靶向肝窦内皮细胞的和厚朴酚纳米颗粒在治疗肝纤维化中的应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种靶向肝窦内皮细胞的和厚朴酚纳米颗粒在治疗肝纤维化中的应用。

背景技术：

和厚朴酚是一类木兰科落叶乔木厚朴提取物。具有明显的、持久的中枢性肌肉松弛，中枢神经抑制作用，抗炎，抗菌，抗病原微生物，抗溃疡，抗氧化，抗衰老,抗肿瘤，降低胆固醇等药理作用。它可抑制Akt磷酸化，并且亦可促进ERK1/2磷酸化，在此前的研究报道中，和厚朴酚可以通过对血管内皮细胞的保护作用抑制动脉血栓的形成，进一步的研究表明和厚朴酚也可以通过促进环前列腺素的生成抑制血管内皮细胞的凋亡，另外，和厚朴酚在人脐静脉内皮细胞内可调控iNOS/eNOS的表达，进而通过调节NO的合成维持血管内皮细胞的稳态。

在慢性肝损伤研究方面，和厚朴酚的研究不多，但其与慢性肝病的相关性亦有报道。在体外培养条件下和厚朴酚对活化肝星状细胞HSC可产生影响，其通过线粒体细胞色素C的释放以及Caspase 3的活化促进活化的HSC凋亡，而对实质细胞不造成重大的损伤。另外和厚朴酚还可调控肝损伤修复过程，其可以显著地抑制慢性损伤所造成的组织破坏，显示出对肝组织损伤较强的治疗效应。

RGD多肽标记的PEG纳米微粒是内皮细胞特异的药物传递系统，能牢固靶向结合于血管内皮细胞表面的炎症部位，被认为是靶向血管内皮细胞治疗理想的给药系统。PEG包被和厚朴酚的研究亦早有报道。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供靶向肝窦内皮细胞的Honokiol纳米颗粒的新用途。

本发明提供的靶向肝窦内皮细胞的Honokiol纳米颗粒在如下1)-10)中至少一种的应用：

1)制备治疗肝纤维化疾病产品；

2)制备抑制肝纤维化产品；

3)制备促进或维持或恢复肝窦内皮细胞处于分化状态产品；

4)制备提高肝窦内皮细胞促进肝脏修复作用产品；

5)制备提高肝窦内皮细胞中HGF蛋白表达和/或Wnt2蛋白表达产品；

6)制备抑制肝纤维化结节形成或促进肝纤维化结节消除产品；

7)制备降低血清中ALT含量和/或AST含量产品；

8)制备抑制肝窦内皮细胞中Akt磷酸化水平产品；

9)制备促进肝窦内皮细胞中Erk1/2磷酸化水平产品；

10)制备提高肝窦内皮细胞中eNOS表达量与Nox2表达量比值产品。

靶向肝窦内皮细胞的Honokiol纳米颗粒在制备治疗肝纤维化疾病产品中的应用也是本发明保护的范围。

靶向肝窦内皮细胞的Honokiol纳米颗粒在制备抑制肝纤维化产品中的应用也是本发明保护的范围。

靶向肝窦内皮细胞的Honokiol纳米颗粒在制备促进或维持或恢复肝窦内皮细胞处于分化状态产品中的应用也是本发明保护的范围。

靶向肝窦内皮细胞的Honokiol纳米颗粒在制备提高肝窦内皮细胞促进肝脏修复作用产品中的应用也是本发明保护的范围。

靶向肝窦内皮细胞的Honokiol纳米颗粒在制备提高肝窦内皮细胞中HGF蛋白表达和/或Wnt2蛋白表达产品中的应用也是本发明保护的范围。

靶向肝窦内皮细胞的Honokiol纳米颗粒在制备抑制肝纤维化结节形成或促进肝纤维化结节消除产品中的应用也是本发明保护的范围。

靶向肝窦内皮细胞的Honokiol纳米颗粒在制备降低血清中ALT含量和/或AST含量产品中的应用也是本发明保护的范围。

靶向肝窦内皮细胞的Honokiol纳米颗粒在制备抑制肝窦内皮细胞中Akt磷酸化水平产品中的应用也是本发明保护的范围。

靶向肝窦内皮细胞的Honokiol纳米颗粒在制备促进肝窦内皮细胞中Erk1/2磷酸化水平产品中的应用也是本发明保护的范围。

靶向肝窦内皮细胞的Honokiol纳米颗粒在制备提高肝窦内皮细胞中eNOS表达量与Nox2表达量比值产品中的应用也是本发明保护的范围。

促进或维持或恢复肝窦内皮细胞处于分化状态的物质在如下1)-10)中至少一种的应用也是本发明保护的范：

1)制备治疗肝纤维化疾病产品；

2)制备抑制肝纤维化产品；

4)制备提高肝窦内皮细胞促进肝脏修复作用产品；

5)制备提高肝窦内皮细胞中HGF蛋白表达和/或Wnt2蛋白表达产品；

6)制备抑制肝纤维化结节形成或促进肝纤维化结节消除产品；

7)制备降低血清中ALT含量和/或AST含量产品；

8)制备抑制肝窦内皮细胞中Akt磷酸化水平产品；

9)制备促进肝窦内皮细胞中Erk1/2磷酸化水平产品；

10)制备提高肝窦内皮细胞中eNOS表达量与Nox2表达量比值产品。

上述促进或维持或恢复肝窦内皮细胞处于分化状态的物质为靶向肝窦内皮细胞的Honokiol纳米颗粒。

上述应用中，所述产品为药品。

本发明另一个目的是提供一种具有如下1)-10)中至少一种功能的产品。

本发明提供的产品，包括靶向肝窦内皮细胞的Honokiol纳米颗粒；

1)治疗肝纤维化疾病；

2)抑制肝纤维化；

3)促进或维持或恢复肝窦内皮细胞处于分化状态；

4)提高肝窦内皮细胞促进肝脏修复作用；

5)提高肝窦内皮细胞中HGF蛋白表达和Wnt2蛋白表达；

6)抑制肝纤维化结节形成或促进肝纤维化结节消除；

7)降低血清中ALT含量和/或AST含量；

8)抑制肝窦内皮细胞中Akt磷酸化水平；

9)促进肝窦内皮细胞中Erk1/2磷酸化水平；

10)提高肝窦内皮细胞中eNOS表达量与Nox2表达量比值。

上述产品中，所述靶向肝窦内皮细胞的Honokiol纳米颗粒为用靶向肝窦内皮细胞的蛋白或含有该蛋白的融合蛋白或含有该蛋白的复合物包被和厚朴酚得到的颗粒。

上述产品中，所述产品为药品。

上述中，所述靶向肝窦内皮细胞的Honokiol纳米颗粒为用靶向肝窦内皮细胞的蛋白或含有该蛋白的融合蛋白或含有该蛋白的复合物包被和厚朴酚得到的颗粒，在本发明的实施例中靶向肝窦内皮细胞的多肽为cRGD，靶向肝窦内皮细胞的Honokiol纳米颗粒为用cRGD-PEG-PLGA包被和厚朴酚(Honokiol)得到的和厚朴酚纳米颗粒，具体按照如下方法制备：

1)将PEG-PLGA和cRGD在DMSO溶液中等摩尔比混合，得到PEG-cRGD；

2)将PEG-cRGD和PLGA按照摩尔比为10：1在DMSO溶液中混合，反应，得到cRGD-PEG-PLGA；

3)将cRGD-PEG-PLGA溶液(50mg/ml)滴加于搅拌的Honokiol溶液(10mg/ml)按照体积比为3：4混合，反应，得到cRGD-PEG-PLGA包被和厚朴酚的纳米颗粒，即为Honokiol纳米颗粒。

本发明第三个目的是提供一种抑制肝纤维化的方法。

本发明提供的方法，为以LSEC作为靶细胞，维持LSEC处于分化状态，从而达到抑制肝纤维化的目的。

本发明的实验证明，利用由cRGD标记的PEG纳米颗粒包装Honokiol，制成内皮细胞特异的药物输送体系，经由腹腔注射进入小鼠体内，能有效地维持LSEC的分化表型以及促再生功能，从而在慢性肝损伤早期有效的抑制肝纤维化的进程，同时诱导LSEC调控肝组织损伤修复。而在肝纤维化逆转期，Honokiol能加快肝内沉积纤维的清除效率，并迅速恢复LSEC的分化表型以及促再生功能，使其能迅速反应以行使肝损伤修复的指导作用。因此，以LSEC作为靶细胞，通过调控其分化表型来抑制肝纤维化的发生发展，对于抗纤维化治疗的研究具有一定的指导意义。

附图说明

图1为各组LSEC中p-Erk1/2，p-Akt，Erk1/2，Akt，eNOS，Nox2的表达情况。

图2为(A)扫描电镜图像显示纤维化4周与6周慢性肝损伤组与Honokiol抑制组中LSEC表面窗孔结构的变化；(B)扫描电镜图像显示纤维化逆转期2周与4周慢性肝损伤组与Honokiol促逆转组中LSEC表面窗孔结构的变化。

图3为(A)Western blot结果显示纤维化4周与6周慢性肝损伤组与Honokiol抑制组LSEC中HGF以及Wnt2表达的变化；(B)Western blot结果显示慢性肝损伤组与Honokiol治疗组LSEC中HGF以及Wnt2表达的变化。

图4为(A)Masson三色染色图像显示纤维化4周与6周慢性肝损伤组与Honokiol抑制组中组织纤维沉积的变化；(B)Masson三色染色图像显示纤维化逆转2周与4周慢性肝损伤逆转组与Honokiol促逆转组中组织纤维沉积的变化。

图5为ALT及AST血清浓度监测结果显示Honokiol可显著降低这两类转氨酶在肝纤维化进程(A)和逆转过程中(B)的含量。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中采用的小鼠为C57BL/6J小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司；

下述实施例中靶向LSEC的和厚朴酚纳米颗粒(以下称为Honokiol纳米颗粒)：为用cRGD-PEG-PLGA包被和厚朴酚(Honokiol)得到的和厚朴酚纳米颗粒；

和厚朴酚纳米颗粒制备方法参考如下文献：Qing Xu,Yuexian Liu,Shishuai Su,Wei Li,Chunying Chen*,Yan Wu*.Anti-tumor activity of paclitaxel through dual-targeting carrier of cyclic RGD and transferrin conjugated hyperbranched copolymer nanoparticles,Biomaterials,2012,33,1627-1639，具体步骤如下：

精密称取PEG-PLGA(14.7μmol,岸谷纳米)50mg至含有500μL DMSO溶液的圆底烧瓶中,室温下搅拌溶解后,加入等摩尔的多肽cRGD(苏州强耀生物)搅拌2h,用薄层色谱法(TLC)分析跟踪反应，直到cRGD完全消失。真空条件下蒸去溶剂，然后用蒸馏水重新溶解,再用去离子水透析除去小分子物质,透析袋(截留相对分子量3500),浓缩待用，得到浓缩后的PEG-cRGD，其中，PEG-PLGA和cRGD的加入摩尔比为1:1。

取浓缩后的PEG-cRGD(14.7μmol)完全溶解在DMSO溶液500μL中,然后加入1.47μmol的PLGA溶液(溶剂为DMSO 500μL),室温下搅拌18h,TLC跟踪反应到结束。真空条件下蒸去溶剂,然后用蒸馏水重新溶解,再用去离子水透析,透析袋(截留相对分子量为14000),经冷冻干燥,得到cRGD-PEG-PLGA固体产物，其中，PEG-cRGD和PLGA的加入摩尔比为10：1。

cRGD-PEG-PLGA和Honokiol根据需要分别配成相应浓度(溶剂为DMSO),将cRGD-PEG-PLGA溶液(50mg/ml)滴加于搅拌的Honokiol溶液(10mg/ml)中,室温孵育30min,制成体积比3:4比例的复合物,复合物溶液无菌过滤后4℃备用,颗粒大小～200nm，得到Honokiol纳米颗粒。

实施例1、Honokiol纳米颗粒在治疗肝纤维化中的应用

一、Honokiol纳米颗粒在慢性肝损伤阶段对鼠肝窦内皮细胞中相关蛋白表达的作用

慢性肝损伤可引起肝纤维化，该部分实验是为了证明Honokiol通过升高p-Erk1/2/p-Akt的比例调控肝窦内皮细胞正常的生理功能。

1、Honokiol纳米颗粒作用于慢性肝损伤引起的肝纤维化小鼠方法

实验分组：

1)阴性对照组：正常饮用水、标准小鼠饲料喂养，自由采食，每周更换3次饮用水以及饲料，仅注射无菌橄榄油和生理盐水，注射次数与剂量对应相应的实验组；

2)慢性肝损伤病理组(CCl₄造成慢性肝损伤模型)：正常饮用水、标准小鼠饲料喂养，自由采食，每周更换3次饮用水以及饲料，每周腹腔注射2次CCl₄与橄榄油混合物(体积比1:7，剂量1mg/kg)和生理盐水，连续注射6周。分别在2周、4周和6周处死小鼠进行检测。

3)逆转组：正常饮用水、标准小鼠饲料喂养，自由采食，每周更换3次饮用水及饲料，连续腹腔注射6周CCl₄与橄榄油混合物(体积比1:7)和生理盐水，停止注射CCl₄，正常饮食，让其自行恢复，同时腹腔注射生理盐水逆转，分别在逆转2周和4周处死小鼠进行检测。

4)Honokiol纳米颗粒抑制组：正常饮用水、标准小鼠饲料喂养，自由采食，每周更换3次饮用水及饲料，连续腹腔注射6周CCl₄与橄榄油混合物(体积比1:7，剂量1mg/kg，需要生理盐水)和生理盐水，将Honokiol纳米颗粒按照0.2mg/kg比例一同腹腔注射进入小鼠体内，连续注射6周。分别在2周、4周和6周处死小鼠进行检测。

5)Honokiol纳米颗粒促逆转组：正常饮用水、标准小鼠饲料喂养，自由采食，每周更换3次饮用水及饲料，连续腹腔注射6周CCl₄与橄榄油混合物(体积比1:7，剂量1mg/kg)和生理盐水，停止注射CCl₄，正常饮食，让其自行恢复，同时将Honokiol纳米颗粒按照0.2mg/kg比例一同腹腔注射进入小鼠体内，连续注射4周。分别在逆转2周和逆转4周处死小鼠进行检测。

上述饲养环境条件：温度范围20-22℃，湿度范围50-55％，明暗各12小时。实验动物自由进食和饮水，4只一笼饲养。

2、检测

1)Western blotting检测

提取上述1中各组中不同时间点处死的小鼠肝窦内皮细胞全蛋白，通过Western blotting检测各组中不同时间点的小鼠肝窦内皮细胞中Erk1/2、Akt、p-Erk1/2、p-Akt、eNOS和Nox2蛋白表达水平，具体检测方法如下：

首先对蛋白进行常规聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，电转到硝酸纤维素膜上后放入封闭液(TBST中5％脱脂奶粉)中封闭1h，在1:200稀释的Erk1/2抗体，Akt抗体，p-Erk1/2抗体，p-Akt抗体以及eNOS抗体(均来自CST)，Nox2抗体(Proteintech公司)，一抗中4℃孵育过夜，TBST洗膜5次，加入1：5000稀释鼠二抗(康为公司)室温下孵育1h，TBST缓冲液洗膜5次，化学发光底物ECL试剂盒(Thermo,32106)显色。

结果如图1所示，2w、4w、6w为慢性肝损伤病理组2周、4周和6周处死小鼠；2w+H、4w+H、6w+H为Honokiol纳米颗粒抑制组2周、4周和6周处死小鼠；R2w、R4w为逆转组2周、4周处死小鼠；R2w+H、R4w+H为Honokiol纳米颗粒促逆转组2周、4周处死小鼠；可以看出，Honokiol纳米颗粒对慢性肝损伤4-6周以及逆转期4周LSEC中Akt的磷酸化具有较为显著的抑制作用，与此同时可促进Erk1/2的磷酸化，并显著提升下游eNOS/Nox2的比例。Honokiol在纤维化发生之时能够维持LSEC中p-Erk1/2/p-Akt的高比值，并显著提升下游eNOS/Nox2的比例进而保持了LSEC的分化表型以及正常的生理功能。

二、Honokiol纳米颗粒在慢性肝损伤阶段调控LSEC的分化表型

Honokiol在纤维化发生之时能够维持LSEC中p-Erk1/2/p-Akt的高比值，进而保持了LSEC的分化表型以及正常的生理功能。

已知Honokiol能够抑制Akt蛋白的磷酸化，并促进Erk1/2的磷酸化，FDA批准Honokiol在临床上被用作血管保护剂，治疗心肌肥大等心血管疾病。图1所示Honokiol纳米颗粒对慢性肝损伤4-6周以及逆转期4周LSEC中Akt的磷酸化具有较为显著的抑制作用，与此同时可促进Erk1/2的磷酸化，并显著提升下游eNOS/Nox2的比例。因此进一步采用扫描电镜的方法，确认Honokiol纳米颗粒在慢性肝损伤阶段对LSEC的分化表型是否具有调控作用。

1、Honokiol纳米颗粒在慢性肝损伤阶段对LSEC的分化表型是否具有调控作用

具体方法如下：

1)取材：将组织块固定在滤纸或卡片纸上，以充分暴露待观察的组织表面，用手术刀切成面积达8mm×8mm，厚度达5mm的小块；

2)样品的清洗：用等渗的PBS缓冲液清洗；

3)固定：3％戊二醛固定。4℃过夜；

4)次日用PBS清洗细胞，依次用50％，70％，80％，90％和100％乙醇脱水，其中100％乙醇脱水3次，每次10min；

5)使用乙醇：叔丁醇＝1:1的混合溶液脱水；

6)使用纯叔丁醇脱水2次，每次10min；

7)加入新鲜的叔丁醇以没过组织样品为宜；

8)冷冻干燥；

9)样品喷金；

10)扫描电镜观测。

Honokiol纳米颗粒对各组不同时间点组织肝窦表面内皮细胞分化标志物-窗孔结构的维持情况如图2所示，2w、4w、6w为慢性肝损伤病理组2周、4周和6周处死小鼠；2w+H、4w+H、6w+H为Honokiol纳米颗粒抑制组2周、4周和6周处死小鼠；R2w、R4w为逆转组2周、4周处死小鼠；R2w+H、R4w+H为Honokiol纳米颗粒促逆转组2周、4周处死小鼠；可以看出，Honokiol纳米颗粒对慢性肝损伤4周和6周能很好的维持LSEC的分化表型(表面窗孔结构)，而在逆转期2周和4周中，Honokiol纳米颗粒可显著加速LSEC分化表型的恢复。

2、Honokiol纳米颗粒在慢性肝损伤阶段提高LSEC促进肝脏修复能力

另外，LSEC对肝损伤具有较好的修复作用，其分泌的HGF和Wnt2促进了损伤部位肝实质细胞的增殖。因此采用WB检测的方法，确认Honokiol纳米颗粒在慢性肝损伤阶段对LSEC的促修复能力是否具有调控作用。具体方法如下：

提取上述1中各组中不同时间点处死的小鼠肝窦内皮细胞全蛋白，通过Western blotting检测各组中不同时间点的HGF和Wnt2(促进肝实质细胞修复，为LSEC促修复表型标志物)的表达：

首先对样本进行常规聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，电转到硝酸纤维素膜上后放入封闭液(TBST中5％脱脂奶粉)中封闭1h，在1:200稀释的HGF抗体和Wnt2抗体(Proteintech公司)一抗中4℃孵育过夜，TBST洗膜5次，加入1：5000稀释鼠二抗(康为公司)室温下孵育1h，TBST缓冲液洗膜5次，化学发光底物ECL试剂盒(Thermo,32106)显色。

Honokiol纳米颗粒对各组不同时间点LSEC促修复能力的维持情况如图3所示，2w、4w、6w为慢性肝损伤病理组2周、4周和6周处死小鼠；2w+H、4w+H、6w+H为Honokiol纳米颗粒抑制组2周、4周和6周处死小鼠；R2w、R4w为逆转组2周、4周处死小鼠；R2w+H、R4w+H为Honokiol纳米颗粒促逆转组2周、4周处死小鼠；可以看出，Honokiol促进HGF和Wnt2表达，表明，Honokiol对慢性肝损伤4周和6周能很好的维持LSEC的促修复作用，而在逆转期2周和4周中，Honokiol纳米颗粒可显著加速LSEC分化表型的恢复。

三、Honokiol纳米颗粒在治疗慢性肝损伤阶段肝纤维化病中的应用

已知图1所示Honokiol纳米颗粒对慢性肝损伤4-6周以及逆转期4周LSEC中Akt的磷酸化具有较为显著的抑制作用，与此同时可促进Erk1/2的磷酸化，并显著提升下游eNOS/Nox2的比例。图2所示Honokiol纳米颗粒对慢性肝损伤4周和6周能很好的维持LSEC的分化表型，而在逆转期2周和4周中，Honokiol纳米颗粒可显著加速LSEC分化表型的恢复。图3所示Honokiol纳米颗粒对慢性肝损伤4周和6周能很好的维持LSEC的促修复作用，而在逆转期2周和4周中，Honokiol纳米颗粒可显著加速LSEC分化表型的恢复。因此进一步肝组织切片Masson三色染色和血清ALT，AST含量(肝损伤检测指标，辅助Masson染色评价肝纤维化病症的严重性)检测的方法，确认Honokiol纳米颗粒靶向干预LSEC在慢性肝损伤阶段肝纤维化病症是否具有治疗作用，具体方法如下

1、组织切片Masson三色染色

A、试剂的配置

1)苏木素染液

2)Masson复合染色液：丽春红(ponceau 2R)0.7g，酸性品红(acid fuchsin)0.3g，蒸馏水99ml，冰醋酸(glacial acetic acid)1ml。

3)亮绿染色液：亮绿(light green)1g，冰醋酸(glacial acetic acid)1ml，蒸馏水99ml。

4)1％磷钼酸水溶液：磷钼酸(phosphomolybdic acid)1g，蒸馏水加至100ml。

5)2％苯胺蓝液：苯胺蓝(aniline blue)2g，冰醋酸(glacial acetic acid)2ml，蒸馏水加至100ml。

B、染色步骤：

将上述1中各组中不同时间点处死的小鼠肝组织进行10％甲醛液固定，石蜡切片，常规脱蜡至水。

1)苏木素染液5～10min。

2)流水稍洗，1％盐酸分化。

3)流水冲洗数分钟。

4)Masson复合染色液5～10min。

5)蒸馏水稍冲洗。

6)1％磷钨酸液处理约5min。

7)不用水洗，直接用亮绿染色液(或苯胺蓝液)复染5min。

8)1％冰醋酸水处理1min。

9)95％酒精脱水多次。

10)无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

Honokiol纳米颗粒对肝纤维化进程的抑制(A)以及对肝纤维化逆转(B)的加速作用的Masson染色验证如图4所示，2w、4w、6w为慢性肝损伤病理组2周、4周和6周处死小鼠；2w+H、4w+H、6w+H为Honokiol纳米颗粒抑制组2周、4周和6周处死小鼠；R2w、R4w为逆转组2周、4周处死小鼠；R2w+H、R4w+H为Honokiol纳米颗粒促逆转组2周、4周处死小鼠；可以看出，Honokiol纳米颗粒靶向LSEC抑制慢性肝损伤4周和6周肝纤维化结节的形成，而在逆转期2周和4周中，Honokiol纳米颗粒可显著加速肝纤维化结节的消除。

2、血清ALT、AST含量检测

上述1中各组中不同时间点处死的小鼠摘眼球采血，血液常温静置1-2小时，3000r/min离心，收取上层液体，交由中国人民解放军307医院检验科进行谷丙转氨酶以及谷草转氨酶表达水平检测，具体方法如下：

1)试剂配制

(1)0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)

称取NaH₂PO₄.2H₂O 2.96495g，Na₂HPO₄.12H₂O 29.0142g，溶解于蒸馏水中，定容到1000mL。

(2)20μmol/L丙酮酸钠标准溶液

称取22mg丙酮酸钠，溶解于0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)100mL中。现配现用。

(3)ALT基质液

称取α-酮戊二酸29.2mg，DL-丙氨酸1.78mg(L-丙氨酸0.85mg)溶解于30mL0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)中，溶解后校正pH至7.4，再用pH7.4的磷酸缓冲液定容至100mL，置冰箱中保存备用(可保存一周)。可加入氯仿数滴防腐。

(4)0.02％2，4—二硝基苯肼溶液

称取20mg2，4—二硝基苯肼先溶解于10mL纯盐酸中，电炉加热助溶，待2，4—二硝基苯肼全部溶解后，用蒸馏水稀释至100mL，过滤后盛于棕色中，置冰箱中保存备用。

(5)1mol/L NaOH溶液：

称取4g NaOH溶解于蒸馏水后，定容到100mL。

(6)0.4mol/L NaOH溶液

称取16g NaOH溶解于蒸馏水后，定容到1000mL。

2)实验方法

(1)样品的处理按3.5方法进行。

(2)ALT标准曲线的制作

1.将测定所用试剂除氢氧化钠溶液外全部置于水浴箱内，预温37℃至然后使用.取6支试管，按表1进行配制

表1 ALT标准曲线的配制

2.冷却后以0为对照用分光光度计比色测定吸光值OD_520nm。

3.以丙酮酸含量为纵坐标，吸光值OD_520nm为横坐标绘制标准曲线

Honokiol纳米颗粒对肝纤维化进程的抑制(A)以及对肝纤维化逆转(B)的加速作用的血清ALT，AST含量检测的验证如图5所示，可以看出，Honokiol纳米颗粒靶向LSEC降低慢性肝损伤4周和6周血清中ALT和AST的含量，而在逆转期2周和4周中，Honokiol纳米颗粒可显著加速血清中ALT和AST的含量的降低。