可用作乙酰胆碱酯酶抑制剂的色胺衍生物及其用途的制作方法

本发明涉及一种色胺衍生物及其药学上可接受的盐用作乙酰胆碱酯酶抑制剂的用途，属于药物领域。

背景技术：

色氨酸(tryptophan)的化学名称为β-吲哚基丙氨酸，是人体必需的22种氨基酸之一。由于人体不能合成色氨酸，因此必须从食物中摄取。色氨酸可调节蛋白质合成，还具有免疫、消化等功能。此外，色氨酸还是色胺、5-羟色胺、褪黑素等神经活性物质的前体，可调节神经活性(Young S N.How to increase serotonin in the human brain without drugs[J].J Psychiatry Neurosci,2007,32:394-399)。其中，色胺作为一种单胺类生物碱，存在于脑中，具有神经调质和神经递质的作用。

乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AChE)是选择性水解乙酰胆碱这一神经递质的必需酶。AChE主要存在于神经接头和胆碱能神经突触，通过水解乙酰胆碱阻止胆碱能神经传递。临床许多疾病与胆碱能功能下降有关。如重症肌无力是由于神经-肌肉接头处胆碱能传递障碍引起以肌肉易疲劳为特点的自身免疫性疾病，严重时会导致呼吸无力，危及生命(Conti-Fine B M,Milani MKaminski H J.Myasthenia gravis:past,present,and future[J].JClin Invest,2006,116:2843-2854)。阿尔兹海默病(Alzheimer’s diseases,AD)发病初期因中枢胆碱能系统受损，引起记忆障碍等痴呆表现(Burns AIliffe S.Alzheimer's disease[J].BMJ,2009,338:b158)。AChE抑制剂可通过抑制AChE，诱导乙酰胆碱在胆碱能神经末梢附近堆积，兴奋乙酰胆碱受体，激活胆碱能系统。因此，AChE抑制剂可用于胆碱能功能下降疾病的对症治疗。如临床上新斯的明(neostigmine)、吡斯的明(pyridostigmine)可用于治疗重症肌无力(Mehndiratta M M,PandeySKuntzer T.Acetylcholinesterase inhibitor treatment for myasthenia gravis[J].Cochrane Database Syst Rev,2014,10:CD006986)；多奈哌齐(donepezil)、加兰他敏(galantamine)可用于治疗早期AD(Anand P Singh B.A review on cholinesterase inhibitors for Alzheimer's disease[J].Arch Pharm Res,2013,36:375-399)。但这些AChE抑制剂均有不同程度的副作用，因此亟需开发新型疗效好、副作用低的AChE抑制剂(Pohanka M.Cholinesterases,a target of pharmacology and toxicology[J].Biomed Pap Med Fac Univ Pal acky Olomouc Czech Repub,2011,155:219-229)。

海洋生物是天然的药物宝库。由于生存环境特殊，许多海洋生物次生代谢产物与陆地生物相比差异很大(郭跃伟.海洋天然产物和海洋药物研究的历史、现状和未来[J].自然杂志,2009,1:27-32)。现代药理学研究更发现，许多海洋次生代谢物对多种疾病有良好的治疗效果(Zhao H,Liu H,Chen Y,et al.Oligomannurarate sulfate,a novel heparanase inhibitor simultaneously targeting basic fibroblast growth factor,combats tumor angiogenesis and metastasis[J].Cancer Res,2006,66:8779-8787；Wang S,Li J,Xia W,et al.A marine-derived acidic oligosaccharide sugar chain specifically inhibits neuronal cell injury mediated by beta-amyloid-induced astrocyte activation in vitro[J].NeurolRes,2007,29:96-102)。因此，对海洋生物次生代谢物的药理学研究是当前的研究热点。我们之前从海洋细菌——假交替单胞菌(pseudoalteromonas)中获得了包括色胺衍生物在内的一系列海洋次生代谢产物，其中，部分色胺衍生物具有抑菌作用(中国专利申请CN103601663A)。在本申请中，我们进一步研究了色胺衍生物对AChE的抑制作用。

技术实现要素：

本发明基于发明人的下述出人意料的发现：(1)结构如下述式I所示的色胺衍生物具有抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性，可用作AChE抑制剂；(2)所述色胺衍生物的AChE抑制活性与其取代基和链长相关。特别地，可通过所述色胺衍生物的吲哚基团上的取代基或者通过改变所述色胺衍生物中的烷基的长度来改变所述色胺衍生物的AChE抑制活性。

因此，在一个方面，本发明涉及结构如下述式I所示的色胺衍生物或其药学上可接受的盐用作乙酰胆碱酯酶抑制剂的用途：

其中在式I中，R为包含4至12个碳原子的烷基，例如直链烷基或支化烷基，优选直链烷基；X为氢原子或者选自Cl、Br、I的卤素原子。

优选地，在式I中，取代基X位于吲哚环的6位上，即为下式II的化合物：

优选地，式II中的取代基X为氢原子，即为下式III的化合物：

根据本发明的一种优选实施方案，以上通式化合物具体选自以下两种化合物：

式IV化合物的化学名称为N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)庚酰胺；式V化合物的化学名称为N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)辛酰胺。

根据本发明的用途可以涉及治疗目的，也可以涉及非治疗目的。例如，对于治疗目的而言，本发明的色胺衍生物或其药学上可接受的盐可用作乙酰胆碱酯酶抑制剂，用于治疗与胆碱能功能下降相关的疾病，例如认知功能障碍、重症肌无力和阿尔兹海默病。对于非治疗目的而言，本发明的色胺衍生物或其药学上可接受的盐可用作乙酰胆碱酯酶抑制剂，用于体外抑制细胞中的乙酰胆碱酯酶活性。

在另一个方面，本发明涉及结构如上述式I所示的色胺衍生物或其药学上可接受的盐用于制备药物的用途，所述药物用作乙酰胆碱酯酶抑制剂。

在另一个方面，本发明涉及结构如上述式I所示的色胺衍生物或其药学上可接受的盐用于制备药物的用途，所述药物用于治疗与胆碱能功能下降相关的疾病，例如认知功能障碍、重症肌无力和阿尔兹海默病。

在另一个方面，本发明涉及一种抑制细胞的乙酰胆碱酯酶活性的方法，其包括给所述细胞施用结构如上述式I所示的色胺衍生物或其盐(例如，其药学上可接受的盐)。

本发明的方法可以涉及治疗目的，也可以涉及非治疗目的。例如，对于治疗目的而言，可将本发明的方法体内应用于患有与胆碱能功能下降相关的疾病(例如认知功能障碍、重症肌无力和阿尔兹海默病)的患者(即，将本发明的色胺衍生物或其药学上可接受的盐施用给患者)，以抑制患者细胞中的乙酰胆碱酯酶活性。对于非治疗目的而言，可将本发明的方法体外应用于细胞例如培养的细胞(即，将本发明的色胺衍生物或其盐体外施用给细胞)，以抑制细胞中的乙酰胆碱酯酶活性。

本发明首次发现，结构如上述式I所示的色胺衍生物具有抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性，可用作AChE抑制剂。因此，本发明提供了结构如上述式I所示的色胺衍生物或其药学上可接受的盐的新用途，并且提供了新的抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)活性的方法。

此外，本发明还首次发现，所述色胺衍生物的AChE抑制活性与其取代基和链长相关。因此，本发明提供了调控(例如降低)所述色胺衍生物或其盐(例如其药学上可接受的盐)的抑制乙酰胆碱酯酶的活性的方法。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1显示了在根据实施例2的实验中，各组实验动物在训练阶段的识别指数。结果显示，在训练阶段，各组动物对相同物体的识别指数无显著统计学差异。

图2显示了在根据实施例2的实验中，各组实验动物在测试阶段的识别指数。结果显示，在测试阶段，各组动物对新物体的识别指数有显著统计学差异。

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。

实施例1.化合物27S和28S的体外活性的研究

材料与方法

1实验药品

待测色胺衍生物27S、28S通过Rafael R.B.Oliveira等人，Synthesis,Activity,and QSAR Studies of Tryptamine Derivatives on Third-instar Larvae of Aedes Aegypti Linn，Med Chem.2014；10(6):580-7中描述的方法获得，或者可从中国专利申请CN103601663A中公开的假交替单胞菌中分离获得。

色胺衍生物27S和28S的化学名称分别为N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)庚酰胺和N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)辛酰胺；其结构如下所示：

N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)庚酰胺:¹H NMR(500MHz,CD₃OD)δ(ppm)7.55(d,J＝7.9Hz,1H),7.32(d,J＝8.2Hz,1H),7.07(t,J＝7.5,Hz,1H),7.05(s,1H),6.99(t,J＝7.5Hz,1H),3.47(t,J＝7.3Hz,2H),2.93(t,J＝7.3Hz,2H),2.13(t,J＝7.5Hz,2H),1.56(m,2H),1.28(m,6H),0.89(t,J＝6.8Hz,3H)；MS(ESI⁺)m/z 273.22[M+H]⁺。

N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)辛酰胺:¹H NMR(500MHz,CD₃OD)δ(ppm)7.55(d,J＝8.0Hz,1H),7.32(d,J＝8.2Hz,1H),7.08(t,J＝7.5,Hz,1H),7.06(s,1H),6.99(t,J＝7.5Hz,1H),3.47(t,J＝7.3Hz,2H),2.94(t,J＝7.4Hz,2H),2.14(t,J＝7.5Hz,2H),1.56(m,2H),1.28(m,8H),0.90(t,J＝6.9Hz,3H)；MS(ESI⁺)m/z 287.11[M+H]⁺。

将色胺衍生物27S和28S分别溶于DMSO溶液，浓度为10mM，备用。

2实验试剂

碘代乙酰硫代胆碱(AChI)购自sigma公司，溶于100mmol/LNa₂HPO₄溶液，浓度为20mmol/L。二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)购自Life Science公司，溶于100mmol/LNa₂HPO₄溶液，浓度为5mmol/L。乙丙嗪(丁酰胆碱酯酶抑制剂)购自sigma公司，溶于二甲基亚砜(DMSO)，浓度为20mmol/L。多奈哌齐购自Sigma公司，溶于ddH₂O溶液，浓度为10mM。

3脑匀浆液制备

大鼠斩首后取脑，在冰上分离取得大脑皮层后用液氮干燥。皮层称重后，加入10倍的裂解缓冲液(HEPES 10mmol/L，Triton X-100 0.5％，EDTA 5mmol/L，EGTA 5mmol/L，NaCl 1000mmol/L，调节pH＝7.5)，匀浆直至破坏组织。匀浆液超声处理30秒后，3000rpm、4度离心15分钟。吸取上清。

4AChE活力测定

AChE活力测定按照Ellan等报道的方法稍加改变(Ellman G L,Courtney K D,Andres V,Jr.,et al.A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity[J].Biochem Pharmacol,1961,7:88-95)。84.5μl 100mmol/L Na₂HPO₄(pH＝7.5)中加入底物(AChI)、酶(匀浆液)、待测化合物(27S-34S，阳性对照为多奈哌齐)各5μl，加入乙丙嗪0.5μl。37℃孵育30min。该反应的产物为巯基胆碱。产生的巯基胆碱与75μl 20mmol/L DTNB发生生色反应，生成黄色的5-巯基-2-硝基苯乙酸，应用荧光光度计测定412nm处的吸收值。随后，按照Ellan等报道的方法，利用吸收值计算待测化合物(27S-28S)相对于阳性对照的AChE抑制率(％±SEM)。结果示于表1(结果以平均值±SEM表示，方差分析使用ANOVA、Turkey’s test分析。)。

表1：化合物27S、28S对AChE活性抑制率。

**:p<0.01(ANOVA Turkey’s test)

实验结论

从表1的结果可知，化合物27S和28S均表现出了显著的AChE抑制活性，可用作AChE抑制剂，且化合物27S的AChE抑制活性高于28S。这一结果还表明，当将化合物27S的直链烷基延长(例如将化合物27S中的己基延长为庚基，辛基，壬基或者更长的直链烷基)时，其AChE抑制活性下降。

色氨酸及其代谢产物如色胺、5-羟色胺、褪黑素等广泛参与生物体内的新陈代谢，调节人体各项生理活动(Young S N.How to increase serotonin in the human brain without drugs[J].J Psychiatry Neurosci,2007,32:394-399)。其中，5-羟色胺是中枢神经系统的重要神经递质，调节精神活动，控制神经系统的兴奋表达。我们通过AChE活力检测，首次发现色胺衍生物(化合物27S和28S)可以显著抑制AChE，可用作AChE抑制剂，从而可用于认知障碍、重症肌无力、阿尔兹海默症等临床治疗。

实施例2.化合物27S和28S的体内活性的研究

实验动物：ICR小鼠70只，雄性，体重20±2g，购自浙江省动物中心。氢溴酸东莨菪碱注射液，规格0.3mg/ml，购自上海禾丰制药有限公司。

实验分为正常组、模型组、阳性对照组(多奈哌齐3mg/kg)、低剂量27S组(3mg/kg)、高剂量27S组(3mg/kg)、低剂量28S组(3mg/kg)、高剂量28S组(3mg/kg)，每组10只小鼠。将多奈哌齐、27S、28S粉末分别用生理盐水溶解，每天上午9点左右开始实验，小鼠测试前1小时腹腔注射各种药物，半小时腹腔注射东莨菪碱3mg/kg(阳性对照组、低剂量27S组、高剂量27S组、低剂量28S组、高剂量28S组)。

新物体认知实验所用敞箱及数据分析系统购自上海移数信息科技有限公司。该实验根据动物喜欢探究新物体的特点而设计。实验在60×60×15cm³的敞箱中进行，实验共分3天，每只动物实验结束后，用10％的酒精清洁实验装备，防止气味对动物的识别造成干扰。第一天，将动物放在敞箱中自由活动适应5分钟。第二天，在敞箱内靠近邻角的左右对称位置放置两个完全相同的物体，物体距箱壁10cm，将动物头部方向背离物体，在两物体之间中线上放入，记录其在5min内对两个物体探索学习的时间。动物对物体的探究定义为动物用鼻子主动接近物体的距离小于2cm，若动物蹲在物体上不动或总探究学习时间小于3s，则剔除。第三天，将其中一个物体换成颜色与形状完全不同的新物体，继续让动物探索5min，并分别记录新物体和旧物体的探究时间，分别记录为Tn和Tf。并计算出动物对新物体的识别指数(discrimination index)，即Tn/(Tn+Tf)×100％。在训练期，动物对物体的识别指数相近，动物对新物体的识别指数一般高于50％，识别指数越高说明学习记忆能力越强，反之越差。

实验结果：

东莨菪碱诱导的动物认知行为模型是测试AChE抑制剂药理作用的有效动物模型，也是评价药物对抗认知功能障碍、阿尔兹海默症等的主要模型。AChE抑制剂可通过增加突触间乙酰胆碱含量对抗东莨菪碱诱导的动物认知下降，进而可能治疗认知功能障碍、重症肌无力、阿尔兹海默症等疾病。

啮齿类动物先天对新物体具有探索倾向。在训练阶段，将实验动物背朝物体放入敞箱内，让其对两个相同的物体进行探索，训练结束后统计分析此阶段动物的识别指数。研究发现各组实验动物对相同物体的识别指数无显著性统计学差异，说明各组动物对相同物体的识别能力无偏向性(图1)。在测试阶段，将其中一个物体替换为完全不同的新物体，动物对这两个物体进行探索，统计各组动物对新物体的识别指数。与模型组相比发现，低剂量27S、高剂量27S、28S和多奈哌齐对新物体的识别指数均极显著增加(图2，^**p<0.01，n＝10)。这一实验结果说明，本发明的化合物27S和28S能够改善东莨菪碱引起的认知功能障碍。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。