本发明涉及一种芒果核黄酮提取物及其制备方法，属于食品技术及生物技术领域。
背景技术：
芒果(拉丁学名：Mangifera indica Linn)，又称檬果、闷果、蜜望子等，属于漆树科植物，主要生长于热带和亚热带沿海潮间带。芒果的种植分布很广，世界上有70多个国家生产芒果，我国主要省份广西、广东、台湾、海南均有芒果种植，且芒果资源丰富、品种繁多。2014年我国芒果种植面积为117万公顷，总产量达88万吨，是我国的大宗传统热带农产品，出口创汇潜力巨大，在我国对外贸易中有重要的地位。
芒果为著名热带水果之一，因其果肉细腻(肉质滑嫩、多汁)、风味独特(味道香甜)、营养丰富(富含糖、蛋白质、粗纤维、维生素、矿物质及脂肪等)，集热带水果精华于一身，被誉为“热带水果之王”。芒果具有极高的药用价值，其果皮可入药，为利尿、浚下剂；核仁和芒果叶也可入药，能解毒消滞、降压。据中医分析，芒果属于性平味甘、解渴生津的果品，有益胃、止呕、防晕的功效。芒果中含有的芒果苷具有明显的抗过氧化、保护脑神经元和祛痰止咳的功效。
广西作为我国生产芒果为数不多的主要省份之一，更是具有芒果资源丰富，品种繁多等优势，但是目前市场上主要还是以产地鲜销为主，少量加工成果汁、果脯以及果肉为辅外，芒果深加工产业亟待需要进一步发展。在芒果生产加工中的废弃物，在过去常被丢弃或者饲养牲畜。近年来，人们逐渐对芒果废弃物进行研究，包括芒果叶、芒果皮、芒果核、芒果树皮等，尤其是占芒果总重20-60％的芒果核获得大部分研究者和企业家的关注。据报道，芒果核富含有氨基酸、多肽、蛋白质、酚类、黄酮、多糖、有机酸、皂苷、鞣质、黄酮、蒽醌、生物碱、香豆素与内酯、三萜及甾体、生物碱、挥发油及油脂等多种活性成分。
近年来，我国围绕芒果核多酚类物质、黄酮类、吡酮类、萜类等活性成分及其抑菌、抗氧化功能进行的相关研究逐渐较多，但是也存在不少问题，主要有提取分离效果不明显，鉴定获得的活性成分较少，活性成分抑菌、抗氧化作用等药理作用还不明确。
现有的芒果核黄酮提取方法，也存在提取的总黄酮含量低，有机溶剂残留较多等问题。
技术实现要素：
本发明的目的是充分利用自然资源，尤其是广西特色果蔬资源，提供一种芒果核黄酮提取物及其制备方法，该黄酮提取物具有抑菌抗氧化性能，可用于保健品或者药物制备。同时为了解决目前已有芒果核黄酮提取方法存在的总黄酮含量低、有机溶剂残留较多的问题，本发明方法是经过醇提取及大孔树脂纯化方法制备芒果核黄酮提取物。
本发明的芒果核黄酮提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将芒果核干燥粉碎；
(2)用醇浓度20％-80％(v/v)的乙醇溶液或甲醇溶液作为溶剂对步骤(1)中得到的芒果核干燥粉末进行提取，然后将得到的提取液减压浓缩或真空冷冻干燥至浸膏；
(3)将步骤(2)中得到的浸膏用水、醇浓度小于50％(v/v)的乙醇溶液或者醇浓度小于50％(v/v)的甲醇溶液溶解，除去不溶物，得到上样溶液；
(4)取D101大孔吸附树脂，将步骤(3)得到的上样溶液上样，先用水洗去杂质，然后用洗脱剂(乙醇溶液或甲醇溶液)进行洗脱，收集洗脱液；所述D101大孔吸附树脂和芒果核干燥粉末重量比为1:0.5-1:20；
(5)将步骤(4)收集的洗脱液减压浓缩或真空冷冻干燥，得到芒果核黄酮提取物。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中提取方法为每千克芒果核粉末加入2-50L醇浓度为30％-80％的乙醇溶液或甲醇溶液，热回流或浸渍或浸漉提取2-5次，热回流提取时每次提取1-3h，浸渍或浸漉提取时每次提取1-5天，合并提取液。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)的提取，是将芒果核粉末以40％-60％(v/v，下同)的乙醇提取。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)的提取，是将芒果核粉末以乙醇提取次数1-4次，最优选为2-3次。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)的提取，料液比(芒果核粉末质量与乙醇溶液之比，m/v)为1:1-1:40，优选1:5-1:30，更优选地为1:20-1:30。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)的提取，每次提取时间为0.5-4h，优选提取时间为1-3h。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)的提取，是在30-50℃下进行。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)具体工艺条件是：乙醇浓度50％，料液比1:30，提取温度40℃，提取时间150min。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中浸膏的溶解所用的水、乙醇溶液或者甲醇溶液的重量为浸膏重量的3-50倍。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)的提取方法如下：将步骤(2)中得到的浸膏用10倍浸膏重量的水或者10％乙醇溶液溶解，除去不溶物后得到上样溶液。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)的除去不溶物，是采用过滤或离心的方法。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中的先用水洗去杂质，是指用2-5BV的水进行洗脱以除去杂质。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(4)的洗脱流速为洗脱液流速1BV/h-10BV/h，优选为2BV/h-5Bv/h。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(4)中洗脱剂乙醇溶液或者甲醇溶液的浓度为5％-95％，优选为20％-80％；洗脱剂的洗脱体积为1-10倍柱体积，优选为3-8个柱体积。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(4)，是使用醇浓度为40-60％的乙醇溶液进行洗脱。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)的纯化方法如下：取与芒果核粉重量之比为1:5的D101大孔树脂，将步骤(3)中得到的上样溶液上样，采用2-5BV的水洗去杂质，后采用3-10BV的50％乙醇溶液进行洗脱，收集50％的乙醇溶液洗脱得到的洗脱液。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(4)中，芒果核黄酮提取液的上样量(芒果核粉末质量：树脂质量)优选为1:1-10:1。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是：以乙醇溶液加热回流提取芒果核黄酮，回收乙醇，浓缩，将芒果核黄酮提取液吸附到大孔树脂上、洗脱、收集洗脱液、浓缩、干燥，获得纯化的芒果核黄酮。
在本发明的一种实施方式中，所述方法具体是：(1)将芒果核干燥粉碎；(2)秤取芒果核粉末1kg加入20L～25L浓度为50％的乙醇溶液，热回流提取三次，热回流提取每次1～3h，合并提取液，提取液减压浓缩汁浸膏；(3)浸膏用浸膏重量5～10倍的水溶解，过滤出去不溶物，得到上样溶液；(4)将上样溶液上柱，控制流出液流速为0.5BV/h，上样量与树脂AB-8体积比为2:1，至提取液全部进入树脂床；采用2-5BV的水进行洗脱，以除去杂质，然后用3-10BV的40～60％乙醇溶液冲洗树脂床，控制流出液流速2BV/h，收集乙醇溶液的洗脱液；(5)将收集的洗脱液减压浓缩至一定体积，进行喷雾干燥，即得纯化产物。
本发明还要求保护按照所述制备方法或者纯化方法得到的芒果核黄酮提取物在制备食品、保健品或药物上的应用。
所述保健品或药物，是具有抑菌抗氧化活性的保健品或药物。
本发明的有益效果：
1、本发明通过对芒果核黄酮提取步骤进行改进，有效提高了黄酮物质的提取效率，得到的提取液中黄酮含量可达9.5-12.8mg/g(即1kg芒果核干燥粉末中可提取得到9.5-12.8g黄酮)。而且，本发明方法以水或者乙醇为溶剂，既廉价又无毒。
2、本发明采用大孔树脂纯化的方法进一步对提取液进行纯化，该纯化方法操作简便、快捷，选用的大孔树脂具有吸附量大、解吸率大的特点，有效去除了提取液的杂质，防止了有机溶剂残留的问题。
3、按照本发明方法得到的芒果核黄酮提取物，产量可达9.5-12.8mg/g(干芒果核)，得到的黄酮提取物对羟基和超氧自由基阴离子具有明显的清除作用。
附图说明
图1为芦丁标准曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
各实施例中使用的一起设备、化学试剂以及检测方法如下：
仪器与设备：FW100高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；UPC-Ⅱ-20T优普系列超纯水器，四川优普超纯科技有限公司；SQP电子天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；ZWYR-D2403振荡培养箱，上海智诚分析仪器制造有限公司；SHZ-DⅢ予华牌循环水真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司；HHS-6S电子恒温不锈钢水浴锅，上海宜昌仪器纱筛厂；UV1901PC紫外可见分光光度计，上海奥析科学仪器有限公司；
化学试剂：无水碳酸钠、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、福林酚试剂、没食子酸标准品、各种类型大孔树脂等均由柳州苏利有限责任公司提供。
芦丁标准曲线的建立：准确取芦丁标准品粉末20mg，用60％乙醇溶解在50mL的烧杯中溶解后，装置于100mL容量瓶中，后用60％乙醇稀释至刻度，摇匀；即得到芦丁0.2mg/mL溶液[9]；后分别取芦丁溶液0.0mL、0.25mL、0.50mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL分别放置于25mL容量瓶中，然后分别加入60％乙醇溶液至10mL，再依次加入1mL 5％亚硝酸钠溶液，摇匀，放置6min；之后加入1mL 10％硝酸铝溶液，摇匀，放置6min；加入4％氢氧化钠溶液1mL；再加60％的乙醇定容至刻度，摇匀，放置15min后在500nm波长下用分分光光度计测定其吸光度值；制作芦丁标准曲线，以芦丁浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线(图1)，并进行回归分析。结果表明，芦丁在浓度0-0.07mg/ml内与其吸光值呈良好的线性关系，在此范围内的线性回归方程为：y＝13.403x-0.01063，R2＝0.9991。
总黄酮含量的测定：称取芒果核粉末样品后加入乙醇提取剂，根据芦丁标准曲线计算出样品溶液中总黄酮浓度，再根据公式计算芒果核粉末中总黄酮量。计算公式如下：
总黄酮含量(mg/g)＝C×V/W
式中C——根据标准曲线求得的样品浓度值(mg/mL)；
V——样品液总体积(mL)；
W——原料重量(g)。
抗氧化活性的测定：
清除羟基自由基能力测定：分别取不同质量浓度的待测样液于5只试管中，各加入硫酸亚铁、双氧水，静置，10min后加入水杨酸，静置后在510nm处测定吸光度A1，用蒸馏水替代水杨酸按照上述方法测定吸光度值A2，用蒸馏水代替待测液按上述方法测定吸光度值A0，VC做对照，按照下列公式求黄酮物质对羟自由基的清除率：羟自由基(％)＝[A0-(A1-A2)]/(A0)*100(％)。
清除超氧阴离子自由基能力测定：取4.5ml Tris-HCl缓冲溶液，于20℃水浴中预热20min，分别加入1ml不同浓度的样品液和0.4ml 25mmol/L的邻苯三酚溶液，混匀后，于25℃水浴中反应5min，然后加入8mol/L的HCl溶液1ml终止反应，然后在325nm处测定吸光度A1，空白以蒸馏水代替样品液，测定吸光度A0。样品对超氧阴离子自由基的清除率：清除率(％)＝(1-A1/A0)*100(％)。
DPPH清除能力测定：分别取2.0mL不同质量浓度(1.0、5.0、10.0、15.0、芒果核活性成分样液于5只试管中，各加入2mL DPPH(0.04mg/ml)，静置20min在517nm检测吸光度A1；以无水乙醇代替DPPH，按照上述方法测定吸光度A2；做空白组按上述方法测定吸光度A0，以VC做对照，样品对DPPH自由基的清除率：DPPH清除率(％)＝[1-(A1-A2)/A0]*100(％)。
实施例1：本发明的芒果核黄酮提取物的制备方法
(1)芒果核黄酮提取：芒果核干燥粉碎，秤取芒果核粉末1kg加入22L浓度为50％的乙醇，热回流提取三次，热回流提取每次1.5h，合并提取液，提取液减压浓缩汁浸膏，浸膏用浸膏重量10倍的水溶解，过滤出去不溶物，得到上样溶液，总黄酮含量约为11.5g/kg芒果核粉末。
(2)上柱：将芒果核黄酮提取液上柱，控制流出液流速为0.5BV/h，上样量与树脂DM101体积比为2:1，至提取液全部进入树脂床。
(3)洗脱：采用2-5BV的水进行洗脱，以除去杂质，后分别采用3-10BV的5％-80％乙醇冲洗树脂床，控制流出液流速2BV/h，收集洗脱液，分别减压浓缩至一定体积，进行喷雾干燥，即得不同组分的纯化产物，其中全部组分总黄酮含量约为11.5g/kg，纯化产物中，水洗脱液中黄酮含量约为1.1g/kg，5％乙醇洗脱液中黄酮含量约为1.9g/kg，10％乙醇洗脱液中黄酮含量约为2.4g/kg，20％乙醇洗脱液中黄酮含量约为3.8g/kg，30％乙醇洗脱液中黄酮含量约为4.8g/kg，40％乙醇洗脱液中黄酮含量约为7.6g/kg，50％乙醇洗脱液中黄酮含量约为8.1g/kg，60％乙醇洗脱液黄酮中含量约为7.4g/kg，70％乙醇洗脱液中黄酮含量约为5.6g/kg，80％乙醇洗脱液中黄酮含量约为4.6g/kg。
以上数据表面，采用醇浓度为40-60％的乙醇溶液进行洗脱，得到的组分中黄酮含量最高。
实施例2：选用不同条件进行提取
采用本发明提供的方法，选用不用条件进行芒果核黄酮(样品为芒果核干燥粉碎1g)提取实验，在单因素试验基础上，选取乙醇浓度、料液比、提取时间和提取温度四个主要因素做L9(34)正交试验(表1)，正交结果分析如表2。
表1芒果核黄酮提取工艺正交试验表头设计
表2芒果核黄酮提取工艺L9(34)正交实验结果
表3芒果核黄酮提取验证试验
由表2可知，各因素对芒果核总黄酮提取影响大小顺序为：D>A>C>B，即料液比>提取温度>提取时间>乙醇浓度，其中料液比对芒果核黄酮提取的影响最显著，乙醇浓度对芒果核黄酮提取的影响最不显著。由正交试验结果可以得出最佳试验组合为A2B3C2D3，即提取温度40℃，提取时间为2.5h，乙醇浓度为50％，料液比为1:30。由于最佳工艺组合没有在正交表的组合中，需要做验证试验作分析，结果验证试验所得的黄酮含量为1.91mg/g，所以芒果核黄酮提取的最佳工艺条件为乙醇浓度50％，料液比1:30，提取温度40℃，提取时间150min。
实施例3：大孔树脂纯化工艺
发明人比较了不同树脂种类、样液浓度、吸附速率、上样量、乙醇洗脱浓度、洗脱速率等对芒果核黄酮提取物的处理效果。
上样液制备：秤取芒果核粉末20g，按照乙醇浓度50％，料液比1:30，提取温度40℃，每次提取1h，提取3次，提取后滤液合并，减压浓缩至干，真空干燥至恒重，精密秤取干膏适量，以甲醇或乙醇溶液溶于10ml容量瓶中，加甲醇或乙醇溶液稀释至刻度，摇匀备用。移取1ml滤液至10ml容量瓶，加甲醇或乙醇溶液稀释至刻度，摇匀。按照上述方法测定黄酮的含量。
静态吸附：取10种经过预处理好的大孔吸附树脂各10g，各加入芒果核黄酮溶液10ml，每10min振摇一次，2h后分别各取树脂吸附后的溶液测定黄酮含量，计算各树脂对芒果核黄酮的吸附率。
静态解吸：
将静态吸附的树脂过滤抽干，加30ml 50％乙醇解吸，每10min振摇一次，2h后分别各取树脂吸附后的溶液测定黄酮含量，计算各树脂对芒果核黄酮的解吸率。见表4。从表中可以看出，10种树脂的吸附率都较大(大于90％)，解吸率都大于40％，其中AB-8、DM21、D101的解吸率都大于60％，选取AB-8、DM21、D101做动态吸附实验。
表4大孔树脂对芒果核黄酮的吸附与解吸率
动态吸附：
取处理好的静态吸附优选3种树脂AB-8、DM21、D101各15mL于柱内，加芒果核黄酮提取液于柱顶，以0.5BV/h的流速进行动态吸附，按照树脂体积流出收集流出液，测定黄酮含量，计算各树脂对芒果核黄酮的吸附率。结果见表5，表明AB-8和D101达到饱和吸附时，所吸附的总黄酮量较DM21大，选取其做解吸实验。
表5大孔树脂对芒果核黄酮的动态吸附结果
动态解吸：取处理好的AB-8和D101树脂各20ml于柱内，分别加芒果核黄酮提取液于柱顶，以0.5BV/h的流速进行吸附后，用50％乙醇以2BV/h的流速进行洗脱，按照树脂体积流出收集洗脱液，测定黄酮含量，计算各树脂对芒果核黄酮的吸附率。结果见表6，可以看出D101比AB-8解吸效果好，选取其作为最佳树脂。
表6大孔树脂对芒果核黄酮的动态解吸结果
乙醇浓度：取10份处理好的DM101树脂20ml于柱内，加芒果核黄酮提取液于柱顶，以0.5BV/h的流速进行吸附后，再分别用5BV的水、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％乙醇以2BV/h流速进行单独洗脱，按照树脂体积流出收集洗脱液，测定黄酮含量，结果见表7，可以看出，当乙醇洗脱浓度为40％-60％时，洗脱总黄酮得率最高。
表7乙醇洗脱浓度考察
实施例4：芒果核黄酮提取物的制备方法
将芒果核干燥粉碎，秤取芒果核粉末1kg加入20L浓度为50％的乙醇，热回流提取三次，热回流提取每次1h，合并提取液，提取液减压浓缩汁浸膏，浸膏用浸膏重量10倍的水溶解，过滤出去不溶物，得到上样溶液，总黄酮含量为12.8g/kg芒果核粉末。
将芒果核黄酮提取液上柱，控制流出液流速为0.5BV/h，上样量与树脂DM101体积比为2:1，至提取液全部进入树脂床。采用3BV的水除去杂质，然后采用8BV的50％乙醇冲洗树脂床，控制流出液流速2BV/h，收集洗脱液，分别减压浓缩至一定体积，进行喷雾干燥，即得纯化产物-芒果核黄酮提取物，黄酮含量为10.9g/kg芒果核粉末。
实施例5：芒果核黄酮提取物的制备方法
将芒果核干燥粉碎，秤取芒果核粉末1kg加入25L浓度为50％的乙醇，热回流提取三次，热回流提取每次1h，合并提取液，提取液减压浓缩汁浸膏，浸膏用浸膏重量10倍的水溶解，过滤出去不溶物，得到上样溶液，总黄酮含量为12.1g/kg。
将芒果核黄酮提取液上柱，控制流出液流速为0.5BV/h，上样量与树脂DM101体积比为2:1，至提取液全部进入树脂床。采用2BV的水除去杂质，然后采用10BV的40％乙醇冲洗树脂床，控制流出液流速2BV/h，收集洗脱液，分别减压浓缩至一定体积，进行喷雾干燥，即得纯化产物-芒果核黄酮提取物，黄酮含量为9.8g/kg芒果核粉末。
实施例6：芒果核黄酮提取物的制备方法
将芒果核干燥粉碎，秤取芒果核粉末1kg加入20L浓度为50％的乙醇，热回流提取三次，热回流提取每次1.5h，合并提取液，提取液减压浓缩汁浸膏，浸膏用浸膏重量8倍的水溶解，过滤出去不溶物，得到上样溶液，总黄酮含量为11.2g/kg。
将芒果核黄酮提取液上柱，控制流出液流速为0.5BV/h，上样量与树脂DM101体积比为2:1，至提取液全部进入树脂床。采用5BV的水除去杂质，然后采用8BV的60％乙醇冲洗树脂床，控制流出液流速2BV/h，收集洗脱液，分别减压浓缩至一定体积，进行喷雾干燥，即得纯化产物-芒果核黄酮提取物，黄酮含量为9.1g/kg芒果核粉末。
实施例7：本发明方法得到的芒果核黄酮提取物的抗菌抗氧化性能
抑菌效果的测定：
将供试菌株于斜面培养基上活化，用接种环挑取环1-2环于50mL无菌生理盐水三角瓶中振荡10min(内有数粒玻璃珠)，要求菌悬液约108CFU/mL左右备用。称取一定量真空冷冻干燥的实施例4-6得到的芒果核黄酮提取物样品，在超净工作台上用无菌的40％乙醇水溶液溶解样品至所需的浓度，备用。新鲜配制的培养基基于121℃条件下灭菌，当培养基冷至50-60℃时，于超净工作台上将培养基倒入灭菌的的培养皿中，每皿15-20mL培养基，待平板冷却后，每皿中加入0.5mL菌悬液，用三角玻璃涂棒均匀涂成薄板备用。将无菌滤纸片浸入配好的药液其中12h，沥干。每一含菌平板上，呈正三角形排布3片带药无菌纸片，细菌于37℃条件下培养24h，啤酒酵母和黑曲霉于30℃条件下培养5d，测其抑菌圈直径。根据抑菌圈大小来确定其抑菌效果。以不加芒果核黄酮溶液只加菌悬液为对照。结果显示，本发明得到的芒果核黄酮提取物具有强烈的抑菌效果。
芒果核黄酮物质抗氧化活性研究：
羟基是活性最强的活性氧化自由基，会诱发机体产生氧化损伤，其清除率常常是反应药物抗氧化作用的重要指标。同样的，超氧阴离子也是生物体主要的活性氧自由基，由其引起的体内脂质过氧化是机体衰老、心血管疾病及肿瘤发生的重要原因。芒果核黄酮羟基自由基清除能力测定实验发现其清除能力随着黄酮浓度增加而增加，当芒果核黄酮的浓度达到0.38-0.45mg/ml时清除率能达到约90％，说明芒果核黄酮具有较强的清除羟基自由基作用。芒果核黄酮超氧阴离子自由基清除能力测定实验发现芒果核黄酮的浓度越高，清除超氧阴离子自由基的能力越强，当芒果核黄酮的浓度达到0.32-0.43mg/mL，清除能力趋于平稳，清除率达到83％，但是清除能力较Vc弱些。芒果核黄酮提取物DPPH自由基清除能力测定实验发现其清除能力随着黄酮浓度增加而增加，当浓度达到0.43-0.49mg/mL以上时，其对DPPH自由基的清除率能达到90％，说明芒果核黄酮具有较强的清除DPPH自由基作用。以上数据说明芒果果核黄酮对羟基自由基以及超氧阴离子自由基均具有较好的清除能力，研究结果将为芒果核资源的综合利用及其相应的功能性食品开发提供参考借鉴。
以上通过实施例对本发明的内容进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。