复合基因载体及其应用的制作方法

本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种复合基因载体及其应用。

背景技术：

随着21世纪蛋白组学、生物技术、化学基因组学迅猛发展，基因治疗已成为生命科学领域的一个研究热点。目前，肿瘤、心血管疾病等领域的常规治疗尚缺乏有效药物，因此，从基因水平上进行疾病治疗已成为医学领域的一个研究热点。而在基因治疗过程中，需要将外源基因引入到细胞中,但是dna分子通常以带负电的疏松状态存在,体积较大,满负电荷与细胞表面之间存在排斥作用,很难进入细胞中，另外dna会被体内的核酸酶降解,在未进入靶细胞,甚至未达到靶器官时便降解成小分子核苷酸,从而失去治疗作用，所以为了基因治疗的高效率，要求在体内运输过程中治疗基因需得到更好的保护，因此基因载体应运而生，将目的基因与载体结合，使得外源基因或有功能的核酸片段导入到细胞中，实现基因表达调控、基因功能甚至基因治疗的目的。开发高效的基因载体对于整个基因治疗乃至基因工程中都是极为重要的一环，也将推动基因治疗向常规治疗的过渡。基因载体的效率可用细胞转染率及编码外源蛋白的表达量来表示,只有高转染效率的载体才是能真正应用于基因治疗过程中，因此开发高转染效率的载体是基因治疗研究中一个重点。

目前基因载体分病毒载体和非病毒载体两种。病毒载体转染效率很高，但是存在如免疫原性等严重的安全性问题，而且搭载目的基因容量小，制备复杂，费用昂贵。非病毒载体免疫原性低、低毒、制备简便且适合大规模生产，但是普遍转染效率都较低。

脂质体载体(如dc-chol-dope、dosper-dope、dotma-dope和lipofectamine^tm2000等等)是非病毒载体中研究比较深入的一类载体，阳离子脂质体因其操作简便，转染的安全性、高效性和通用性而得到广泛应用且已有产品应用于临床试验。lipofectamine^tm2000(以下简称为lipo2000)是脂质体载体的一个典型代表，是现在商品化载体中的明星产品，可为517种细胞提供高转染效率(表达转基因细胞的百分数)和活性(细胞抽提物中转入基因的酶产物活性)。lipo2000转染步骤简单便捷，对很多细胞的转染效率也较高。但是lipo2000的高转染效率并非能针对所有细胞，对于一些细胞它的转染效率并不能达到治疗研究过程所满意的结果。

另外，阳离子聚合物也是非病毒载体的一类。聚酰胺-胺(pamam)树状大分子是一类合成的、单分散的纳米级大分子化合物,具有高度分支、多价性、易被修饰、用途广泛等特点。很多文献均有对pamam及其修饰得到的衍生物进行研究，研究发现，聚酰胺-胺树状高聚物可作为阳离子型基因载体，它能有效地包裹核酸，安全性好(参考文献：[1]huangh,tangg,wangq,etal.twonovelnon-viralgenedeliveryvectors:lowmolecularweightpolyethyleniminecross-linkedby(2-hydroxypropyl)-beta-cyclodextrinor(2-hydroxypropyl)-gamma-cyclodextrin.chemcommun(camb),2006,22:2382-2384.[2]yangc,wangx,lih,etal.synthesisandcharacterizationofpolyrotaxanesconsistingofcationicalpha-cyclodextrinsthreadedonpoly[(ethyleneoxide)-ran-(propyleneoxide)]asgenecarriers.biomacromolecules,2007,8:3365-3374.[3]yangc,lih,gohsh,etal.cationicstarpolymersconsistingofalpha-cyclodextrincoreandoligoethyleniminearmsasnonviralgenedeliveryvectors.biomaterials,2007,28:3245-3254.)。采用α-环糊精作为内核，在其外部枝接低聚酰胺-胺树状大分子第二代(pamam-g2)得到高分子聚合物cdg2。cdg2载体作为聚阳离子型基因载体的一种，有一定的包裹和压缩核酸的能力，对某些细胞具有一定的转染效率，但是同样存在细胞种类差异性导致的转染效率低的问题，对于某些细胞甚至转染率极低。

技术实现要素：

基于此，本发明提供了一种复合基因载体，该复合基因载体对多种细胞都具有较高的转染效率。

具体技术方案如下：

一种复合基因载体，由cdg2和脂质体复合而成，所述cdg2和脂质体的质量比为1-5:1，所述cdg2是通过在α-环糊精的外部接枝pamam-g2制备得到。

在其中一些实施例中，所述cdg2和脂质体的质量比为1.5-4:1。

在其中一些实施例中，所述脂质体选自dc-chol-dope、dosper-dope、dotma-dope和lipofectamine^tm2000中的至少一种。

在其中一些实施例中，所述cdg2的制备方法包括以下步骤：将α-环糊精与偶联剂反应，得到连接有偶联剂的α-环糊精；将pamam-g2与连接有偶联剂的α-环糊精反应，即得所述cdg2。

在其中一些实施例中，所述偶联剂为n,n-羰基二咪唑。

在其中一些实施例中，所述α-环糊精、n,n-羰基二咪唑与pamam-g2的质量比为1：11-15：50-55。

本发明还提供了上述复合基因载体的应用。

具体技术方案如下：

上述的复合基因载体在制备基因治疗药物中的应用。

本发明还提供了一种dna/载体复合物。

具体技术方案如下：

一种dna/载体复合物，由上述的复合基因载体与dna复合而成。

在其中一些实施例中，所述复合基因载体与dna的质量比为2.5-5:1。

本发明还提供了一种dna/载体复合物的制备方法。

具体技术方案如下：

一种制备dna/载体复合物的方法，包括以下步骤：将cdg2配制成浓度为0.7-0.9mg/ml的cdg2水溶液，将脂质体配制成浓度为0.9-1.1mg/ml的脂质体水溶液，将dna配制成浓度为75-85ng/μl的dna水溶液；取18.5-19μlcdg2水溶液、5-7μl脂质体水溶液、70-80μldna水溶液和45-55μl水，混合后在室温下静置孵育25-35min，即得所述dna/载体复合物；所述cdg2是通过在α-环糊精的外部接枝pamam-g2制备得到。

在其中一些实施例中，所述脂质体选自dc-chol-dope、dosper-dope、dotma-dope和lipofectamine^tm2000中的至少一种。

在其中一些实施例中，所述cdg2的制备方法包括以下步骤：将α-环糊精与偶联剂反应，得到连接有偶联剂的α-环糊精；将pamam-g2与连接有偶联剂的α-环糊精反应，即得所述cdg2。

在其中一些实施例中，所述偶联剂为n,n-羰基二咪唑。

在其中一些实施例中，所述α-环糊精、n,n-羰基二咪唑与pamam-g2的质量比为1：11-15：50-55。

本发明的复合基因载体及其应用具有以下优点和有益效果：

本发明的发明人通过大量实验研究发现，将cdg2与脂质体基因载体复合后获得的复合基因载体相比单独的cdg2和单独的脂质体基因载体能够显著提高细胞转染效率。通过转染几种实验室常用的实验细胞，包括hek293t细胞，a549细胞，lovo细胞和hek293a细胞，证实了其高转染效率的结果。由于实验需要或者细胞的个体差异性，对基因传递载体的转染效率会提出更高的要求，本发明的复合基因载体，能够显著提高细胞转染率，将其用于基因治疗药物的制备，有利于推动基因治疗药物的发展。

附图说明

图1为实施例1中的三种载体介导pegpf-c1转染hek293t细胞的荧光图片；

图2为实施例1中的三种载体介导pegpf-c1转染a549细胞的荧光图片；

图3为实施例1中的三种载体介导pegpf-c1转染lovo细胞的荧光图片；

图4为实施例1中的三种载体介导pegpf-c1转染hek293a细胞的荧光图片；

图5为实施例1中的三种pdna/载体纳米复合物转染hek293t细胞的的转染效率；

图6为实施例1中的三种pdna/载体纳米复合物转染a549细胞的的转染效率；

图7为实施例1中的三种pdna/载体纳米复合物转染lovo细胞的的转染效率；

图8为实施例1中的三种pdna/载体纳米复合物转染hek293a细胞的的转染效率；

图9为实施例2中的三种载体介导pegpf-c1转染hek293t细胞的荧光图片；

图10为实施例2中的三种pdna/载体纳米复合物转染hek293t细胞的转染效率；

图11为实施例3中的三种载体介导pegpf-c1转染hek293t细胞的荧光图片；

图12为实施例3中的三种pdna/载体纳米复合物转染hek293t细胞的的转染效率；

图13为实施例4中的三种载体介导pegpf-c1转染hek293t细胞的荧光图片；

图14为实施例4中的三种pdna/载体纳米复合物转染hek293t细胞的的转染效率。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的复合基因载体及其应用做进一步详细的说明。

lipofectamine^tm2000为invitrogen公司市售商品，简称为lipo2000；

dc-chol-dope：自制，其中dc-chol购自上海艾韦特医药科技有限公司，dope购自瑞士cordenpharma公司。

其制备方法如下：称取1mgdc-chol和1mgdope，溶于1ml氯仿/甲醇中。氮气吹干，形成薄膜，真空干燥10h。向里面加入1ml无菌水，恒温45摄氏度超声1.5h。得到透明澄清产品，即制得dc-chol-dope。

dosper-dope：自制，其中dosper购自上海倍卓生物科技有限公司，dope购自瑞士cordenpharma公司。

其制备方法如下：称取1mgdosper和1mgdope，溶于1ml氯仿/甲醇中。氮气吹干，形成薄膜，真空干燥10h。向里面加入1ml无菌水，恒温45摄氏度超声1.5h。得到透明澄清产品，即制得dosper-dope。

dotma-dope：自制，其中dotma购自上海艾韦特医药科技有限公司，dope购自瑞士cordenpharma公司。

其制备方法如下：称取1mgdotma和1mgdope，溶于1ml氯仿/甲醇中。氮气吹干，形成薄膜，真空干燥10h。向里面加入1ml无菌水，恒温45摄氏度超声1.5h。得到透明澄清产品，即制得dotma-dope。

cdg2为自制产品，其中制备原料pamam-g2(低聚酰胺-胺树状大分子第二代)购自：西安瑞禧生物科技有限公司；cdg2的制备方法包括以下步骤：

(1)将偶联剂n,n-羰基二咪唑(cdi)连接到α-环糊精(cd)上：分别称取6.35gcdi和0.47gcd，于35℃真空干燥箱干燥24小时，分别溶于25ml无水dmso溶液中，将cd的无水dmso溶液超声至溶液透明，搅拌和氮气保护下，将cd溶液用注射器缓慢加入cdi溶液中，室温搅拌反应24小时。用混合溶剂(200mlthf:400mlet2o)对反应液进行沉淀、离心，小心去除上清液、用300mlthf洗涤数次，离心沉淀，得到黄色粘稠液，于90℃真空干燥箱干燥24小时，得到白色粘稠物，即为连接有偶联剂的α-环糊精(cd-cdi)。

(2)pamamg2纯化：准确取24.8gpamam-g2溶于100ml甲醇溶液中，用混合溶剂(400mlthf:200mlet2o)沉淀，离心，去除上清液，用400mlet2o洗涤数次、离心、沉淀，得到黄色粘稠状物质，于60℃真空干燥箱干燥6h，即为纯化后的pamamg2。

(3)将纯化后的pamamg2接枝到cd-cdi上制备cdg2：将步骤(2)中制备的cd-cdi和已纯化的pamamg2分别溶于25ml和100ml无水dmso溶液中，在搅拌和氮气保护下，将cd-cdi用注射器缓慢的加入pamamg2溶液中(加入时间为30分钟)，室温搅拌下反应24小时，用混合溶剂(300mlthf:600mlet2o)将反应液沉淀、离心，小心去除上清液，400mlthf洗涤数次，离心沉淀，得到黄色粘稠液，将黄色粘稠液溶于20ml去离子水中透析3天，即得cdg2。

以下实施例中所用pdna为pegpf-c1质粒，其制备方法按试剂盒说明进行，具体如下：

(1)100mllb培养基的配制：分别称取1.0g蛋白胨，0.5g酵母，及1.0g氯化钠，溶于100ml去离子水中，15psi高压下蒸汽灭菌20min。

(2)在生物安全柜中向已灭菌的lb培养基中加入100μl卡那霉素，再加入1ml已转化有绿色荧光蛋白质粒基因的大肠杆菌，于37℃，270rpm振摇培养14～16h。

(3)向吸附柱cp5中加入2.5ml平衡液bl,1000rpm，离心2min,倒掉收集管中的废液，并将吸附柱重新收回收集管中。

(4)将24小时振摇的菌液加入50ml离心管中，于高速离心机中4℃，12000rpm,离心3min,弃去上清液，并将离心管倒置于滤纸上以完全吸干管壁上残留的培养基。

(5)向收集到的菌体的离心管中加入7ml含有rnasea的p1溶液，涡旋以彻底混悬细菌，然后加入7ml溶液p2，立即温和地上下翻转6到8次，室温静置5min，再加入7ml溶液p4，再次激励温和的上下翻转6到8次，室温静置10min，4℃，1000rpm，离心20～30min，使得菌体蛋白完全沉淀于离心管底部，再小心地将溶液全部倒入过滤器cs中，慢慢推动推柄过滤，最后将滤液收集在干净的50ml离心管中。

(6)向滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇，上下翻转颠倒混匀后缓慢转移到吸附柱cp5中，4℃，1000rpm，室温离心4min，倒掉收集管中的废液，再按照上述离心条件离心至全部滤液过柱，将吸附柱cp5重新放回收集管中。

(7)向吸附柱cp5中加入10ml漂洗液pw，4℃，10000rpm，离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，并重复漂洗一次。

(8)向吸附柱中加入3ml无水乙醇，4℃，12000rpm，离心5min,弃去收集管中的废液，再将吸附柱重新放回收集管中，4℃,12000rpm，离心5min,将吸附柱开盖至于室温放置5min，以充分晾干吸附柱中残留的乙醇溶液。

(9)将吸附柱至于一个干净50ml离心管中，向吸附柱中悬空缓慢滴加1.5ml洗脱缓冲液tb，室温放置8min，然后1000rpm离心3min，收集收集管中的洗脱液，即为质粒pegpf-c1，再加入2ml预热的tb洗脱缓冲液重复操作一次。

(10)小心收集滤液，以洗脱缓冲液tb或去离子水为空白，于nanodrop2000紫外可见分光光度计中测定dna浓度，并记录od260和od280的值。其中od280/od260比值在1.8-2.0之间则dna纯度合格，最后用去离子水将dna溶液稀释到工作浓度放置于-20℃贮存备用。

实施例1

1、pdna/载体纳米复合物的制备

(1)将cdg2配制成浓度为0.8mg/ml的水溶液；将dna配制成浓度为80ng/μl的水溶液；将lipo2000配制成浓度为1mg/ml的水溶液。

(2)按以下配比配制复合物溶液，再将复合物溶液在室温下静置孵育30min，即分别得到pdna/cdg2纳米复合物、pdna/lipo2000纳米复合物、pdna/cdg2/lipo2000纳米复合物。

pdna/cdg2复合物溶液的组成:37.5μlcdg2,75μldna,37.5μlh2o。

pdna/lipo2000复合物溶液的组成:12μllipo2000,75μldna,63μlh2o。

pdna/cdg2/lipo2000复合物溶液的组成:6μllipo2000,18.8μlcdg2,75μldna,50.2μlh2o。

2、细胞培养

将hek293t细胞、hek293a细胞、a549细胞和lovo细胞分别在含10％胎牛血清(fbs)的高糖dmem培养基中，在37℃、5％二氧化碳培养箱中进行培养。

3、转染实验

(1)接种细胞

用含0.25％edta的胰蛋白酶消化处于生长对数期的hek293t、hek293a、a549和lovo细胞，制备成单细胞悬液，再将细胞接种到24孔板中，6.0×10⁵个细胞/孔，于含血清的完全培养基中培养24h，用pbs冲洗细胞，每孔加入600μl不含血清的dmem培养基，等细胞汇合度为80％时即可进行转染。

(2)细胞转染

将上述配好的pdna/载体纳米复合物加入步骤(1)的接种有细胞的24孔板中，每孔加入50μl(dna量为2μg)，每组三个复孔，在37℃、5％二氧化碳的培养箱中转染4h后，弃去培养液，再加入1ml含10％胎牛血清的dmem，继续培养44h后，弃去培养基。

用倒置相差荧光显微镜定性观察pdna/载体纳米复合物的体外转染效率。于倒置相差荧光显微镜下观察细胞状态以及绿色荧光蛋白的表达，并用图形软件imageproplus6.0拍摄记录荧光图片，结果见图1-图4。从图中可以看出：cdg2和lipo2000的复合物介导pegpf-c1转染细胞(hek293t、hek293a、a549和lovo)的绿色荧光蛋白表达量最高，显著高于单独的cdg2和单独的lipo2000。

用流式细胞术定量测定pdna/载体纳米复合物的体外转染效率。上一步拍照完成之后，立即用pbs缓冲液将板内各孔细胞洗2次，加入300μl含0.25％edta的胰蛋白酶消化，再加入600μl含10％血清的dmem培养基终止消化，1000rpm离心5min,小心弃去上清液，最后加入300μl0.5％多聚甲醛溶液重悬细胞。用流式细胞仪测定每10000个细胞中表达绿色荧光蛋白的细胞百分数，得到pdna/载体纳米复合物的的细胞转染效率，结果见图5-图8。从图中可以看出：cdg2和lipo2000复合物的转染效率显著高于单独的cdg2和lipo2000。

实施例2

1、pdna/载体纳米复合物的制备

(1)将cdg2配制成浓度为0.8mg/ml的水溶液；将dna配制成浓度为80ng/μl的水溶液；将dc-chol-dope配制成浓度为1mg/ml的水溶液。

(2)按以下配比配制复合物溶液，再将复合物溶液在室温下静置孵育30min，即分别得到pdna/cdg2纳米复合物、pdna/dc-chol-dope纳米复合物、pdna/cdg2/dc-chol-dope纳米复合物。

pdna/cdg2复合物溶液的组成:37.5μlcdg2,75μldna,37.5μlh2o。

pdna/dc-chol-dope复合物溶液的组成:12μldc-chol-dope,75μldna,63μlh2o。

pdna/cdg2/dc-chol-dope复合物溶液的组成:6μldc-chol-dope,18.8μlcdg2,75μldna,50.2μlh2o。

hek293t细胞培养与转染实验同实施例1，用倒置相差荧光显微镜定性观察的结果见图9，用流式细胞仪定量测定的结果见图10，从图中可以看出：cdg2和dc-chol-dope复合物的转染效率显著高于单独的cdg2和dc-chol-dope。

实施例3

1、pdna/载体纳米复合物的制备

(1)将cdg2配制成浓度为0.8mg/ml的水溶液；将dna配制成浓度为80ng/μl的水溶液；将dosper-dope配制成浓度为1mg/ml的水溶液。

(2)按以下配比配制复合物溶液，再将复合物溶液在室温下静置孵育30min，即分别得到pdna/cdg2纳米复合物、pdna/dosper-dope纳米复合物、pdna/cdg2/dosper-dope纳米复合物。

pdna/cdg2复合物溶液的组成:37.5μlcdg2,75μldna,37.5μlh2o。

pdna/dosper-dope复合物溶液的组成:12μdosper-dope,75μldna,63μlh2o。

pdna/cdg2/dosper-dope复合物溶液的组成:6μldosper-dope,18.8μlcdg2,75μldna,50.2μlh2o。

hek293t细胞培养与转染实验同实施例1，用倒置相差荧光显微镜定性观察的结果见图11，用流式细胞仪定量测定的结果见图12，从图中可以看出：cdg2和dosper-dope复合物的转染效率显著高于单独的cdg2和dosper-dope。

实施例4

1、pdna/载体纳米复合物的制备

(1)将cdg2配制成浓度为0.8mg/ml的水溶液；将dna配制成浓度为80ng/μl的水溶液；将dotma-dope配制成浓度为1mg/ml的水溶液。

(2)按以下配比配制复合物溶液，再将复合物溶液在室温下静置孵育30min，即分别得到pdna/cdg2纳米复合物、pdna/dotma-dope纳米复合物、pdna/cdg2/dotma-dope纳米复合物。

pdna/cdg2复合物溶液的组成:37.5μlcdg2,75μldna,37.5μlh2o。

pdna/dotma-dope复合物溶液的组成:12μdotma-dope,75μldna,63μlh2o。

pdna/cdg2/dotma-dope复合物溶液的组成:6μldotma-dope,18.8μlcdg2,75μldna,50.2μlh2o。

hek293t细胞培养与转染实验同实施例1，用倒置相差荧光显微镜定性观察的结果见图13，用流式细胞仪定量测定的结果见图14，从图中可以看出：cdg2和dotma-dope复合物的转染效率显著高于单独的cdg2和dotma-dope。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。