肉苁蓉多糖制备治疗缺血性脑卒中的药物的用途的制作方法

本发明涉及肉苁蓉多糖的应用，特别涉及肉苁蓉多糖作为治疗缺血性脑卒中药物的用途。

背景技术：

缺血性脑病(ischemicbraindisease)又称缺血性脑卒中，目前已成为全球范围内主要致死、致残的疾病之一，严重威胁着人类的生命与健康。静脉溶栓疗法被认为是目前唯一有效而可行的卒中治疗措施，但其受到治疗时间窗严格以及颅内出血风险的限制，使得大量患者难以从项治疗中获益。因此，为脑卒中治疗寻找新的预防、治疗方案就显得尤为重要。

近年大量的研究中认为脑血流中断和再灌注导致的脑细胞损伤是一个多因素、多机制、快速的恶性级联反应。这个级联反应包括许多环节，如能量障碍、细胞酸中毒、兴奋性氨基酸释放增加、细胞内钙失稳态、自由基生成、凋亡基因激活等。这些环节互为因果，彼此重叠，并相互联系，形成恶性循环，最终导致细胞凋亡或坏死。

细胞氧化应激损伤是导致细胞凋亡和死亡的重要因素之一。随着对细胞抗氧化研究的进一步深入，人们逐渐认识到细胞抗氧化在继发于缺血性脑损伤发病机制中发挥着重要作用。目前，抗氧化机制参与脑缺血损伤已成为基础与临床研究的热点。

肉苁蓉多糖为列当科植物肉苁蓉(cistanchedeserticolay.c.ma)及管花肉苁蓉(c.tubulosa(schenk)r.wight)提取物的主要活性成分之一。研究已经发现肉苁蓉多糖具有免疫调节、抗衰老、改善脾虚、抗病毒抗肿瘤、促进造血等多方面的药理作用，但其对脑缺血神经损伤的保护作用目前尚未见报道，将其开发为缺血性脑卒中治疗药物具有极高的潜在价值与社会意义。

技术实现要素：

本发明的目的是通过对肉苁蓉多糖药理作用的研究，提供肉苁蓉多糖作为治疗缺血性脑卒中药物的用途。本发明中使用的肉苁蓉多糖可以用本领域常规的提取方法从天然药材中提取获得或者通过商购获得。

本发明通过以下技术方案来实现发明目的：

肉苁蓉多糖在制备治疗缺血性脑卒中药物中的用途，

具体地，所述缺血性卒中为急性期或修复期的缺血性脑卒中。

具体地，所述肉苁蓉多糖的单次应用量为不引起血糖上升的剂量。

具体地，所述肉苁蓉多糖在细胞中的单次应用剂量为0.05～5μg/ml。

优选地，肉苁蓉多糖在细胞中的单次应用剂量为0.5～5μg/ml。

优选地，肉苁蓉多糖在细胞中的单次应用剂量为5μg/ml。

具体地，所述药物的剂型为药剂学上允许的口服剂型、注射剂型或粉针剂型。

本发明公开的肉苁蓉多糖作为治疗缺血性脑卒中药物的用途，具有如下有益效果：

⑴肉苁蓉多糖在不升高血糖的浓度情况下能够显著提高氧糖剥夺再灌注损伤后的细胞存活率；

⑵肉苁蓉多糖能够减弱氧化应激引起的细胞损伤，维持细胞内钙离子稳态和线粒体膜电位，降低细胞凋亡率；

实验结果表明，肉苁蓉多糖具有氧糖剥夺再灌注损伤后的细胞保护作用，可用于制备缺血性脑卒中的治疗药物。

附图说明

图1：肉苁蓉多糖对氧糖剥夺再灌注损伤后pc12细胞形态变化影响的共聚焦明场图(×200)；

图2：肉苁蓉多糖对氧糖剥夺再灌注损伤后pc12细胞存活率的影n＝3；与正常组比较：^##p<0.01，与模型组比较：^＊p<0.05，^＊＊p<0.01)：

图3：肉苁蓉多糖对氧糖剥夺再灌注损伤后pc12细胞乳酸脱氢酶漏出率的影响(n＝3；与正常组比较：^##p<0.01，与模型组比较：^＊p<0.05，^＊＊p<0.01)；

图4：肉苁蓉多糖对氧糖剥夺再灌注损伤后pc12细胞钙离子水平变化的影响(×100)(n＝3；与正常组比较：^##p<0.01，与模型组比较：^＊p<0.05，^＊＊p<0.01)；

图5：肉苁蓉多糖对氧糖剥夺再灌注损伤后pc12细胞线粒体膜电位变化的影响(×200)(n＝3；与正常组比较：^##p<0.01，与模型组比较：^＊p<0.05，^＊＊p<0.01)；

图6：肉苁蓉多糖对氧糖剥夺再灌注损伤后pc12细胞hoechst33342荧光及细胞核变化的影响(×100)(与正常组比较：^##p<0.01，与模型组比较：^＊p<0.05，^＊＊p<0.01(n＝3))；

图7：肉苁蓉多糖对氧糖剥夺再灌注损伤后pc12细胞凋亡率的影响(n＝3；与正常组比较：^##p<0.01，与模型组比较：^＊p<0.05，^＊＊p<0.01)；

图8：肉苁蓉多糖对氧糖剥夺再灌注损伤后pc12细胞内ros含量的影响(n＝3；与正常组比较：^##p<0.01，与模型组比较：^＊p<0.05，^＊＊p<0.01)；

图9：肉苁蓉多糖对氧糖剥夺再灌注损伤后pc12细胞总抗氧化能力(t-aoc)的影响(n＝3；与正常组比较：^##p<0.01，与模型组比较：^＊p<0.05，^＊＊p<0.01)；

图10：肉苁蓉多糖对氧糖剥夺再灌注损伤后pc12细胞过氧化氢酶(cat)活性的影响(n＝3；与正常组比较：^##p<0.01，与模型组比较：^＊p<0.05，^＊＊p<0.01)；

图11：肉苁蓉多糖对氧糖剥夺再灌注损伤后pc12细胞谷胱甘肽还原酶(gsh-px)活性的影响(n＝3；与正常组比较：^##p<0.01，与模型组比较：^＊p<0.05，^＊＊p<0.01)；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明：

实施例1

肉苁蓉多糖作为治疗缺血性脑卒中药物的用途，缺血性卒中为急性期或修复期的缺血性脑卒中，其中肉苁蓉多糖在细胞中单次应用量为0.05μg/ml，药物的剂型为药剂学上允许的粉针剂型。

实施例2

肉苁蓉多糖作为治疗缺血性脑卒中药物的用途，缺血性卒中为急性期或修复期的缺血性脑卒中，其中肉苁蓉多糖在细胞中单次应用量为0.5μg/ml，药物的剂型为药剂学上允许的粉针剂型。

实施例3

肉苁蓉多糖作为治疗缺血性脑卒中药物的用途，缺血性卒中为急性期或修复期的缺血性脑卒中，其中肉苁蓉多糖在细胞中单次应用量为5μg/ml，药物的剂型为药剂学上允许的粉针剂型。

以下细胞实验进一步说明了上述实施例1至3的效果：

一实验材料

1.1pc12细胞培养

实验室冻存的pc12细胞复苏后，用含有10％胎牛血清、100u/ml青链霉素1640培养基，于37℃、5％co2培养箱常规培养，胰蛋白酶消化传代，备用。

1.2实验试剂与仪器

甲氮甲唑蓝(mtt)购自广州化学试剂厂；酶标仪购自thermo公司；ldh、ros、t-aoc、cat、gsh-px测定试剂盒：南京建成生物工程研究所产品；钙离子，hoechst，mmp试剂盒：碧云天试剂公司；annexinv-fitc细胞凋亡检测试剂盒：上海贝博生物公司。激光共聚焦显微镜(tcs-sp，德国leica公司)。流式分析仪(美国bdfacscalibur)。肉苁蓉多糖购自上海源叶生物科技有限公司。

1.3实验分组与给药

实验分为模型组，肉苁蓉多糖低、中、高剂量组(0.05μg/ml、0.5μg/ml、5μg/ml)，尼莫地平阳性对照组和正常组(即空白对照组)。

1.3实验模型

pc-12细胞于培养第3d换以无糖ebss平衡盐缓冲液充分冲洗若干次，使葡萄糖终浓度小于1mol/l，加入无糖earle’s平衡盐溶液(ebss液)，并放入缺氧盒内，持续缓慢通入含有n2的混合气体4h，取出并吸弃平衡盐缓冲液，换以完全培养基置入co2培养箱孵育，模拟体内缺血再灌注的过程，孵育24h；肉苁蓉多糖低、中、高剂量组：换以无糖ebss液建立缺糖缺氧模型，在再灌注时间点前分别加入高、中、低(0.05μg/ml、0.5μg/ml、5μg/ml)三个浓度的肉苁蓉多糖，其他处理同氧糖剥夺再灌注模型组；尼莫地平阳性对照组：换以无糖ebss液以建立氧糖剥夺模型，在再灌注时间点前加入尼莫地平，其他处理同氧糖剥夺再灌注模型组；正常组：对细胞不做任何处理。

一实验过程

㈠检测细胞存活率

1.1实验方法

给予不同药物处理的细胞经氧糖剥夺氧糖培养24h后，加入5mg/mlmtt溶液20μl，继续孵育4h后终止培养。小心吸弃上清液，每孔加入150μl二甲基亚砜dmso混匀，选择490nm波长测定各孔光吸收值，记录结果。细胞活力(％)＝实验组光吸收值/对照组光吸收值×100％。

1.2实验结果：

表1.肉苁蓉多糖对pc12细胞氧糖剥夺再灌注损伤后存活率的影响

(与正常组比较：^##p<0.01；与模型组比较：*p<0.05,**p<0.01)

由表1和图1、图2可以看出，单次给予肉苁蓉多糖对pc12细胞氧糖剥夺再灌注损伤后的细胞存活率的提高随药物浓度增加而增强，至5μg/ml时保护作用最强(与模型组对比^**p﹤0.01)，提示肉苁蓉多糖在0.5μg/ml、5μg/ml的浓度均对pc12细胞氧糖剥夺再灌注损伤具有保护作用。

(二)检测肉苁蓉多糖对pc12细胞损伤后ldh漏出率的影响

2.1实验方法

给予不同药物处理的细胞经氧糖剥夺氧糖培养24h后收集各组细胞的培养液。使用预冷的pbs洗涤神经细胞3次，细胞刮子轻轻刮取细胞并移入离心管中。用超声波细胞破碎仪破碎细胞，设定的仪器参数为工作时间3s，间隔时间5s，每个样品重复5次。取少量细胞破碎液，于光镜下确认无完整的细胞。1000rpm，4℃离心5min，取上清。参照试剂盒的说明书分别检测培养液中和细胞匀浆中ldh的吸光度a，计算ldh漏出率(％)＝(细胞培养液od440/(细胞培养液od440+细胞匀浆od440))×100

2.2实验结果

表2.肉苁蓉多糖对pc12细胞氧糖剥夺再灌注损伤后ldh漏出率的影响

(与正常组比较：^##p<0.01；与模型组比较：**p<0.01)

由表2和图3可以看出，单次给予肉苁蓉多糖能够降低pc12细胞氧糖剥夺再灌注损伤后的细胞ldh漏出率。提示肉苁蓉多糖在0.05μg/ml、0.5μg/ml、5μg/ml的浓度均具有降低损伤后的细胞ldh漏出率的作用(与模型组对比^**p﹤0.01)。

(三)检测肉苁蓉多糖对pc12细胞损伤后钙离子水平的影响

3.1实验方法

将细胞种植培养在激光共聚焦专用皿中，氧糖剥夺再灌注后进行实验。使用pbs轻轻冲洗3遍，每次冲洗5分钟，然后加入试剂盒中提供的的2.5μmol/l的fluo-3/am，并将其置于培养箱中孵育30分钟。使用pbs液冲洗3遍，每遍洗5分钟。在每个皿中加入1mlpbs溶液。在激光共聚焦显微镜下采片观察，根据分析软件(image-proplus)对采集的区域进行荧光强度分析。

3.2实验结果

表3.肉苁蓉多糖对pc12细胞氧糖剥夺再灌注损伤后钙离子荧光强度的影响

(与正常组比较：^##p<0.01；与模型组比较：**p<0.01)

由表3和图4可以看出，单次给予肉苁蓉多糖能够降低pc12细胞氧糖剥夺再灌注损伤后的细胞钙离子荧光强度。提示肉苁蓉多糖在0.05μg/ml、0.5μg/ml、5μg/ml的浓度均具有减轻损伤后的细胞钙离子超载的作用(与模型组对比^**p﹤0.01)。

(四)检测肉苁蓉多糖对pc12细胞损伤后线粒体膜电位的影响

4.1实验方法

按照说明书中的步骤首先取试剂盒中的jc-1(200×)，本次试验约需三百微升jc-1(5×)，按照比例，加入480ml的超纯水将jc-1稀释。剧烈摇晃，使其充分溶解并混匀。然后再加入两毫升的jc-1染色缓冲液,配成最后浓度为5×的缓冲液，混匀后即可。将培养皿放在37℃的培养箱中孵育20分钟。在孵育期间，按照说明书再配制适量的jc-1染色缓冲液(1×)，置于4℃。37℃孵育结束后，弃上清液，用配制好的jc-1(1×)染色缓冲液，充分冲洗细胞三次，每次5分钟。加入2ml细胞常规培养液，在激光共聚焦显微镜下采片观察，根据分析软件(image-proplus)对采集的区域进行荧光强度分析。使用分析软件通过得出红绿荧光比值继而来衡量线粒体膜电位的水平。

4.2实验结果

表4.肉苁蓉多糖对pc12细胞氧糖剥夺再灌注损伤后钙离子水平的影响

(与正常组比较：##p<0.01；与模型组比较：**p<0.01)

检测到的线粒体膜电位(mmp)越大，红绿荧光比值越小，细胞损伤的越严重。由表4和图5可以看出，肉苁蓉多糖在0.05μg/ml、0.5μg/ml、5μg/ml的浓度均具有减轻损伤后的细胞钙离子超载的作用(与模型组对比^**p﹤0.01)。

(五)检测肉苁蓉多糖对pc12细胞损伤后细胞凋亡率的影响

5.1实验方法

5.1.1hoechst33342染色检测细胞凋亡率

将细胞培养在激光共聚焦专用皿中用于实验。吸弃原培养液，用预温的pbs洗3次，每次3min，加入细胞固定液于室温下固定30min。用pbs洗4次/3min，加入400μl工作浓度为1μg/ml的hoechst33342于室温下避光孵育10min，再使用pbs洗4次，每次3min。在激光共聚焦显微镜下采片观察，根据分析软件(image-proplus)对采集的区域进行荧光强度分析。

5.1.2实验结果

表5.肉苁蓉多糖对pc12细胞氧糖剥夺再灌注损伤后hoechst33342荧光的影响

(与正常组比较：##p<0.01；与模型组比较：**p<0.01)

5.2.1流式检测细胞凋亡率

消化并收集复氧后的细胞，用冷pbs洗涤两次，尽量吸弃pbs；用400μl1╳annexinv结合液重悬细胞，加入5μlannexinv-fitc染色液，2-8℃避光孵育15分钟，加入10μlpi染液2-8℃避光孵育5分钟；立即用流式细胞仪进行检测。

5.2.2实验结果

表6.肉苁蓉多糖对pc12细胞氧糖剥夺再灌注损伤后细胞凋亡率的影响

(与正常组比较：##p<0.01；与模型组比较：**p<0.01)

由表5、6和图6、7可以看出，单次给予肉苁蓉多糖能够降低pc12细胞氧糖剥夺再灌注损伤后的细胞凋亡率。提示肉苁蓉多糖在0.05μg/ml、0.5μg/ml、5μg/ml的浓度均具有减轻损伤后的细胞凋亡的作用(与模型组对比^**p﹤0.01)。

(六)检测肉苁蓉多糖对pc12细胞损伤后ros、t-aoc、cat、gsh-px水平的影响

6.1实验方法

给予不同药物处理的细胞经氧糖剥夺氧糖培养24h后收集各组细胞的培养液。使用预冷的pbs洗涤神经细胞3次，细胞刮子轻轻刮取细胞并移入离心管中。用超声波细胞破碎仪破碎细胞，设定的仪器参数为工作时间3s，间隔时间5s，每个样品重复5次。取少量细胞破碎液，于光镜下确认无完整的细胞。1000rpm，4℃离心5min，取上清。参照试剂盒的说明书分别检测培养液中和细胞匀浆中

6.2实验结果

表7.肉苁蓉多糖对pc12细胞氧糖剥夺再灌注损伤后氧化应激相关指标的影响

(与正常组比较：##p<0.01；与模型组比较：*p<0.05，**p<0.01)

由表7和图8～11的结果表示，单次给予肉苁蓉多糖能够显著降低pc12细胞氧糖剥夺再灌注损伤后细胞内ros含量，提高抗氧化相关酶t-aoc、cat、gsh-px的活性；随药物浓度增加，抗氧化物酶(t-aoc、cat、gsh-px)活性增强，ros含量降低，至5μg/ml时细胞内的氧自由基清除剂活性最强，抗氧化物酶(t-aoc、cat、gsh-px)活性最强(与模型组对比^*p﹤0.05或^**p﹤0.01)。提示肉苁蓉多糖(0.05μg/ml、0.5μg/ml、5μg/ml)均具有减轻pc12细胞氧糖剥夺再灌注后细胞氧化应激损伤的作用。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。