、2h、4h以及6h进行扫描，记录皮下瘤位置的测试值，其单位为HounsfieldUnit(HU)。测试结果见附图11。3)H22荷瘤鼠原位瘤模型建立：接种前，无菌状态下完整取出步骤1中荷瘤鼠的瘤组织，放入生理盐水中，剔除外周的纤维组织、血管及中央坏死组织，切成约1mm3瘤块备用。利用肝内隧道植入法构建原位肝癌，即小鼠麻醉后开腹，暴露肝左叶，用麻醉套管针在肝叶上刺孔，将切好的异位移植瘤块植入肝叶内，缝合关腹。1周后随机处死5只接种原位肝癌昆明小鼠，取出肿瘤进行组织学分析后，确认实验模型建立成功。4)原位瘤荷瘤鼠CT成像实验：方法同步骤2，对肝脏原位肿瘤进行CT成像。测试结果见附图12。实施例5：纳米金CT造影剂(AuNPsLA-N(iPr)2,LA-PEG3.5k-GA,LA-PEG2k)的制备：其中，n(LA-N(iPr)2)∶n(LA-PEG3.5k-GA)∶n(LA-PEG2k)＝1∶1∶3。方法同实施例1中步骤1-步骤7。实施例6：纳米金CT造影剂(AuNPsLA-N(iPr)2,LA-PEG3.5k-GA,LA-PEG2k)的制备：其中，n(LA-N(iPr)2)∶n(LA-PEG3.5k-GA)∶n(LA-PEG2k)＝1∶1∶5。方法同实施例1中步骤1-步骤7。实施例7：分别取实施例5与实施例6中的纳米金CT造影剂(即n(LA-N(iPr)2)∶n(LA-PEG3.5k-GA)∶n(LA-PEG2k)＝1∶1∶3与n(LA-N(iPr)2)∶n(LA-PEG3.5k-GA)∶n(LA-PEG2k)＝1∶1∶5)进行配体屏蔽-去屏蔽考察(方法同实施例2)、浓缩稳定性考察(方法同实施例3)以及小鼠CT成像实验(方法同实施例4)。结果表明，两种纳米金CT造影剂(分别由实施例5与实施例6制备)具备与实验组(即n(LA-N(iPr)2)∶n(LA-PEG3.5k-GA)∶n(LA-PEG2k)＝1∶1∶4)相似的相关性质。