一种烟草绿原酸纳米脂质体包埋的方法与流程

本发明属于脂质体包埋技术领域，具体为一种烟草绿原酸纳米脂质体包埋的方法。

背景技术：

绿原酸(Chlorogenic acid)是由咖啡酸与奎尼酸组成的缩酚酸，异名咖啡单宁酸，化学名3-O-咖啡酰奎尼酸(3-O-caffeoylquinicacid)，分子式为C1₆H₁₈O₉，分子量为354.30，是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物。绿原酸广泛存在于烟草、金银花、杜仲等植物中，具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒、增高白血球、降血压、降血脂、保肝利胆、清除自由基和兴奋中枢神经系统等作用，被广泛应用于医药、食品和化妆品等行业。

绿原酸分子结构中有酯键、不饱和双键及多元酚三个不稳定部分，属于极性有机酸，化学性质不稳定。绿原酸分子结构中含有的邻二酚羟基，受热、见光易氧化。在碱性条件下，绿原酸可发生水解，在碱性及高温条件下会氧化为绿色醌类。具体表现为：

(1)绿原酸在从植物提取过程中，往往因为水解和分子内酯基迁移而发生异构化，或因氧化等作用而引起有效成分的提取率明显下降，例如，在金银花及其茎叶的加工、炮炙或药用成分的提取中，绿原酸极易氧化和水解，在相关制剂如双黄连、银黄口服液等的加工和贮存中，水解是不可避免的。

(2)绿原酸分子结构中的三个不稳定部分，易于受热水解为异构体，导致许多医药在制剂过程中绿原酸含量难以控制、损失较大，在成品的有效期内绿原酸含量不断下降，成品有效期难以保证，严重影响了医药产品的质量。

(3)绿原酸具有较广泛的抗菌作用，但在体内能被蛋白质灭活，这大大限制了其在医药方面的应用。研究表明，在室温的储藏条件下，绿原酸会缓慢的分解，含量会逐渐降低。采用调节pH值、加入抗氧剂、pH稳定剂的方法，可以一定程度上抑制绿原酸的氧化和水解，但操作工艺对实验设备要求增高，工艺繁琐且大大增加了生产成本。

鉴于绿原酸存在的上述问题，迫切需要一种烟草绿原酸纳米脂质体包埋的方法，提高绿原酸的稳定性，从而延长其生理活性。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的绿原酸化学性质不稳定的技术问题，本发明的目的在于提供一种烟草绿原酸纳米脂质体包埋的方法，操作简便，成本低廉，安全长效的方法，通过脂质体的包埋作用，提高绿原酸的稳定性，减少或避免绿原酸与外界环境(如高温、pH和氧气等)接触的机会，从而起到保护绿原酸的作用。

本发明采取的技术方案为：

一种烟草绿原酸纳米脂质体包埋的方法，具体包括如下步骤：

(1)称取原料：按重量配比4：36：(7-11)称取绿原酸、蛋黄卵磷脂和胆固醇；

(2)溶解：将步骤(1)中的原料组分采用适量乙醇溶解；

(3)混合：把步骤(2)中的乙醇溶液注入到磷酸盐缓冲液中，乙醇用量占磷酸盐缓冲液的8-12％，得到绿原酸前质体；

(4)旋蒸：控制旋蒸仪的旋蒸条件为35-45℃、110r/min-130r/min，步骤(3)中的混合液旋转蒸发，除去有机溶剂乙醇，得到绿原酸脂质体；

(5)超声处理：将步骤(4)中的旋蒸液放入冰浴中，控制超声功率180-320w，超声温度<30℃，超声20-30min，起到减小绿原酸脂质体粒径的目的。

进一步的，所述步骤(1)中的绿原酸的分离纯化方法，包括：提取烟草绿原酸初提液，在每毫升烟草绿原酸初提液加入活性炭25-100mg，室温搅拌吸附30min，用水分洗涤残留在材料表面未被吸附的杂质，然后，在50℃条件下，用60％乙醇或丙酮溶液洗脱绿原酸，将洗脱液浓缩后过大孔树脂进行吸附、洗涤、洗脱，干燥后获得绿原酸的液相色谱纯度大于60％，进一步精制，获得高纯绿原酸。

进一步的，所述步骤(1)中的绿原酸来源于烟草，原料按照重量配比为绿原酸：蛋黄卵磷脂：胆固醇＝4：36：9。

进一步的，所述步骤(2)中的溶解过程，先将卵磷脂和胆固醇混合后添加到无水乙醇中溶解，形成稳定的双分子层结构，然后再将绿原酸添加到无水乙醇中溶解。

进一步的，所述步骤(3)中的乙醇溶液的用量占磷酸盐缓冲液的10％，磷酸缓冲液的pH为7-8。

进一步的，所述步骤(3)中的乙醇和磷酸盐缓冲液组成的混合液不断地磁力搅拌，水化温度为40℃，水化时间为30min。

进一步的，所述步骤(4)中的旋蒸条件为40℃、120r/min。

进一步的，所述步骤(4)中的旋蒸法替换为采用氮吹的方式除去有机溶剂无水乙醇。

进一步的，所述步骤(5)中的超声功率300w，超声温度<30℃，超声时间为25min。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种烟草绿原酸纳米脂质体的包埋工艺，绿原酸的包埋率达到88.02％，平均粒径77.16nm，所制备的绿原酸脂质体体系稳定。通过脂质体包埋的方法，能够减少或避免绿原酸与外界环境(如高温、pH和氧气等)接触的机会，从而起到保护绿原酸的作用。本发明的结果显示，绿原酸的热稳定性、碱性稳定性及贮藏稳定性均得到显著提高，这为烟草功能成分的开发利用提供了保障。

本发明整个工艺过程操作简便，包埋效果好，不使用有毒有害试剂，对仪器设备要求低，生产成本低廉，能够适合于工业化大规模生产。原料优选为按照重量配比为绿原酸：蛋黄卵磷脂：胆固醇＝4：36：9，此条件下制备的绿原酸纳米脂质体包埋率高，粒径小，稳定性好。

本发明的溶解过程，先将蛋黄卵磷脂和胆固醇混合后添加到无水乙醇中溶解，形成稳定的双分子层结构，胆固醇和卵磷脂分子能过通过极性头部和疏水尾部之间的相互作用而吸引，增大脂质体囊泡的容积，从而提高芯材的包埋效率，然后再将绿原酸添加到无水乙醇中溶解。

本发明的绿原酸源自烟草，利用了活性炭对烟草绿原酸进行吸附，吸附率高达99％以上，解析率大于95％，且活性炭使用成本低；活性炭与大孔树脂联用，绿原酸损失少，回收率高，节约溶剂，同时利用活性炭与大孔树脂吸附性能的差异，分别将不同性质的杂质分离，保证了绿原酸的纯度。绿原酸纳米脂质体包埋的过程中协同使用了卵磷脂和胆固醇，利用卵磷脂的双亲性，将水溶性的绿原酸包埋在卵磷脂的亲水基团中；胆固醇则起到了调整卵磷脂的骨架结构和囊泡容积的作用。

本发明中的旋蒸法可替换为采用氮吹的方式除去有机溶剂无水乙醇，旋蒸除乙醇比较困难，耗时较长，氮吹则方便快捷。采用短时间超声工艺，在一定的超声时间内，包埋率随时间的延长而增加，超声时间过长则会引起磷脂相变，破坏了脂质体的结构，使包封的芯材泄露，导致包封率下降。

附图说明

图1为本发明的整体工艺流程图。

图2为本发明得到的绿原酸纳米脂质体的电镜图。

具体实施方式

下面结合附图进一步说明本发明。

实施例1

一种烟草绿原酸纳米脂质体包埋的方法，具体包括如下步骤：

(1)称取原料：按重量配比4：36：7称取绿原酸、蛋黄卵磷脂和胆固醇；

(2)溶解：将步骤(1)中的卵磷脂和胆固醇混合后添加到无水乙醇中溶解，形成稳定的双分子层结构，然后再将绿原酸添加到无水乙醇中溶解；

(3)混合：把步骤(2)中的乙醇溶液注入到磷酸盐缓冲液中，乙醇用量占磷酸盐缓冲液的8％，磷酸缓冲液的pH为7.5，乙醇和磷酸盐缓冲液组成的混合液不断地磁力搅拌，水化温度为40℃，水化时间为30min，得到绿原酸前质体；

(4)旋蒸：控制旋蒸仪的旋蒸条件为35℃、130r/min，步骤(3)中的混合液旋转蒸发，除去有机溶剂乙醇(也可以用氮吹的方式除去有机溶剂无水乙醇)；

(5)超声处理：将步骤(4)中的旋蒸液放入冰浴中，控制超声功率180w，超声温度<30℃，超声30min，得到绿原酸脂质体。

实施例2

一种烟草绿原酸纳米脂质体包埋的方法，具体包括如下步骤：

(1)称取原料：绿原酸来源于烟草，按重量配比4：36：9称取绿原酸、蛋黄卵磷脂和胆固醇，其中绿原酸与蛋黄卵磷脂的比为1：9，蛋黄卵磷脂与胆固醇的比为4：1；

(2)溶解：将步骤(1)中的卵磷脂和胆固醇混合后添加到无水乙醇中溶解，形成稳定的双分子层结构，然后再将绿原酸添加到无水乙醇中溶解；

(3)混合：把步骤(2)中的乙醇溶液注入到磷酸盐缓冲液中，乙醇用量占磷酸盐缓冲液的10％，酸缓冲液的pH为7.2，乙醇和磷酸盐缓冲液组成的混合液不断地磁力搅拌，水化温度为40℃，水化时间为30min，得到绿原酸前质体；

(4)旋蒸：控制旋蒸仪的旋蒸条件为40℃、120r/min，步骤(3)中的混合液旋转蒸发，除去有机溶剂乙醇(也可以用氮吹的方式除去有机溶剂无水乙醇)；

(5)超声处理：将步骤(4)中的旋蒸液放入冰浴中，控制超声功率300w，超声温度<30℃，超声时间为25min，得到绿原酸脂质体。

实施例3

一种烟草绿原酸纳米脂质体包埋的方法，具体包括如下步骤：

(1)称取原料：按重量配比4：36：11称取绿原酸、蛋黄卵磷脂和胆固醇；

(2)溶解：将步骤(1)中的软磷脂和胆固醇混合后添加到无水乙醇中溶解，形成稳定的双分子层结构，然后再将绿原酸添加到无水乙醇中溶解；

(3)混合：把步骤(2)中的乙醇溶液注入到磷酸盐缓冲液中，乙醇用量占磷酸盐缓冲液的12％，磷酸缓冲液的pH为7.6，乙醇和磷酸盐缓冲液组成的混合液不断地磁力搅拌，水化温度为40℃，水化时间为30min，得到绿原酸前质体；

(4)旋蒸：控制旋蒸仪的旋蒸条件为45℃、110r/min，步骤(3)中的混合液旋转蒸发，除去有机溶剂乙醇(也可以用氮吹的方式除去有机溶剂无水乙醇)；

(5)超声处理：将步骤(4)中的旋蒸液放入冰浴中，控制超声功率320w，超声温度<30℃，超声20min，得到绿原酸脂质体。

上述实施例1-3制得的绿原酸脂质体的性能参数和现有技术中的普通绿原酸的对比数据表，如表1(热稳定性、碱性稳定性和贮藏稳定性以保留率表示)。

表1绿原酸脂质体的性能参数表

以上所述并非是对本发明的限制，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实质范围的前提下，还可以做出若干变化、改型、添加或替换，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。