吴茱萸在制备治疗疟疾药物中的应用的制作方法

本发明涉及药物，具体涉及吴茱萸在制备治疗疟疾药物中的应用，尤其涉及吴茱萸提取物在制备治疗由疟原虫引起的疟疾药物中的应用。

背景技术：

疟疾(malaria)是严重危害人类身体健康和生命安全、影响社会经济发展的重要寄生虫病。疟疾与艾滋病、结核病一起被世界卫生组织列为全球亟需控制的公共卫生问题，是联合国千年发展目标中重点防控的3种传染病之一。根据世界卫生组织报道，仅在2015年内，全球有438000疟疾死亡病例，并且绝大部分发生在撒哈拉以南的非洲的五岁以下儿童。疟疾由疟原虫引起，其疟原虫包括了恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫，其中以恶性疟原虫致死率最高。带有成熟子孢子的雌按蚊叮咬人体后，将疟原虫注入人体，经10～20天会发生典型的疟疾临床症状，可分为四期：前驱期、发冷(寒战)期、发热期、出汗期和间歇期。疟疾的反复发作后，病人会出现贫血、肝脾肿大，甚至出现脑型、超高热型、厥冷型和胃肠型等凶险症状，甚至危及生命。

目前,由于疟原虫抗药性的迅速蔓延,特别是多重抗药性恶性疟不断地扩散与蔓延,在很多疟疾重灾区,可供选择的抗疟药物已十分有限,新药的产生速度跟不上抗药性出现的速度。抗疟药物的研究开发,主要还是依赖于对原有药物的结构改造及经验筛选。在该领域中,经验方法仍十分有效。但随着分子生物学的进展,对病原生物的研究逐渐深入,已经发现了疟原虫在核酸、蛋白质、糖和磷脂等代谢方面与宿主的代谢上有很多差异。研究者们正利用这些差异作为靶点,进行新抗疟药的开发和设计。新的药物合成手段,如组合化学等,也为加快新药研究奠定了基础。另外,从有抗疟作用的药用植物中提取有效成份,可以作为抗疟药研究和开发的切入点。总之,人类与疟疾的斗争任重而道远,对新药的需求也更加迫切,新抗疟药的市场前景广阔,这无疑将会带来更可喜的经济效益和社会效益。

中医药作为疟疾预防和治疗的重要组成部分,具有良好的疗效和提高生活质量的优势,成为疟疾治疗的重要手段之一。在中国著名书籍《本草纲目》和《疟疾论》记载了如常山、青蒿、鸦胆子、草果和砂仁等是在民间用来治疗疟疾的中草药。从中草药青蒿中发现的活性化合物青蒿素用于治疗疟疾取得了很好的效果，广泛用于临床，因此从中药中寻找具有抗疟活性中草药和有效成分意义重大。本发明人通过研究发现吴茱萸提取物具有显著抗疟作用。

吴茱萸为芸香科植物吴茱萸Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth.、石虎Evodia rutaecarpa(J uss.)Benth.Var.officinalis(Dode)Huang或疏毛吴茱萸Evodia rutaecarpa(J uss.)Benth.Var.bodinieri(Dode)Huang的干燥近成熟果实。主要分布于长江流域及华南一带。吴茱萸始载于《神农本草经》，列为中品，其药性辛，苦热，有小毒。归肝，脾，胃，肾经。其功效主要为温中止呕，散寒止痛，助阳止泻。主要应用于疼痛症、胃寒呕吐、呃逆症、虚寒泄泻症等。现代药理研究发现，吴茱萸有明显的镇痛、抗炎、抗胃溃疡、止呕、止泻及降血压等作用。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于研究设计吴茱萸在制备治疗疟疾药物中的应用。

本发明提供了吴茱萸提取物在制备治疗疟疾药物中的应用。

体内外抗疟活性测定结果显示，吴茱萸提取物有较好的体内外抗疟原虫活性。因此，可用于制备治疗疟疾的药物。

本发明的另一目的是提供以吴茱萸及其提取物为活性成分，用于制备治疗疟疾的中草药组合物，尤其用于制备治疗由疟原虫引起的疟疾的中草药组合物。

本发明所述药物组合物含有治疗有效量的吴茱萸及其提取物为活性成分，以及含有一种或多种中草药作为辅助药物或者含有一种或多种药学上可接受的载体。其中活性成分在药物组合物中的重量为5-95％。

所述其他可以接受的中草药，例如：马鞭草、柴胡、生姜、黄芩、狼牙草、常山、草果、人参、大枣等可以辅助吴茱萸发挥药效的中草药。

所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等；填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如明胶、聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如碳酸钙、碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙、聚乙二醇等、另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明的药物组合物可通过口服和外敷给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其职称常规的固体制剂如片剂、颗粒剂、胶囊等或制成液体制剂如水或油悬浮剂、糖浆等；用于外敷给药时，可将其制成软膏剂和经皮给药的剂型等。

本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使吴茱萸与其他中草药进行提取，然后将其制成所需的剂型。

附图说明

图1吴茱萸提取物和阳性药物(氯喹)对3D7虫株生存率影响图

图中氯喹组(分别为：0、0.01、0.1、1μg/mL)，吴茱萸组(分别为：0、5、15、50μg/mL)，*P<0.05**P<0.01***P<0.001

图2吴茱萸提取物和阳性药物(氯喹)在体内对伯氏疟原虫感染率影响图

图中空白模型组，10mg/kg氯喹组，0.6g/kg吴茱萸提取物组，1.2g/kg吴茱萸提取物组，2.4g/kg吴茱萸提取物组，*P<0.05**P<0.01***P<0.001

具体实施方式

实施例1：吴茱萸提取物的制备

将吴茱萸的干燥果实部分50g粉碎后，以500mL85％乙醇室温冷浸2次，每次24小时，合并两次浸出液并过滤，60℃以下减压回收溶剂，得干浸膏，取干浸膏1g，用二甲基亚砜(DMSO)配制为浓度20mg/mL的储备液。制得的储备液用于实施例2。

吴茱萸药材及浸膏经HPLC-UV进行指纹图谱分析，吴茱萸药材和提取物的与标准药材指纹图谱完全一致。

实施例2：吴茱萸提取物体外抗疟活性测定

抗疟活性可以通过测量疟原虫dsDNA含量来确定(Corey,V.C.,et al.,A broad analysis of resistance development in the malaria parasite.Nat Commun,2016.7:p.11901.)。在含20μL连续稀释测试样本和氯喹阳性药物(购自中国食品药品检定研究所)的96孔板的每个孔中加入感染了3D7虫株P.falciparum的红细胞混悬液(100μL，在RPMI 1640培养基(Gibco)中加入5g/L AlbuMAX(Gibco)和50mg/L庆大霉素(Sigma)，使疟原虫血症达到0.5％，红细胞压积达到2％)，然后置于37℃，5％CO2培养箱培养48小时。细胞用裂解液(Tris 2.4g/L,EDTA 1.86g/L,Saponin 0.08g/L,TritonX-100 0.8mL/L)进行裂解，来源于Sigma，dsDNA含量用10000X SYBR Green I试剂(Invitrogen)测定，测定程序参照文献(Plouffe,D.,et al.,In silico activity profiling reveals the mechanism of action of antimalarials discovered in a high-throughput screen.Proc Natl Acad Sci U S A,2008.105(26):p.9059-64.)。简要说来，就是将100μL培育的混合物和按文献说明配制好100μL SYBR Green I试剂混合，在室温下避光培育30-60分钟.然后100μL转移至黑色酶标板中。将酶标板放入EnSpire荧光酶标仪(PerkinElmer)中，在485nm和535nm的吸光值下读取酵标板中每孔的荧光信号值。从剂量-效应曲线中计算出IC₅₀。吴茱萸提取物的对3D7的IC₅₀值如下表：

结果显示，吴茱萸提取物有较好的体外抗疟原虫活性。

实施例3：吴茱萸提取物体内抗疟活性测定

伯氏疟原虫伯氏株培养，其所用红细胞为昆明小鼠红细胞，其他培养条件与疟原虫3D7培养方法一致。本发明用的动物是来自中山大学实验动物中心，品系为昆明种小鼠，所有的动物实验过程中对实验动物保护和使用根据NIH标准进行。对小鼠进行输血感染，抽取雄性小鼠心脏血液，用5％葡萄糖盐水将血液稀释成每0.2mL内含1×10⁶个受感染红细胞的悬液，腹腔接种小鼠。接种伯氏疟原虫3小时后，进行分组给药，每组8只，组别为：1、空白对照组(灌胃给予生理盐水)，2、氯喹阳性对照组(灌胃给予10mg/kg)，3、吴茱萸提取物(灌胃给予0.6g/kg、1.2g/kg和2.4g/kg)。每天测量体重无明显差异，在接种感染后第0、2、4、6天尾静脉取血涂膜检查减虫率,结果显示，吴茱萸提取物有较好的体内抗疟原虫活性。