一种纳米仿脂蛋白结构药物载体及其制备方法和应用与流程

本发明属于医药制剂领域，涉及一种纳米仿脂蛋白结构药物载体及其制备方法和应用。

背景技术：

脂蛋白（lipoprotein）是由包含载脂蛋白和游离胆固醇（freecholesterol,fc）的磷脂层以及非极性的脂质核心组成的生物大分子，作为内源性载体，在血浆中承担胆固醇、胆固醇酯的运送。早在20世纪60年代天然脂蛋白已作为药物载体进行研究，而近年来合成脂蛋白成为药物递送领域新的研究热点。目前研究较广泛的是基于低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的纳米药物载体。与其他纳米粒相比，合成脂蛋白载体具有显著的优势。首先，合成脂蛋白纳米载体具有良好的生物相容性，不仅可以避免被体内网状内皮系统识别而快速清除，也可在体内被彻底降解。其次，合成脂蛋白构建的载体由亲水性表面和疏水性核心组成，这种结构有利于运输疏水性物质。合成脂蛋白载体在血液中可长时间循环，而且它的粒径大小适宜，既小到可以穿透肿瘤纤维间隙，也可避免由于粒径过小引起肾脏的快速消隙，也可避免由于粒径过小引起肾脏的快速消除，因此是一种可维持长时间疗效的良好的纳米药物载体。

由于脂蛋白纳米载体都来源于血浆分离，难以大规模生产，且其生物安全性也受到质疑，因此开发新型的人工模拟脂蛋白或纳米仿脂蛋白结构药物载体极具意义。尽管相关肽的合成技术已经开发，但用作临床纳米载体还有很多因素需要考察。此外，低密度脂蛋白受体介导的机制并不是一个理想的靶向传递途径，这些受体也存在于一些正常组织中，可能导致靶点外细胞毒性，另外，低密度脂蛋白受体在许多肿瘤细胞不过度表达，都限制了其进一步的应用。因此需要构建一种新型的仿纳米仿脂蛋白结构药物载体，来继承其优点，克服其不足。

技术实现要素：

针对目前抗肿瘤载体所面临的问题，本发明提供一种原料易得、安全性高、具有ph敏感释药功能的的纳米仿脂蛋白结构药物载体及其一种简便地制备该纳米仿脂蛋白结构药物载体的方法。

本发明另一目是提供所述纳米仿脂蛋白结构药物载体在制备治疗肿瘤药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种纳米仿脂蛋白结构药物载体，由脂质核心与包覆蛋白的质量比为5-20:1的脂质核心和包覆蛋白组成，所述脂质核心由包载药物，二油酰磷脂酰乙醇胺，油酸，胆固醇，十八胺组成，所述二油酰磷脂酰乙醇胺与油酸摩尔比为1-8:1；所述二油酰磷脂酰乙醇胺与胆固醇的质量比为2-6:1。

作为优选，载药脂质核心与包覆蛋白的质量比为10-20:1；二油酰磷脂酰乙醇胺与油酸摩尔比为2-4:1；二油酰磷脂酰乙醇胺与胆固醇的质量比为4-6:1。

上述纳米仿脂蛋白结构药物载体，二油酰磷脂酰乙醇胺与包载药物的质量比为5-20:1；二油酰磷脂酰乙醇胺与十八胺的质量比为15-60:1。

作为优选，二油酰磷脂酰乙醇胺与被载药物的质量比为10-15:1；二油酰磷脂酰乙醇胺与十八胺的质量比为30-60:1。

上述纳米仿脂蛋白结构药物载体，所述的包覆蛋白为血清蛋白，选自人血清蛋白或牛血清蛋白。所述包覆蛋白通过静电作用吸附于脂质核心外围，作为纳米仿脂蛋白结构药物载体的蛋白结构部分。

上述纳米仿脂蛋白结构药物载体，所述的包载药物为脂溶性抗肿瘤药物，优选为紫杉烷、姜黄素、喜树碱、多西他赛，更优选为紫杉烷。所述紫杉烷选自紫杉醇、多烯紫杉醇、7-乙酰基紫杉醇、t-乙酰基紫杉醇、10-去乙酰基紫杉醇、10-去乙酰基-7-表紫杉醇、7-木糖苷紫杉醇、10-去乙酰基-7-戊二酰基紫杉醇、7-n，n-二甲基甘氨酰紫杉醇和7-l-丙氨酰紫杉醇中的一种或者多种。

上述纳米仿脂蛋白结构药物载体，所述纳米仿脂蛋白结构药物载体，粒径为50-150nm；所述脂质核心的粒径为60-120nm。

一种制备上述纳米仿脂蛋白结构药物载体的方法，包括以下步骤：

1）将二油酰磷脂酰乙醇胺、油酸、胆固醇、包载药物、十八胺用有机溶剂溶解，减压蒸干成膜；加入磷酸盐缓冲液冰浴超声，制成载药脂质核心液；

（2）称取包覆蛋白，用磷酸缓冲液溶解成蛋白溶液，缓慢、搅拌加入到上述步骤（1）所得载药脂质核心液中，30-40ºc孵育6-8h，即得纳米仿脂蛋白结构药物载体。

上述步骤（1）中，蒸干温度为30-50℃，优选为35-40℃；磷酸缓冲液的ph为7.4；超声时间为5-15min，优选为5-10min。

上述步骤（1）中，有机溶剂选自乙醚、氯仿和二氯甲烷中的一种或几种的混合。

上述步骤（2）中包覆蛋白的浓度为1-10mg/ml，优选为1-5mg/ml。

所述纳米仿脂蛋白结构药物载体用于制备治疗肿瘤药物的应用。应用时，给药方式为静脉注射。

在纳米仿脂蛋白结构药物载体的脂质核心中加入少量十八胺，使脂质核心带正电荷。由于血清蛋白的等电点约为4.9-5.3，因此在ph7.4的近中性环境下，血清蛋白带负电荷，通过正负电荷相互吸引的的静电作用包覆在带正电荷的脂质核心上。

纳米仿脂蛋白结构药物载体中油酸成分在的中性条件下，羧酸基离子化，弥补二油酰磷脂酰乙醇胺（dope）的立体缺陷，共同形成稳定的脂质体双层膜，可在血浆等近中性的体液中稳定存在。表面的包覆蛋白可被肿瘤细胞表面的受体识别，介导纳米仿脂蛋白结构药物载体内吞进入肿瘤细胞。在酸性溶酶体环境中，由于ph<6.5，油酸羧酸基质子化，失去对dope的补缺作用，引起六方晶格（非相层结构）的形成，双分子层稳定性受到破坏，与生物膜发生膜融合作用，释放包封物质至胞浆内，实现溶酶体逃逸功能。

本发明具有以下优点：

本发明制备的新型纳米仿脂蛋白结构药物载体具有肿瘤靶向及ph敏感性，可制备多种包载脂溶性药物的制剂，尤其是脂溶性抗肿瘤药物制剂。血浆中含有大量带负电的血浆调理蛋白，在对外源性物质的清除中发挥重要作用：调理蛋白吸附于外源性物质，进而被内皮系统（res）识别和清除。因此，将内源性血清白蛋白通过合适手段吸附于载药纳米颗粒表面，一方面可以降低表面电荷，另外可以增加载药纳米颗粒表面的亲水性，降低与调理蛋白等的亲和力。表面电荷的降低和亲水性的增加可以减少与血浆蛋白及调理蛋白的结合，增加载药纳米颗粒在血浆中的稳定性。本纳米仿脂蛋白结构药物载体由于具有亲水性及生物相容性蛋白层，因此在血浆中具有良好的稳定性，可延长其在血液中的循环时间，增加体内稳定性，并且通过gp60（glycoprotein60）受体及富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（secretedprotein,acidicandrichincysteine，sparc）介导的内吞，可靶向作用于肿瘤细胞。

在纳米仿脂蛋白结构药物载体的脂质核心，加入具有ph敏感作用的脂质成分二油酰磷脂酰乙醇胺（1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine,dope）与油酸（oleicacid,oa），用来实现内涵体或溶酶体逃逸功能。因此，本发明的纳米仿脂蛋白结构药物载体作为具有生物相容性，肿瘤靶向以及ph敏感释药功能的一种新型仿纳米仿脂蛋白结构药物载体，可有效将药物脂溶性抗肿瘤药物递送至肿瘤细胞内，达到理想的抗肿瘤效果。

附图说明

图1为载紫杉醇仿脂蛋白结构载体的电镜照片；

图2为载紫杉醇仿脂蛋白结构载体在不同ph条件下的体外累积释放曲线；

图3为各载药纳米载体对mcf-7细胞的细胞毒性。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1载紫杉醇仿脂蛋白结构载体的制备。

（1）称取二油酰磷脂酰乙醇胺（dope）60mg，油酸（oa）5.7mg，胆固醇为12mg，紫杉醇6mg，十八胺2mg，用10ml氯仿溶解，置于100ml茄形瓶中，37ºc减压旋转蒸干成膜，加入10ml磷酸盐缓冲液（ph7.4，0.02mol/l），37ºc水化30min；冰浴上探头超声5min制成脂质核心液；

（2）准确称取牛血清蛋白8.4mg，用1.68ml磷酸盐缓冲液（ph7.4，0.02mol/l）溶解成5mg/ml的蛋白溶液，步骤（2）中脂质核心液缓慢、搅拌加入到上述载药脂质核心液中，37ºc缓慢搅拌孵育8h，即得载紫杉醇仿脂蛋白结构载体（简称为bsa-lc/dope-ptx）溶液。

实施例2含大豆卵磷脂成分载紫杉醇仿脂蛋白结构载体的制备。

参照实施例1中的制备方法制备对照用含大豆卵磷脂成分载紫杉醇脂质核心（lc/spc-ptx）和含大豆卵磷脂成分载紫杉醇仿脂蛋白结构载体（bsa-lc/spc-ptx），区别为用大豆卵磷脂（spc）取代lc/dope-ptx中的dope及oa成分，其他成分用量保持不变。

实施例3载药脂质核心的表征。

3.1脂质核心的粒径及zeta电位

取适量新鲜制备的载紫杉醇脂质核心，加蒸馏水稀释至适当浓度。采用zetasizer-nanozs90粒度和zeta电位分析仪对稀释液中粒径及其分布进行考察，并对其zeta电位进行测定，结果如表1所示。

3.2脂质核心的包封率与载药量

采用低速和超速离心法相结合的方法分离游离药物，测定脂质核心中紫杉醇的包封率，结果如表1所示，具体步骤如下：

（1）先取样品溶液，用磷酸盐缓冲液（ph7.4，0.02mol/l）稀释后，置于离心管中1000r/min离心10min，得上清液，重复此操作两次，即得载药脂质核心上清液；

（2）取上述上清液超速离心50000r/min，30min。移走上清液后，将沉淀物用磷酸盐缓冲液（ph7.4，0.02mol/l）洗2次，得脂质核心沉淀；

（3）在上述沉淀中，加甲醇定容，超声破坏，过0.22μm微孔滤膜，hplc法检测紫杉醇含量，得载药脂质核心中紫杉醇的量。按公式eq.1计算包封率（encapsulationefficiency,ee），按公式eq.2计算载药量（drug-loadingefficiency,dl）：

包封率（ee）=(eq.1)

载药量（dl）=(eq.2)

表1载紫杉醇脂质核心的粒径、dpi、zeta电位、包封率、载药量

表中数据为3次测量平均值±标准差。

由表1数据可知，脂质核心lc/dope-ptx，粒径为102nm，且粒径pdi值为0.177，具有良好的粒径分布；zeta值为16.97mv，适于下一步的蛋白包覆；并且具有较高的包封率及载药量，分别为93.03%及6.97%，因此可用于药物紫杉醇的包载及递送。

实施例4载紫杉醇仿脂蛋白结构载体的表征。

4.1载紫杉醇仿脂蛋白结构载体的形态、粒径及zeta电位

取适量新鲜制备的载紫杉醇仿脂蛋白结构载体，加蒸馏水稀释至适当浓度。将稀释液滴加于覆盖碳膜的铜网上，使液体尽量铺满整个铜网，室温下自然晾干，于透射电子显微镜（tem）下观察形态并拍照，得电镜照片图1。采用zetasizer-nanozs90粒度和zeta电位分析仪对稀释液中粒径及其分布进行考察，并对其zeta电位进行测定，结果如表2所示。

4.2载紫杉醇仿脂蛋白结构载体的包封率、载药量及包覆率

参照3.2中脂质核心的包封率与载药量的测定方法对载紫杉醇仿脂蛋白结构载体的包封率、载药量进行测定，结果见表2。

取适量新鲜制备的载紫杉醇仿脂蛋白结构载体，微柱离心法分离未包覆的游离蛋白，收集游离即未被包覆的蛋白部分至10ml容量瓶，加入并以蒸馏水定容，采用考马斯亮蓝法测定游离蛋白含量，按公式eq.3计算包覆率（coatingefficiency,ce），结果见表2：

包覆率（ce）=(eq.3)

表2载紫杉醇仿脂蛋白结构载体的粒径、dpi、zeta电位、包封率与包覆率

表中数据为3次测量平均值±标准差。

由表2数据可知，制备的载紫杉醇仿脂蛋白结构载体的粒径约为121nm，粒径分布指数pdi为0.185，zeta电位为4.89mv，包封率、载药量、包覆率分别为89.77%、6.60%、85.9%。相比于载药脂质核心，载紫杉醇仿脂蛋白结构载体由于包覆了血清蛋白，粒径明显增加；由于带负电荷的蛋白部分屏蔽脂质核心表面的正电荷，导致其表面zeta电位明显下降，以上均证明了血清蛋白的有效包覆。制备的载紫杉醇仿脂蛋白结构载体具有良好的粒径分布，缓和的电位值，以及外层包覆的具有亲水，良好生物相容性的蛋白层，能够避免res识别与清除，提高载体在体内的血液循环的稳定性。制备的载紫杉醇仿脂蛋白结构载体具有具有较高的包封率、载药量与包覆率，因此适用于药物紫杉醇的运载。

4.4载紫杉醇仿脂蛋白结构载体于体外ph敏感释放药物行为

精密吸取载紫杉醇仿脂蛋白结构载体溶液0.1ml于透析袋中，置于200ml，ph值分别为5.0，6.0，7.4，含0.1%（v/v）吐温-80的磷酸盐缓冲液释放介质中，于37ºc，100r/min的摇床中振摇，定时取出释放介质200μl，同时补充相同体积和温度的新鲜释放介质。hplc法测定释放介质中的药物含量，计算累积释放度并绘制累积释放曲线，考察不同ph条件下，纳米载体的体外释药行为。以时间为横坐标，以累计释放率为纵坐标，做图2。

由图2可知，载紫杉醇仿脂蛋白结构载体在ph7.4条件下，药物缓慢释放，在48h的累积释放量不超过40%；相反，当ph降低至6.0时，药物从载紫杉醇仿脂蛋白结构载体中快速释放，累积释放量在48h时达到59.5%，并且在ph为5.0时，药物释放明显增加，12h内释放量为57.7%，48h后累积释放量为69.3%。药物在ph7.4条件下缓慢释放，表明载紫杉醇仿脂蛋白结构载体在生理条件下比较完整。由于载紫杉醇仿脂蛋白结构载体具备这种ph敏感的释放药物行为，因此具备细胞内的药物传递功能。通过在肿瘤细胞内与内涵体或溶酶体膜融合，有效地将包封物质传递至胞质中，达到良好的抗肿瘤效果。

4.5血浆稳定性

载紫杉醇仿脂蛋白结构载体分别在同体积的磷酸盐缓冲液（pbs）及含50%血浆的磷酸盐缓冲液（plamsa）中，37ºc下孵育。分别在3h，12h，24h取样，测定载体粒径，测定方法考察纳米载体在血浆中的稳定性，结果见表3。

表3载紫杉醇仿脂蛋白结构载体血浆稳定性

表中数据为3次测量平均值±标准差。

由表3结果可知，bsa-lc/dope-ptx在与同体积的pbs及plamsa在37ºc下孵育后的的粒径没有明显变化，表明bsa-lc/dope-ptx的亲水性及生物相容性蛋白层使其在血浆中具有稳定性。并且在共同孵育24h后，粒径均没有发生明显变化，仍具有较好的稳定性。

实施例5载紫杉醇仿脂蛋白结构载体的抗肿瘤活性。

将各载紫杉醇纳米载体lc/dope-ptx，bsa-lc/spc-ptx，bsa-lc/dope-ptx，及taxol^®（bristolmyerssquibbsrl公司生产）用不含血清的培养液制成不同紫杉醇浓度，0.22μm微孔滤膜过滤除菌。分别取对数生长期的mcf-7细胞，以5×10³cells/well接种于96孔板中，37ºc培养。同时设置空白组（只加不含细胞的培养液）。培养12h后，取出培养板，吸走孔内培养液，每孔加入不同紫杉醇浓度的各种载药制剂200μl，每组设5个复孔。对照组为不加载药制剂的200μl无血清培养液。置培养箱中培养48h后，吸去培养液，每孔加入20μlmtt溶液（5.0mg/ml）继续培养4h，弃去孔内液体，每孔加入150μl二甲亚砜，震荡10min，使沉淀充分溶解。最后用酶标仪490nm测定吸光度值。按下式计算细胞存活率（cellviability）。以紫杉醇浓度为横坐标，以细胞存活率为纵坐标作图3，说明各载药纳米载体的细胞毒性，其中标注**的表示统计学意义上有极显著差异：

细胞存活率=(eq.4)。

由图3数据可知，taxol^®在中高浓度1μg/ml及10μg/ml，有较高的细胞毒性，是由于taxol^®中聚氧乙烯蓖麻油（cremophorel）对细胞的毒性较大，因此产生较高的细胞毒性。然而，载紫杉醇纳米载体lc/dope-ptx，bsa-lc/spc-ptx，bsa-lc/dope-ptx在较低紫杉醇浓度（低于0.1μg/ml）时，具有比taxol^®更高的细胞抑制作用。相对于游离紫杉醇对细胞膜的被动扩散作用，bsa-lc/spc-ptx、bsa-lc/dope-ptx借助载体的蛋白层牛血清蛋白与肿瘤细胞表面的受体及富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（sparc）高度亲和性，靶向结合，通过sparc介导的内化作用，将药物紫杉醇更多的传递至肿瘤细胞，产生较高的细胞毒性。由结果可知，bsa-lc/dope-ptx对肿瘤细胞mcf-7的抑制作用明显高于bsa-lc/spc-ptx。bsa-lc/dope-ptx由于具有ph敏感作用的dope，介导载体与溶酶体膜产生膜融合效应，将药物紫杉醇从溶酶体中逃逸，释放到胞浆中，较无溶酶体逃逸功能的bsa-lc/spc-ptx产生更高的细胞毒性。因此，bsa-lc/dope-ptx通过sparc介导的靶向作用及dope的ph敏感作用介导载体与溶酶体膜产生膜融合效应，对mcf-7肿瘤细胞发挥明显生长抑制作用，达到理想的抗肿瘤效果。