一种吡咯咪唑聚酰胺脂质体及其制备方法及其用途与流程

本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种吡咯咪唑聚酰胺脂质体及其制备方法。

背景技术：

以基因为靶点的癌症治疗是一种新兴、高效的治疗手段，开发小分子化合物抑制类药物用于肿瘤治疗显得尤为关键。吡咯咪唑聚酰胺为一类人工合成的主要由五元杂环化合物n-甲基吡咯(py)、n-甲基咪唑(im)和n-甲基-3-羟基吡咯(hp)芳香氨基酸组成的，经酰胺键连接的人工小分子配体。吡咯-咪唑类聚酰胺通过与dna碱基对之间最大可能地形成氢键来识别dna序列：反向平行成对的py/py识别t·a或a·t碱基对；im/py特异性识别g·c碱基对，而py/im特异性识别c·g碱基对，hp/py特异性识别t·a碱基对，py/hp特异性识别a·t碱基对。通过设计特定的与靶向基因启动子关键序列特异结合的吡咯-咪唑类聚酰胺，可以阻断转录调控蛋白与靶向基因启动子的结合，从而从基因转录水平阻断基因的表达。与目前真核细胞中广泛使用的shrnai技术相比，吡咯-咪唑类聚酰胺介导的基因功能抑制在具备高特异性的同时，还具有稳定性高和细胞通透性好等显著优点，因此在以抑制基因表达为目的的药物研发中具有重大潜力。但该类小分子药物(如聚酰胺类)通常存在溶解性差，血液半衰期短，生物利用率低等缺点，需要通过制剂技术改进药物的代谢和动力学参数。

脂质体是类脂双分子层形成的超微型球体，类似生物膜结构，具有单一或几个环状脂质双分子层的壳层，同时内部含有一个水相的空腔，可以同时包载亲水性药物及疏水性药物。其基本组分磷脂是生物体内固有的成分，在生物体内经生物转化而降解，无毒性及免疫原性，因此，脂质体被认为是最具发展前途的药物载体之一。

目前，dervan、sugiyama及fukuda等课题组制备了一系列吡咯-咪唑类聚酰胺及其衍生物，也深入研究了其在体内外对基因表达的影响，近年来取得了令人瞩目的成果。但吡咯-咪唑类聚酰胺要发挥对目标基因表达的调控作用，能否穿过细胞膜和核膜进入细胞核是关键的一步。然而吡咯-咪唑类聚酰胺在不同细胞中的穿膜能力存在较大的差异，在部分组织中穿膜能力有限，尤其是在实体瘤中难以穿透癌细胞的细胞膜和核膜作用于目标dna序列。另外，吡咯咪唑聚酰胺还存在生物体内溶解性差，易团聚结晶，导致利用度低，生物用量大的问题。peterb.dervan组通过加入羟丙基β环糊精来增加吡咯-咪唑类聚酰胺的水溶性，可实现裸鼠的静脉给药。然而，羟丙基β环糊精具有圆筒状疏水性内腔和亲水性外沿，导致吡咯咪唑聚酰胺的包载率很低。而羟丙基β环糊精本身的水溶性有限，易产生溶血性和刺激性。

技术实现要素：

基于脂质体作为载体的优异性能，本发明的目的是采用以脂质体为基质的纳米药物载体对吡咯-咪唑聚酰胺进行有效包载，利用肿瘤生长的特点，血管增生导致的大量有缺陷的滋养血管生成及不完善的淋巴回流系统，促成纳米颗粒通过增强渗透及滞留效应对肿瘤实现被动性的靶向效果。具有长循环能力的纳米药物输送载体能够最终从脉管中溢出，累积到肿瘤组织，进入细胞内释放出治疗药物而起作用。

本发明旨在通过合理设计，从抑制剂化学合成入手，实现其高特异性地dna结合能力以及优良的穿膜性能；应用纳米材料包裹和靶向运输机制，显著改善聚酰胺类药物的药效以及毒理特征，以改善药物临床应用前景。实现药物在肿瘤组织内的高效蓄集，是设计药物递送体系的关键所在。为实现这一目的，以类似生物膜结构的脂质体材料对吡咯咪唑聚酰胺进行包载显著提高药物的溶解度并改变药物的运输方式，以低免疫原性包覆材料(如长链聚乙二醇)表面修饰策略提高药物载体的生物相容性及胶体稳定，延长其血液循环时间，有助于其通过epr效应被动富集于肿瘤组织。

本发明公开了一种用于包载能够识别plk1靶基因的吡咯咪唑聚酰胺小分子多肽药物的纳米脂质体的制备。该方法主要包括：将特异性识别plk1序列的吡咯咪唑聚酰胺通过不同种类磷脂分子包载制备不同表面基团及电荷的纳米脂质体，采用薄膜分散法得到载药纳米脂质体；在磷脂分子末端功能基团上添加聚乙二醇链，利用聚乙二醇改善经静脉注射给药后聚酰胺脂质体的血液循环时间。

本发明的吡咯咪唑聚酰胺是指能特异性靶向plk1启动子关键序列的一种人工合成的小分子化合物。根据人类plk1基因启动子dna序列，选择2-3端位于tatabox和gcbox周围的高特异性的20-25bp序列作为靶点序列。通过化学合成方法，合成与所选择序列相匹配的吡咯咪唑聚酰胺。通过合理的结构设计，将苯并咪唑类荧光基团与吡咯-咪唑类聚酰胺相偶联，不仅能够增强聚酰胺的穿膜能力，而且由于荧光标记的聚酰胺在与dna序列结合时会产生荧光，因此可以作为内在的荧光探针，监测聚酰胺的穿膜行为、在细胞中的运动以及与dna序列的结合情况。

本发明提供了一种吡咯咪唑聚酰胺脂质体，其由脂质双分子层和包载于脂质双分子层内的吡咯咪唑聚酰胺构成，其中脂质双分子层包括磷脂分子和胆固醇，其中，磷脂分子和胆固醇的摩尔比为(1～10):1，优选为(3～4):1，磷脂分子与吡咯咪唑聚酰胺的摩尔比为(20～30):1。

在本发明的技术方案中，磷脂分子选自磷脂、羧基化聚乙二醇-磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、1,2-二油酰-3-三甲基铵盐丙烷、羧基化聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的一种或多种的混合物。

优选地，磷脂分子中的聚乙二醇分子选自2000-5000。

在本发明的技术方案中，吡咯咪唑聚酰胺的浓度为1μm-50μm，优选为1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm.

在本发明的技术方案中，磷脂分子选自二硬脂酰磷脂酰胆碱、或羧基化聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、

进一步地，所述吡咯咪唑聚酰胺脂质体通过薄膜分散法、逆向蒸发法中的一种方法制备。

进一步地，吡咯咪唑聚酰胺选自具有n-甲基吡咯(py)、n-甲基咪唑(im)和n-甲基-3-羟基吡咯(hp)中的两种或三种的偶联物，或在其上修饰了赫斯特酸的衍生物，优选为式i结构化合物，

本发明吡咯咪唑聚酰胺脂质体的粒径为50-300nm。

本发明另一个方面提供了上述吡咯咪唑聚酰胺脂质体的制备方法，其以薄膜分散法、逆向蒸发法制备。

进一步地，其以薄膜分散法制备，包括以下步骤：

1)将磷脂分子和胆固醇溶解于有机溶剂中，形成膜材分散液；

2)在减压条件下，去除膜材分散液中的有机溶剂，并使磷脂分子和胆固醇在容器壁上形成均一分散薄膜；

3)将吡咯咪唑聚酰胺溶于超纯水分散后，加至步骤2)所得容器内，并机械分散使磷脂分子和胆固醇自组装成为包载吡咯咪唑聚酰胺的脂质体；

可选地，还包括步骤4)和5)，

4)将步骤3)得到的脂质体通过0.22μm的水系滤膜；

5)将步骤4)得到的吡咯咪唑聚酰胺脂质体超滤离心管处理，以去除游离吡咯咪唑聚酰胺。

本发明另一个方面提供了本发明所述的吡咯咪唑聚酰胺脂质体或式i所示化合物在制备plk抑制剂，优选为plk-1抑制剂的药物中的用途。

本发明另一个方面提供了本发明所述的吡咯咪唑聚酰胺脂质体在制备治疗或预防与plk1抑制剂相关的疾病的药物中的用途，所述与plk1抑制剂相关的疾病选自增殖性疾病，优选为肿瘤、更优选为肺癌、肝癌、卵巢癌、食道癌、宫颈癌、非小细胞肺癌、皮肤癌、白血病、霍奇金氏淋巴瘤。

有益效果

1)本发明的吡咯咪唑聚酰胺脂质体以脂质体内部空腔包载吡咯咪唑聚酰胺，相比于其他载体的包载方式能够有效提高包载量，从而显著提高吡咯咪唑聚酰胺类药物的生物利用度，可使其抑制肿瘤细胞的有效浓度从10μm降低到1μm以下。

2)本发明的吡咯咪唑聚酰胺脂质体在磷脂分子末端功能基团上偶联聚乙二醇链，利用聚乙二醇改善经静脉注射给药后聚酰胺脂质体的血液循环时间，提高药物在肿瘤部位的蓄积。

附图说明

图1为吡咯咪唑聚酰胺脂质体的制备过程示意图。

图2为实施例1吡咯咪唑聚酰胺脂质体的透射电镜照片。

图3为实施例3吡咯咪唑聚酰胺脂质体的粒径图。

图4为dspc吡咯咪唑聚酰胺载体和dspc-peg-cooh吡咯咪唑聚酰胺载体及游离吡咯咪唑聚酰胺抑制plk1蛋白表达。

图5为式i化合物hrms谱图。

具体实施方式

实施例1：吡咯咪唑聚酰胺脂质体的制备方法

(1)将24μl浓度为0.1m的二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)以及15μl浓度为50mm的胆固醇溶于2ml氯仿和1ml甲醇的混合溶液中；

(2)在减压条件下，旋转蒸发去除混合溶剂，在瓶底得到一层均一的膜；

(3)将0.1μmol的吡咯咪唑聚酰胺(式i化合物)溶于2ml超纯水中，加入到上述覆盖有磷脂膜的玻璃瓶中，超声10～20min，直至溶液从混浊变为澄清；

(4)将上述得到的溶液通过0.22μm的水系滤膜，重复3次；

(5)将上述吡咯咪唑聚酰胺混合水溶液转至分子截留量为50000的超滤离心管中，用超纯水洗涤3次以上以去除游离的药物。

实施例2：吡咯咪唑聚酰胺脂质体的制备方法

(1)将240μl浓度为0.1m的二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)以及150μl浓度为50mm的胆固醇溶于20ml氯仿和10ml甲醇的混合溶液中；

(2)在减压条件下，旋转蒸发去除混合溶剂，在瓶底得到一层均一的膜；

(3)将1μmol的吡咯咪唑聚酰胺(式i化合物)溶于20ml超纯水中，加入到上述覆盖有磷脂膜的玻璃瓶中，超声10～20min，直至溶液从混浊变为澄清；

(4)将上述得到的溶液通过0.22μm的水系滤膜，重复3次；

(5)将上述吡咯咪唑聚酰胺混合水溶液转至分子截留量为50000的超滤离心管中，用超纯水洗涤3次以上以去除游离的药物。

实施例3：吡咯咪唑聚酰胺脂质体的制备方法

(1)将24μl浓度为0.1m的羧基化聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspc-peg-cooh)以及15μl浓度为50mm的胆固醇溶于2ml氯仿和1ml甲醇的混合溶液中；

(2)在减压条件下，旋转蒸发去除混合溶剂，在瓶底得到一层均一的膜；

(3)将0.1μmol的吡咯咪唑聚酰胺(式i化合物)溶于2ml超纯水中，加入到上述覆盖有磷脂膜的玻璃瓶中，超声10～20min，直至溶液从混浊变为澄清；

(4)将上述得到的溶液通过0.22μm的水系滤膜，重复3次；

(5)将上述吡咯咪唑聚酰胺混合水溶液转至分子截留量为50000的超滤离心管中，用超纯水洗涤3次以上以去除游离的药物。

实施例4：吡咯咪唑聚酰胺脂质体的制备方法

(1)将240μl浓度为0.1m的羧基化聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspc-peg-cooh)以及150μl浓度为50mm的胆固醇溶于20ml氯仿和10ml甲醇的混合溶液中；

(2)在减压条件下，旋转蒸发去除混合溶剂，在瓶底得到一层均一的膜；

(3)将1μmol的吡咯咪唑聚酰胺(式i化合物)溶于20ml超纯水中，加入到上述覆盖有磷脂膜的玻璃瓶中，超声10～20min，直至溶液从混浊变为澄清；

(4)将上述得到的溶液通过0.22μm的水系滤膜，重复3次；

(5)将上述吡咯咪唑聚酰胺混合水溶液转至分子截留量为50000的超滤离心管中，用超纯水洗涤3次以上以去除游离的药物。

实施例5采用的蛋白免疫印迹法检测本发明脂质体诱导plk1蛋白表达

测试细胞采用人宫颈癌细胞系hela。使用完全培养基(dmem,添加10％fbs和抗生素10％p/s)培养hela细胞。利用胰酶将hela细胞消化重选后，均匀接种至60mm培养皿，24小时后添加测试药物。所述测试药物(实施例1和3以及游离药物)为用完全培养基稀释待试药物至1μm或10μm。药物作用时间72小时后，用0.25％胰酶消化细胞。将收集的细胞转移至1.5ml离心管，pbs清洗一次后，添加ripa裂解液，冰上裂解1小时。4度14000rpm离心15min，收集上清液体。用bca蛋白定量法测定蛋白浓度后，加入蛋白变性液，稀释至相同蛋白浓度；沸水孵育5min，变性蛋白。随后用sds聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离纯化目标蛋白。电泳完成后，将凝胶上的蛋白用电泳法转移至pvdf膜上。随后用5％脱脂奶粉/pbs封闭液室温孵育1小时。随后加入plk1抗体，4度孵育过夜。用pbs-t清洗后加入封闭液稀释的二抗，室温孵育1小时。pbs清洗后，用滤纸吸干pvdf膜上多于水分，加入化学发光底物，显色曝光。

通过图4可以看出，式i化合物具有抑制plk1的作用，其10μm组显示出很强的作用效果，但是1μm组几乎没有抑制作用。而实施例1和3脂质体无论1μm组还是10μm组均显示了很强的抑制作用，且1μm组和10μm组几乎没有差别。该实验证明了脂质体制剂有效地提高了生物利用度，对于式i化合物，生物利用度可以提高10倍，取得了预料不到的效果。

实施例6式i化合物的制备方法

1.前体1的合成

于一个50ml的固相反应器中加入肼树脂(0.61mmol/g，400mg，0.244mmol)及ch2cl2(3ml)，溶胀树脂20min。抽除ch2cl2，将20％哌啶/dmf溶液(3ml)加入树脂中，鼓气5min,抽去溶剂，再加入20％哌啶/dmf溶液(3ml)，鼓气5min,抽去溶剂，用dmf(4x3ml)洗涤树脂，再用nmp(2x3ml)洗涤树脂，备用。同时将boc-py-oh((176mg,0.732mmol,3eq.)和bop-cl(186mg,0.732mmol，3eq.)溶于nmp(2ml)，向该溶液中加入diea(400μl，2.2mmol，9eq.)，搅拌至溶液澄清，将该反应液转移到脱除fmoc的肼树脂中，并将树脂转移至50ml的ep管中，在微波反应器中，加热功率200w，75℃，反应15min(茚三酮试剂检测至反应完全)。抽除反应液，用dmf(4x3ml)洗涤树脂，再用无水dmf(3ml)洗涤树脂。向树脂中加入特戊酸酐(186μl,0.96mmol,4eq.)和diea(500μl,2.88mmol，12eq.)的dmf(2ml)溶液，反应15min，将树脂转入固相反应器中，抽除反应液，用dmf(4x3ml)洗涤树脂，最后用dcm(2x3ml)洗涤树脂。

然后根据以下方法直至完成前体1的合成

方法a：boc脱保护

tfa/tis/h2o溶液(95:2.5:2.5,3ml)加入树脂中，鼓气2min,抽去溶剂，再加入fa/tis/h2o溶液(95:2.5:2.5,3ml)，鼓气20min,抽去溶剂，先用dcm(2x3ml)洗涤树脂，再用dmf(4x3ml)洗涤树脂，最后用nmp(2x3ml)洗涤树脂。

方法b：boc-im-oh的偶联

将boc-im-oh(176mg,0.732mmol,3eq.)(或fmoc-d-dab(boc)-oh(322mg，0.732mmol，3eq.))、bop-cl(186mg,0.732mmol，3eq.)、hoat(100mg，0.732mmol，3eq.)溶于nmp(2ml)，向该溶液中加入diea(400μl,2.2mmol，9eq.)，搅拌至固体完全溶解。将该反应液转移到脱除boc的肼树脂中，并将树脂转移至50ml的ep管中，在微波反应器中，加热功率200w,75℃，反应15min(茚三酮试剂检测至反应完全)。将树脂低速离心，去除上清。然后树脂中加入甲醇洗涤，低速离心，弃上清，甲醇洗涤三次。将甲醇洗涤后的树脂转入固相反应器，再用甲醇(2x3ml)洗涤树脂，然后用dmf(4x3ml)洗涤树脂，最后用dcm(2x3ml)洗涤树脂。

方法c：boc-py-oh的偶联

将boc-py-oh(176mg,0.732mmol,3eq.)和bop-cl(186mg,0.732mmol，3eq.)溶于nmp(2ml)，向该溶液中加入diea(400μl,2.2mmol，9eq.)，搅拌至溶液澄清。将该反应液转移到脱除boc的肼树脂中，并将树脂转移至50ml的ep管中，在微波反应器中，加热功率200w,75℃，反应15min(茚三酮试剂检测至反应完全)。抽除反应液，用dmf(4x3ml)洗涤树脂，在用dcm(2x3ml)洗涤树脂。

方法d：im-oh的偶联

将im-oh(90mg,0.732mmol，3eq.)和pybop(380mg,0.732mmol，3eq.)溶于无水dmf(2ml)，向该溶液中加入diea(400μl,2.2mmol，9eq.)，搅拌至溶液澄清。将该反应液转移到脱除boc的肼树脂中，并将树脂转移至50ml的ep管中，在微波反应器中，加热功率200w,75℃，反应15min(茚三酮试剂检测至反应完全)。抽除反应液，用dmf(4x3ml)洗涤树脂。

方法e：茚三酮检测

偶联反应时，取出少量树脂，dmf洗两遍，加入两滴茚三酮检测液(茚三酮15g,乙酸3ml,正丁醇100ml),90℃加热3min，树脂不发生颜色变化表明反应完全。树脂由红变蓝表明存在初级氨。

2.前体2的制备

前体1用20％哌啶/dmf溶液((2x3ml，5min)脱除fmoc保护基，然后用dmf(4x3ml)洗涤树脂，再用无水dmf(3ml)洗涤树脂，备用。同时将hoechst33258酸((373mg,0.732mmol,3eq.)和pybop(380mg,0.732mmol，3eq.)溶于无水dmf(2ml)，向该溶液中加入diea(400μl,2.2mmol，9eq.)，搅拌至溶液澄清。将该反应液转移到脱除fmoc的肼树脂中，室温鼓气2h(茚三酮试剂检测至反应完全)。抽除反应液，用dmf(4x3ml)洗涤树脂。

3.终产物py-im-ht

树脂中加入少量dmf，醋酸铜，3-二甲氨基丙胺，过夜震荡，然后用半制备型hplc纯化，收集产物，旋转蒸发除去乙腈，得到的溶液冷冻干燥，最终获得py-im-ht。hrms(esi)m/z:calcdforc84h95n27o11[m+h]+1258.7783,found1658.7819；[m+2h]2+829.8930,found829.8856；[m+3h]3+553.5979,found553.6090.hrms谱图如图5所示。式i化合物的制备流程如下所示。