本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪圆环病毒2型脂质体稀释液冻干制品及其制备方法。
背景技术：
猪圆环病毒病是由猪圆环病毒2型 ( Porcine circovirus type 2，PCV2)引起猪的一种新的传染病，其主要特征为仔猪消瘦、生长发育不良、呼吸困难、腹泻、母猪返情率增加、产木乃伊胎或弱仔、流产、内脏器官及皮肤的广泛病理变化，此外，本病还可导致猪群产生严重的免疫抑制，从而容易导致继发感染或并发其他传染。该病已给全世界养猪业造成了巨大的经济损失，是继猪繁殖与呼吸综合征之后新发现的又一重要疫病，疫苗免疫是预防PCV-2感染的主要措施之一。
脂质体是一种具有同生物膜性质类似的磷脂双分子层结构载体，而中药脂质体系指将中药的有效成分包封于类脂质双分子层而制成的一种超微型球状药物载体制剂。该药物载体具有靶向、缓释给药的优势，而且脂质体对正常细胞和组织无损害和抑制作用，还可以表现出良好的细胞亲和性和组织相容性。脂质体在体内易降解、无毒性和无免疫原性，其作为一种药物载体不仅可以提高药物治疗指数，还能够降低药物毒性和减少药物毒副作用等优点。
黄芪是一味重要的中药，具有益卫固表、利水清肿、托毒生肌、补中益气等功效，民间常用于治疗自汗、盗汗、血痹、浮肿、痛疽不溃或溃久不敛、内份带虚、脾虚泄泻及一切气衰血虚之症。黄芪皂苷为黄芪的主要活性成分之一，黄芪皂苷不仅可以促进淋巴增殖和抗体的增加，还能促进体液和细胞免疫应答反应。
多糖是中药活性成分之一，大量研究表明，多糖及糖复合物在生物体内不仅是作为能量资源和构成材料，更重要的是它存在于一切细胞膜结构中，参与生命现象中细胞的各种活动。多糖类物质是所有生命有机体的重要组成部分，具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂质过氧化的能力
兽用生物制品质量评定最重要的指标之一就是批次间的稳定性，然而在实际生产过程中难以控制半成品的批次间稳定性，究其原因主要是在接种活体生物时的比例不确定，也就是说接种量不稳定导致生产出半成品有较大的差异。本发明宗旨在于解决猪圆环病毒增殖过程中批次间差异大以及病毒含量过低的难题。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种猪圆环病毒2型脂质体稀释液冻干制品及其制备方法的技术方案。
所述的一种猪圆环病毒2型脂质体稀释液冻干制品，其特征在于每1000mlPBS溶液含有以下组分：虫草多糖5-10g、番茄红素5-10g、人参皂苷Rh2 1-5g、脂质体6-12g、蔗糖10-15g和甘露醇10-15g。
所述的一种猪圆环病毒2型脂质体稀释液冻干制品，其特征在于每1000mlPBS溶液含有以下组分：虫草多糖6-8g、番茄红素6-8g、人参皂苷Rh2 2-4g、脂质体8-10g、蔗糖12-14g和甘露醇12-14g。
所述的一种猪圆环病毒2型脂质体稀释液冻干制品，其特征在于所述的脂质体通过以下步骤制得：称取大豆卵磷脂、胆固醇，用氯仿进行溶解，并使其混合均匀，将该溶液在37℃减压旋转蒸发，除去有机溶剂，形成磷脂膜；向膜中加入pH值7.0的PBS溶液，水浴旋转水化，所得混悬液进行超声处理，最后用匀浆机脱水后制备成脂质体。
所述的一种猪圆环病毒2型脂质体稀释液冻干制品，其特征在于所述的PBS溶液通过以下步骤制得：取氯化钠6-10g、氯化钾0.05-0.5g、磷酸氢二钠1-1.2g、磷酸二氢钾0.05-0.5g、氯化钙0.05-0.2g、含6个结晶水的氯化镁0.05-0.2g；将以上各成分混合后，溶于1000ml双蒸水中，经116℃，高压灭菌30分钟即得。
所述的一种猪圆环病毒2型脂质体稀释液冻干制品的制备方法，其特征在于包括以下步骤：将所述重量的组分充分混合后，加入到1000ml pH 7 PBS溶液中振荡水化，形成均一溶液；经过0.22um的滤器进行过滤后,先放置于-40℃低温冰箱快速冷冻，室温缓慢融化，反复进行四次，再置于-40℃预冻4-8h；最后在真空冻干机中进行干燥，即得到猪圆环病毒2型脂质体稀释液冻干制品。
所述的一种猪圆环病毒2型脂质体稀释液冻干制品的制备方法，其特征在于所述的PBS溶液通过以下步骤制得：取氯化钠6-10g、氯化钾0.05-0.5g、磷酸氢二钠1-1.2g、磷酸二氢钾0.05-0.5g、氯化钙0.05-0.2g、含6个结晶水的氯化镁0.05-0.2g；将以上各成分混合后，溶于1000ml双蒸水中，经116℃，高压灭菌30分钟即得。
本发明中虫草多糖由武汉远成共创科技有限公司生产销售，番茄红素由湖南绿蔓生物科技有限公司生产销售，人参皂苷Rh2由百灵威科技有限公司生产销售。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明所制备的脂质体稀释液冻干制品可以降低半成品的批次间差异。
2、本发明所制备的脂质体稀释液冻干制品可以促进猪圆环病毒2型的繁殖，提高病毒含量，增强疫苗免疫原性。
具体实施方式
为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。
实施例1：PBS溶液的制备
取氯化钠6-10g、氯化钾0.05-0.5g、磷酸氢二钠1-1.2g、磷酸二氢钾0.05-0.5g、氯化钙0.05-0.2g、含6个结晶水的氯化镁0.05-0.2g；将以上各成分混合后，溶于1000ml双蒸水中，经116℃，高压灭菌30分钟即得。
实施例2：脂质体的制备
称取大豆卵磷脂6g、胆固醇2g，用500ml氯仿进行溶解，并使其混合均匀，将该溶液在37℃减压旋转蒸发，除去有机溶剂，形成磷脂膜；向膜中加入200ml、pH值7.0的PBS溶液（实施例1制得），水浴旋转水化，所得混悬液进行超声处理，最后用匀浆机脱水后制备成脂质体。
实施例3：脂质体的制备
称取大豆卵磷脂4g、胆固醇4g，用500ml氯仿进行溶解，并使其混合均匀，将该溶液在37℃减压旋转蒸发，除去有机溶剂，形成磷脂膜；向膜中加入200ml、pH值7.0的PBS溶液（实施例1制得），水浴旋转水化，所得混悬液进行超声处理，最后用匀浆机脱水后制备成脂质体。
实施例4：猪圆环病毒2型脂质体稀释液冻干制品的制备
取虫草多糖5g、番茄红素5g、人参皂苷Rh2 1g、脂质体（实施例2制得）6g、蔗糖10g和甘露醇10g；
将所述重量的组分充分混合后，加入到1000ml pH 7的 PBS溶液（实施例1制得）中振荡水化，形成均一溶液；经过0.22um的滤器进行过滤后,先放置于-40℃低温冰箱快速冷冻，室温缓慢融化，反复进行四次，再置于-40℃预冻6h；最后在真空冻干机中进行干燥，即得到猪圆环病毒2型脂质体稀释液冻干制品。
实施例5：猪圆环病毒2型脂质体稀释液冻干制品的制备
取虫草多糖8g、番茄红素8g、人参皂苷Rh2 4g、脂质体（实施例3制得）10g、蔗糖12g和甘露醇14g；
将所述重量的组分充分混合后，加入到1000ml pH 7的 PBS溶液（实施例1制得）中振荡水化，形成均一溶液；经过0.22um的滤器进行过滤后,先放置于-40℃低温冰箱快速冷冻，室温缓慢融化，反复进行四次，再置于-40℃预冻4h；最后在真空冻干机中进行干燥，即得到猪圆环病毒2型脂质体稀释液冻干制品。
实施例6：猪圆环病毒2型脂质体稀释液冻干制品的制备
取虫草多糖10g、番茄红素10g、人参皂苷Rh2 5g、脂质体（实施例3制得）12g、蔗糖15g和甘露醇15g；
将所述重量的组分充分混合后，加入到1000ml pH 7的 PBS溶液（实施例1制得）中振荡水化，形成均一溶液；经过0.22um的滤器进行过滤后,先放置于-40℃低温冰箱快速冷冻，室温缓慢融化，反复进行四次，再置于-40℃预冻8h；最后在真空冻干机中进行干燥，即得到猪圆环病毒2型脂质体稀释液冻干制品。
试验例1 本发明的应用
1材料
1.1猪圆环病毒2型脂质体稀释液冻干制品
按本发明实施例4-6制得
1.2 猪圆环病毒2型，PK15-B1细胞
1.3 5-6周龄健康雌性清洁级Balb/c小鼠，PCV2 ELISA抗体检测为阴性（≤1:50）
2 方法
2.1包封率的测定
分别取空白的冻干脂质体和包封药物的脂质体冻干粉，在磷酸盐缓冲液中进行复溶，超速离心，取上清按一定比例稀释后，测定其吸光度（参考兽药典），平均每个样品测3次，算其平均值。
2.2 形态观察和粒径
脂质体稀释液冻干粉在PBS缓冲液复溶后，在透射电镜（×20000）下观察
2.3 细胞培养及接毒
用含10%犊牛血清的MEM细胞营养液，置于37℃下含5%的CO2培养箱中进行培养20-26h，待细胞长成单层，弃去培养液，加入EDTA-胰酶消化液，作用数分钟，按1:2-1:3比例传代，均分4组，每组3瓶。将本发明实施例4-6制备的脂质体稀释液冻干制品置于PH7磷酸盐缓冲液中进行复溶后，分别把14160723、14160724、14160725 三种不同批次的病毒各稀释成1000 TCID50/ml、1500 TCID50/ml、2000 TCID50/ml 3种不同的浓度。A组，采用本发明实施例4制备的脂质体稀释液对3种不同批次的PCV-2进行稀释接种；B组，采用本发明实施例5制备的脂质体稀释液对3种不同批次PCV-2进行稀释接种；C组，采用本发明实施例6制备的脂质体稀释液对3不同批次PCV-2进行稀释接种；D组，对照组，采用无血清的细胞培养液对3不同批次PCV-2进行稀释接种，每组均按5%接种于细胞单层，置37℃吸附30min,加入含4%犊牛血清细胞维持液，于 37℃、5% CO2细胞培养箱中培养72h，冻融2-3次后，进行收毒。
2.4 TCID50测定
将收获的四组病毒液分别10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7三个稀释度，，分别接种于PK15-B1细胞单层的细胞培养板中，按0.1ml/孔进行接种，置于37℃，5%的培养箱中培养24h，用MEM维持液进行换液，再继续培养24h，用冷丙酮固定细胞，用间接免疫荧光试验（IFA）测定每个稀释度含有PCV2阳性细胞（呈绿色）的孔数，根据Karber法计算病毒TCID50。
2.5免疫原性测定
将收获2.3提到的培养72h 14160723批次四组病毒液经检验合格，分别进行灭活、乳化后制作成疫苗成品用来测定疫苗的免疫原性。将5-6周龄Balb/c小鼠分为4组，每组5只，第Ⅰ组采用经本发明实施例4制备的脂质体稀释液处理过的PCV-2灭活乳化后制成的疫苗进行免疫；第Ⅱ组采用经本发明实施例5制备的脂质体稀释液处理过的PCV-2灭活乳化后制成的疫苗免疫；第Ⅲ组为采用经本发明实施例6制备的脂质体稀释液处理过的PCV-2灭活乳化后制成的疫苗免疫；第Ⅳ组，疫苗对照组，未经脂质体处理灭活后制成的疫苗免疫；先后免疫2次，每只0.2ml，两周后按相同途径和剂量进行免疫。在首免5周后开始采血，分离血清，测定血清中的PCV-2 ELISA抗体。
3 结果
3.1包封率结果
按照公式：包封率（％）＝系统中包封的药量（A1）/ 系统中包封与未包封的总药量（A2）×100％，结果见表1。
表1包封率测定结果
3.2 形态观察和粒径测定
脂质体稀释液冻干制品为单室脂质体，粒度规则，为圆形，粒径基本一致，结果见表2。
表2 形态观察和粒径测定结果
3.3 TCID50测定结果
表3 TCID50测定结果
3.4 血清抗体检测结果
表4抗体测定结果
4 结论
综上所述，本发明猪圆环病毒脂质体稀释液冻干制品具有良好的包封率，且粒度规则，粒径基本一致；能够很好的保证半成品接种量的稳定性，降低猪圆环病毒灭活疫苗半成品间的批次差异；提高疫苗的血清抗体效价，增强疫苗的免疫原性。