本发明涉及生物治疗领域，特别涉及一种干细胞制剂及其制备方法和应用。
背景技术：
糖尿病(diabetes mellitus，DM)发病率在世界范围内上升，已成为继心血管疾病及肿瘤后的第3大非传染性疾病。糖尿病足是糖尿病一种严重的并发症，是糖尿病患者致残，甚至致死的重要原因之一。糖尿病足是指糖尿病患者足部由于神经病变使下肢保护功能减退，大血管和微血管病变使动脉灌注不足致微循环障碍而发生溃疡和坏疽的疾病状态。1972年，Catterall首先提出了糖尿病足(diabeticfoot，DF)发病的三大因素：血管闭塞性缺血、感染以及神经病变。其中，血管病变是一个重要因素。它不仅是导致DM患者足部感染的主要病因，而且也是影响糖尿病足部溃疡(diabetic footulcer，DFU)预后的最重要因素。
Loomans等的研究结果显示，糖尿病患者在代谢紊乱的状态下，血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cell，EPC)的数量减少且有功能障碍，影响其增殖、黏附及血管生成。糖尿病的高胰岛素血症导致了血管内皮祖细胞的增殖和存活能力的减低，因此，在糖尿病等一些疾病状态下，血管内皮祖细胞的数量和功能两方面均有所降低。血管内皮祖细胞的功能状态异常导致血管再生能力减弱，这可能是引起糖尿病血管病变的基础，同时也是此类疾病预后差、治疗困难的原因之一。
此外，由于糖尿病患者机体持续处于高血糖与蛋白质的非酶糖化状态，引起脂代谢紊乱。使血液持续处于高粘稠、高凝状态，因此患者下肢动脉较容易发生血管壁增厚、管腔狭窄等血管病变，进而导致不同程度的微循环障碍，出现下肢供血逐渐减少，最终发生组织损伤，从而导致糖尿病足等并发症产生。
目前DF对各种治疗方法不敏感，治疗效果不佳，预后不良，病变恶化易导致截肢。DF的传统治疗方法有药物治疗、血管搭桥、局部涂抹中药及介入治疗，但是手术和介入治疗对患者的选择要求较高，有严格的指征，导致许多自身条件欠佳或合并有重要脏器严重病变而不能耐受搭桥手术及介入治疗的中老年患者只能选择药物治疗，而这些治疗方法的远期效果均不理想且不能从根本上解决问题，很多患者最终无法避免截肢的厄运。因此，各国研究者在不断地探索并寻找出更好的非药物的治疗方案，以此来提高糖尿病足患者的治疗效果。
干细胞是一类具有自我复制功能力的多潜能细胞，在一定条件下，能够分化成多种功能的细胞。近年来，干细胞技术飞速发展，其在糖尿病治疗中的基础研究和临床应用也得以迅速开展，干细胞研究给糖尿病足的治疗带来新的希望。
脂肪干细胞是一种多向分化的干细胞，并发现它能够分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、血管内皮、肝、胰、神经等细胞系类型,具有易获得、易扩增、不易衰老等特点。近年来，大量的研究表明脂肪干细胞可以产生和分泌多种促血管化的细胞因子(如VEGF、HGF、bFGF等),并参与了组织损伤修复的血管化过程，并具有造血支持作用、抗凋亡作用、趋化作用等。
纤维母细胞是皮肤真皮中的主体细胞成分，它与自身分泌的胶原纤维、弹性纤维及基质成分一同构成了真皮的主体。纤维母细胞的主要功能是：合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、基质大分子物质和某些生长因子，对维持皮肤的弹性和韧性具有重要作用，纤维母细胞的减少也是引起皱纹产生的重要原因。
纤连蛋白也称纤维连接蛋白(Fibronectin，FN)，一种高分子糖蛋白，具有多种生物学功能。大量国内外的研究结果证明，FN分子在进化过程中保守性很强，各种动物体液中的FN具有非常相近的结构、性质和生物学功能，因而不同来源的FN可以相互替代使用。FN主要功能是介导细胞粘着，纯化的纤连蛋白可增强细胞间粘连及细胞与基质的粘连。通过粘着，纤连蛋白可以通过细胞信号转导途径调节细胞的形状和细胞骨架的组织，促进细胞铺展。在胚胎发生过程中，纤连蛋白对于许多类型细胞的迁移和分化是必需的。在创伤修复中，纤连蛋白亦是重要的。在血凝块形成过程中，纤连蛋白促进血小板附着于血管受损部位。
糖尿病足的治疗目前主要是控制血糖改善微循环等保守治疗效果不理想，因其病变特点是远端血管流出道差，故即使搭桥、介入均难再通。因此，研发一种对糖尿病足有良好疗效的干细胞制剂是本领域技术人员需要解决的技术问题。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明公开了一种干细胞制剂及其制备方法和应用，所述干细胞制剂对糖尿病足具有良好的疗效。
本发明公开了一种干细胞制剂，包括：脂肪干细胞、纤维母细胞和纤连蛋白；
所述脂肪干细胞的含量为4×106～1×108个/ml；
所述纤维母细胞的含量为2×106～5×107个/ml；
所述纤连蛋白的含量为0.4～1.5μg/ml。
优选地，所述干细胞制剂包括：脂肪干细胞、纤维母细胞和纤连蛋白；
所述脂肪干细胞的含量为8×106个/ml；
所述纤维母细胞的含量为5×106个/ml；
所述纤连蛋白的含量为0.5μg/ml。
本发明公开了上述干细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：
将所述脂肪干细胞、所述纤维母细胞、所述纤连蛋白和溶剂混合，制得所述干细胞制剂。
优选地，所述溶剂为生理盐水。
优选地，所述脂肪干细胞的制备方法包括以下步骤：
a1)、在无菌条件下抽取脂肪组织；
a2)、在无菌条件下用清洗液清洗脂肪组织，用眼科剪刀将脂肪组织剪成0.2-0.3cm3的小块，再用D-Hank’s液清洗；
a3)、用Ⅰ型胶原酶消化脂肪块20min，离心收集脂肪细胞；
a4)、以5000个/cm2的密度将步骤a3)收集的脂肪细胞进行接种培养，培养三天后将细胞用0.25％胰酶消化后再以5000个/cm2的密度继续接种培养；
a5)、收集培养至第三代的脂肪干细胞，用生理盐水重悬制得所述脂肪干细胞的悬液。
优选地，步骤1)抽取的脂肪组织为腹部皮肤下的脂肪组织。选择腹部皮下部位进行脂肪组织的抽取既方便取材，又不影响个体的生命健康。抽取脂肪组织的部位并不限于腹部皮下组织，也可选择其它部位进行脂肪组织抽取。
优选地，步骤2)所述的清洗液为D-Hank’s液。
优选地，所述纤维母细胞的制备方法包括以下步骤：
b1)、在无菌条件下取皮肤组织块；
b2)、清洗皮肤组织块后用眼科剪刀剪成小块，再进行清洗；
b3)、用Ⅰ型胶原酶对步骤b2)得到的皮肤组织块进行低温消化过夜，第二天转移置37℃至消化完全；
b4)、加入培养液，离心后去上清，再加入培养液混匀后进行培养，每3天换一次液；当第一代细胞达到80％的汇合度时传第二代；当第二代细胞达到80％的汇合度时传第三代；当第三代细胞达到85％的汇合度时，收集培养的细胞，用生理盐水重悬制得所述纤维母细胞的悬液。
优选地，步骤b3)所述的低温为4℃。
本发明还公开了所述干细胞制剂和所述制备方法制得的干细胞制剂在治疗糖尿病足中的应用。
在本发明公开的干细胞制剂中，纤维母细胞能促进创口的愈合，脂肪干细胞不仅在坏死端能发挥修复功能，而且对患者机体的微环境有一定的改善作用。纤连蛋白能增强细胞间粘连及细胞基质粘连，促进血小板附着于血管受损部位，达到修复的作用。
本发明建立了糖尿病足的大鼠动物模型，对本发明公开的干细胞制剂和本发明公开的制备方法制得的干细胞制剂进行了动物试验，动物试验的结果显示本发明公开的干细胞制剂和本发明公开的制备方法制得的干细胞制剂对糖尿病足具有良好的疗效。
综上所述，本发明公开的干细胞制剂和本发明公开的制备方法制得的干细胞制剂具有以下有益效果：本发明公开的干细胞制剂对糖尿病足对糖尿病足具有良好的疗效，能够减轻患者的痛苦，满足疾病各个进展程度的患者，为糖尿病足的治疗奠定了基础；且本发明公开的制备方法取材容易，利用推广应用。
具体实施方式
本发明公开了一种干细胞制剂及其制备方法和应用，该干细胞制剂对糖尿病足具有良好的疗效。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明所述的成分和制剂均为市售或自制来源。
纤连蛋白购自上海江莱生物科技有限公司
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1脂肪干细胞的制备
1、在无菌条件下，取大鼠自体腹部健康皮肤下的3mL脂肪组织，置于5mL离心管；
2、在无菌条件下用D-Hank’s液离心清洗3遍脂肪组织，离心条件为4℃、200g，离心时间为10min；离心完后用眼科剪刀将脂肪组织剪成0.2-0.3cm3的小块，再用D-Hank’s液清洗2遍；
3、用Ⅰ型胶原酶消化脂肪块20min，400g离心10min收集脂肪干细胞；
4、以5000个/cm2的密度将离心收集的脂肪干细胞接种至六孔板培养，每培养三天将细胞用0.25％胰酶消化再以5000个/cm2的密度接种培养；
5、用0.25％胰酶消化收集第3代脂肪干细胞，用生理盐水重悬成1.5mL细胞悬液，置于4℃保存待用。
实施例2纤维母细胞的制备
1、在无菌条件下麻醉大鼠，选择大鼠较平坦的部位用脱毛膏去除绒毛，用灭菌手术剪刀剪下1×1cm2自体皮肤组织块，置于50mL离心管；
2、用D-Hank’s清洗液离心清洗2遍皮肤组织块，用眼科剪刀剪成1-2mm2的小块，再加清洗液清洗3遍；
3、用Ⅰ型胶原酶置4℃消化过夜，第二天转移置至37℃消化完全；
4、消化完毕后加入培养基(DMEM+10％FBS)，离心后弃上清，再加入培养基，混匀后转移到六孔板培养，每3d换一次液，并实时观察细胞状态并做好记录；
5、当原代细胞达到70％汇合度时进行传代；当第一代细胞达到80％的汇合度时传第二代；当第二代细胞达到80％的汇合度时传第三代；当第三代细胞达到85％的汇合度时，用0.25％胰酶消化细胞，400g离心10min；离心后弃上清，加入生理盐水重悬细胞，再次400g离心10min；然后再次弃上清加入生理盐水重悬细胞，400g离心10min，弃上清；将收集到的5×106个细胞用1.5mL生理盐水重悬，置于4℃保存待用。
实施例3制备干细胞制剂
将纤连蛋白以浓度为0.5μg/mL的量加入1.0mL生理盐水中，制成纤连蛋白溶液。往制备好的纤连蛋白溶液中加入制备好的脂肪干细胞和制备好的纤维母细胞，使脂肪干细胞的含量为8×106个/ml，使纤维母细胞的含量为5×106个/ml。混匀，转移至5mL注射器中待用，制得干细胞制剂。
实施例4制备干细胞制剂
将纤连蛋白以浓度为0.4μg/mL的量加入1.0mL生理盐水中，制成纤连蛋白溶液。往制备好的纤连蛋白溶液中加入制备好的脂肪干细胞和制备好的纤维母细胞，使脂肪干细胞的含量为4×106个/ml，使纤维母细胞的含量为5×107个/ml。混匀，转移至5mL注射器中待用，制得干细胞制剂。
实施例5制备干细胞制剂
将纤连蛋白以浓度为1.5μg/mL的量加入1.0mL生理盐水中，制成纤连蛋白溶液。往制备好的纤连蛋白溶液中加入制备好的脂肪干细胞和制备好的纤维母细胞，使脂肪干细胞的含量为1×108个/ml，使纤维母细胞的含量为2×106个/ml。混匀，转移至5mL注射器中待用，制得干细胞制剂。
实施例6建立动物模型
1、建立糖尿病模型
取健康雌雄性Wistar大鼠30只。随机分为对照组(n＝5)和模型组(n＝25)。高糖高脂饮食喂养4周后，禁食5天(不禁水)，称量体重。模型组按50mg/kg腹腔注射新鲜配制的链脲佐菌素，对照组给予腹腔注射与模型组同等剂量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。5天后测晨起空腹血糖(fastingplasmaglucose，FPG)，以14.0mmol/L为成模标准。并以第一次注射为起点，分别于第5、7、10、15和25天测量晨起空腹血糖。血糖不达标者根据血糖水平再次注射链脲佐菌素(25mg/kg或20mg/kg)。
2、建立糖尿病足模型
1)将糖尿病成模大鼠连同对照组大鼠用10％水合氯醛以0.03mL/kg的浓度进行腹腔麻醉；
2)在大鼠的左侧腹股沟韧带处切开一纵行切口，分离肉膜层及肌层；在手术放大镜下暴露股动脉、静脉及其分支，结扎并离断；
3)逐层缝合皮下组织及皮肤，观察大鼠各项生命体征平稳后放回鼠笼；术后所有大鼠给予青霉素3万单位/天，持续3天以预防感染。
3、糖尿病及糖尿病足模型指标测定
1)血糖以第一次注射链脲佐菌素为起点，于注射后第5天、第7天、第14天和第28天用剪尾法测量晨起空腹血糖；
2)体重、饮水量、尿量，体重量为单个样本体重的测定；其中，饮水量为各饮水瓶总体饮水量，尿量为肉眼观察粗测；
3)肉眼观察糖尿病足溃疡或坏疽，分别观察模型组及对照组的缺血下肢的一般活动情况、皮肤颜色、溃疡或者坏疽出现时间及其累计部位。
4、结果
1)血糖水平：模型组的25只大鼠注射链脲佐菌素5天后，血糖均有不同程度的升高，其中23只大鼠的FPG>15.7mmol/l，并有多饮、多尿、多食、消瘦等症状。对照组的血糖在注射链脲佐菌素前为4.53±0.47mmol/L，注射链脲佐菌素5天后为4.6±0.32mmol/L，无明显差异；模型组血糖于注射链脲佐菌素5天后由4.47+0.27mmol/L升高至17.34+4.72mmol/L，与注射前及对照组同一时点进行比较有差异明显(P<0.05)。
2)体重：注射链脲佐菌素7天后，对照组大鼠的体重由注射前的214.5±14.21增加到215.5±15.46，无明显差异(P>0.05)；注射链脲佐菌素7天后，模型组大鼠的体重由注射前的215.24±16.03下降至148.47±10.05，与试验组注射链脲佐菌素前和同一时间点试验组大鼠的体重相比有明显差异(P<0.05)。
3)进行股动脉结扎后，大鼠进食量明显减少，左后肢活动受限。5天后，精神状况有所改善，但缺血后肢的活动力明显下降。用眼科剪分别在结扎动脉的下方皮肤制造约16cm2的创面，糖尿病足模型建立完成。
实施例7干细胞制剂的治疗效果验证
选取实施例6模型组中FPG>15.7mmol/L的23只大鼠中的20只作为试验对象，其中10只为空白对照组，10只为治疗试验组。治疗试验组的大鼠使用实施例3制备的干细胞制剂进行注射，空白对照组使用等量的生理盐水进行注射。在无菌条件下，消毒好创面周围的皮肤，围绕创面皮下分别对治疗试验组和空白对照组进行均匀点状肌注实施例3制备的干细胞制剂4mL和生理盐水4mL。在1h内完成肌注，连续定时观察10天创面愈合情况，并做好创面的记录。
试验结果如表1所示，治疗试验组大鼠的创面平均面积在治疗的10天不断缩小，有痊愈的趋势。空白对照组大鼠的创面平均面积不仅没有缩小，反而溃烂面积在不断增大。说明实施例3制备的干细胞制剂对治疗糖尿病足有良好的疗效。用实施例4和5制备的干细胞制剂重复上述试验，得到相似的结论。
表1各组大鼠的创面平均面积变化
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。