N‑富勒烯氨基酸衍生物纳米颗粒在制备光照条件下治疗肿瘤药物的应用和药物的制作方法

本发明涉及富勒烯衍生物的医药应用领域，特别涉及一种n-富勒烯氨基酸衍生物纳米颗粒在制备光照条件下治疗肿瘤药物的应用和药物。

背景技术：

癌症是起源于上皮组织的恶性肿瘤，是由于控制肿瘤细胞生长的机制失常而引起的疾病，其已成为继心脑血管疾病之后危害人类健康生存的第二大杀手。根据2017年世界卫生组织发布的最新数据统计表明，全球每年有880万人死于癌症，占全球每年死亡总人数近六分之一，每年有1400多万新发展的癌症病例，预计到2030年这一数字将增加到2100多万。癌症的治疗已经迫在眉睫。

治疗癌症的方法有很多，如传统的手术疗法、化疗、放疗以及最近兴起的基因疗法、免疫疗法等。这些方法有的成本太高，有的副作用大，效果不佳。因此，能够实现快速有效、无副作用的肿瘤靶向治疗技术已经成为癌症或肿瘤治疗目前亟需解决的难题。

随着材料科学的发展，富勒烯由于具有优异的光电子传输性能被广泛关注。富勒烯是由不同数目碳原子组成的笼状碳原子簇，其是除石墨、金刚石和无定型碳之外碳元素的另一种同素异形体。另外由于富勒烯的碳笼内部为空腔结构，因此其内部空腔可内嵌不同原子、离子或原子簇，被称之为内嵌富勒烯，如gd@c82，表示gd内嵌在c82的笼状结构中，@表示at，形象的表达了内嵌的含义。富勒烯独特的分子尺寸、三维笼状结构以及电子结构决定了它在生物医学领域具有非常广阔的应用前景。

目前，将富勒烯衍生物用于治疗肿瘤有采用射频为能量源，但此应用仪器设备以及操作相对复杂，需要的药物剂量大，治疗效果有待改进，而且作用机理尚不明确。

光动力学疗法(photodynamictherapy，pdt)是一种联合利用光敏剂、光和氧分子，通过光动力学反应选择性地治疗恶性病变如实体肿瘤和癌前病变和良性病变如湿性老年性黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration，amd)、鲜红斑痣(port-winestain，pws)和感染等疾病的新型疗法。

本发明是基于光动力学疗法的基础之上对其进行改善，用于肿瘤的治疗，将会进一步拓展富勒烯衍生物在医学领域中的应用，从而推动光电和生物治疗产业的发展。

技术实现要素：

为了解决现有富勒烯衍生物用于治疗肿瘤时治疗效果弱、药物剂量较大的问题，本发明提供n-富勒烯氨基酸衍生物纳米颗粒在制备光照条件下治疗肿瘤药物的应用和药物，由n-富勒烯氨基酸衍生物纳米颗粒制得的药物可在低强度光照射下用于治疗肿瘤，具体采用的方案如下。

本发明提供了式i的n-富勒烯氨基酸衍生物纳米颗粒在制备光照条件下治疗肿瘤药物的应用，其中，式i的n-富勒烯氨基酸衍生物结构如下：

式中，f表示空心富勒烯或金属富勒烯；

x代表每个氨基酸基团连接到富勒烯的个数，0≤x＜40，且x均为整数；

y代表每个羟基连接到富勒烯的个数，0≤y＜20，且y均为整数。

所述光照条件采用的光源为白光，波长为400～700nm。

所述光照条件的能量为1～150mw/cm²，辐照时间为5min～2h；优选的，光照的能量为30～100mw/cm²，辐照时间为10min～1h；最优选的，光照的能量为100mw/cm²，辐照时间为20min。

实施所述光照条件时采用的设备为金卤灯光纤维照射装置(mvl210)。

所述空心富勒烯的结构通式为c2n，其中，30≤n≤60，所述空心富勒烯优选为富勒烯c60、富勒烯c70、富勒烯c76、富勒烯c78、富勒烯c84中的至少一种。

所述金属富勒烯选自m@c2n、m2@c2n、ma@c2n、m3n@c2n、m2c2@c2n、m2s@c2n、m2s@c2n、m2o@c2n和mma3-mn@c2n中的至少一种，其中，m、a均为金属元素；优选的，m、a均选自sc、y和镧系金属元素中的至少一种，30≤n≤60，0≤m≤3，且n、m均为整数，m为gd；最优选的，所述金属富勒烯为gd@c82、gd3n@c80。

所述氨基酸基团来自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、精氨酸、赖氨酸和天门氨酸中的至少一种。

所述n-富勒烯氨基酸衍生物纳米颗粒的水合直径为1～800nm，优选为30～650nm，进一步优选为100～150nm。

所述式i的n-富勒烯氨基酸衍生物纳米颗粒的制备方法，包括：在所述空心富勒烯或金属富勒烯中加入所述氨基酸和碱溶液，进行加成反应，得到式i的n-富勒烯氨基酸衍生物纳米颗粒。

在上述制备方法中，所述氨基酸与空心富勒烯或者金属富勒烯的摩尔比为1∶0.1到1∶20，优选为1∶0.5到1∶10，进一步优选为1∶1。

在上述制备方法中，所述碱溶液为氢氧化钠溶液。

在上述制备方法中，所述加成反应的温度为40～100℃，优选为80℃。

本发明还提供了一种治疗肿瘤的药物，其特征在于：活性组分包括式i的n-富勒烯氨基酸衍生物纳米颗粒。

所述药物为光动力治疗药物，给药方式包括静脉注射、腹腔注射、口服和局部给药中的至少一种。

所述药物为注射剂时，其溶剂为水、生理盐水、pbs缓冲液和tris-hcl溶液的至少一种。

所述生理盐水的溶度可为0.85～0.90％，pbs缓冲溶液的浓度可为0.01～0.1mol/l，tris-hcl溶液的浓度可为0.05mol/l。

所述药物的浓度可为0.5～10mmol/l。

所述肿瘤可以为肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肾癌、胰腺癌、骨癌、口腔癌、鼻癌、喉癌、胆管癌、食管癌、胃癌、皮肤癌、黑色素瘤、肉瘤宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、脑膜癌中的至少一种。

所述药物的给药剂量为1mg/kg～100mg/kg；优选为2～30mg/kg；进一步优选为5mg/kg、10mg/kg或20mg/kg。具体的所述患肿瘤生物体总给药量按照所述荷瘤生物体的体重进行换算。

所述药物的施用步骤包括：将式i的n-富勒烯氨基酸衍生物纳米颗粒经透析纯化后通过小鼠的尾静脉注入小鼠体内，然后立即在小鼠肿瘤部位予以光照。

治疗肿瘤的过程包括：在小鼠体内的式i的n-富勒烯氨基酸衍生物纳米颗粒经光照后由单线态被激发至三线态，与空气中的氧气发生作用，产生一定浓度的活性氧，由于大部分的纳米粒子此时位于血管中，因此能够产生的高浓度的活性氧，可瞬间破坏血管壁，进而破坏肿瘤血管。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.本发明突破传统的光动力治疗的概念，传统的光动力治疗是将药物注射到体内，等药物分子靶向到肿瘤组织后给予光照，但一般的药物分子靶向性极差，且由于肿瘤部位缺氧，导致光动力效果不佳。

本发明是将药物直接静脉注射到小鼠体内后立即给予光照，此时由于药物主要富集在血液中，同时可以利用血液中的氧气，在较低强度的白光为辅助照射下，破坏肿瘤血管，进一步破坏肿瘤组织，达到治疗肿瘤的目的；同时采用的光照强度弱，对正常的生物组织无明显的毒副作用。

2.本发明采用的技术方案可以使高度聚集于血管中的n-富勒烯氨基酸衍生物纳米粒子充分与血液中的氧气相互作用，从而产生高浓度的活性氧，该活性氧极具破坏性，能够迅速破坏血管表面的连接，进一步引起血管的坍塌，与此同时活性氧还可以进一步损伤肿瘤细胞，达到一石两鸟的作用，可以完全将肿瘤组织破坏，实现肿瘤的靶向治疗，极大地增加了肿瘤的治愈率；对于浅表性肿瘤具有非常好的治疗效果，可以通过加大剂量，来实现彻底治疗肿瘤的目的，也可以采用低剂量给药，通过多次给药治疗的方法来实现肿瘤的治疗。

3.本发明采用的光源为普通的光源，功率密度(小于100mw/cm²)在安全有效的强度范围内，不会对人体造成损伤，采用的装置操作简单，容易实施。

附图说明

图1是本发明实施例1中制得的n-金属富勒烯氨基酸纳米颗粒gd@c82(oh)13(nhch2ch2cooh)6(简称gd-ala)的粒径。

图2是本发明实施例1中制得的n-金属富勒烯氨基酸纳米颗粒gd-ala的表面电势分布。

图3是人脐静脉内皮细胞(huvec)施用实施例1中制得的n-金属富勒烯氨基酸纳米颗粒gd-ala、光照以及同时施用实施例1中制得的n-金属富勒烯氨基酸纳米颗粒gd-ala加光照处理后的细胞膜形态的变化对比。

图4分别在本发明实施例1中制得的n-金属富勒烯氨基酸纳米颗粒gd-ala、生理盐水不同条件下对小鼠肿瘤的治疗效果。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

gd@c82(oh)13(nhch2ch2cooh)6(简称gd-ala)的制备方法，步骤包括：将50mg的gd@c82(购自北京福纳康公司)置于100ml的单口烧瓶中，加入3.6g的丙氨酸和50ml质量分数为14％的氢氧化钠溶液，超声至混悬状态；80℃加热回流，反应至离心没有沉淀为止；将得到的反应溶液用无水乙醇洗涤两次，透析至导电率为1以下，收集浓缩，得到gd@c82(oh)13(nhch2ch2cooh)6。

将制备得到的gd@c82(oh)13(nhch2ch2cooh)6通过感应耦合等离子体质谱测得gd@c82(oh)13(nhch2ch2cooh)6(gd-ala)的浓度为100μg/ml。

实施例2

性质表征

使用马尔文激光粒度仪测试实施例1得到的稀释液，得到实施例1的稀释液的水合半径约为130纳米(如图1所示)，在ph值为7的水溶液中的表面电势约为-42mv(如图2所示)。

将浓度为100μg/ml的实施例1制得的gd-ala和质量百分比浓度为0.9％的生理盐水(saline)和浓度为10μmol/l的单线态氧的荧光检测试剂sosg共混，分别检测光照前后荧光强度的变化，用光照后的荧光强度比上光照前的荧光强度，结果是：gd-ala光照前的荧光强度为1.76×10⁶，光照后的荧光强度为1.07×10⁷，光照后荧光强度是光照前的6.08倍；而生理盐水光照前的荧光强度为1.82×10⁶，光照后的荧光强度为1.78×10⁶，光照后荧光强度是光照前的0.98倍(参见表1)。由此可知，可知gd-ala和sosg共混后光照后的荧光强度值是光照前荧光强度值的6倍，而对照组生理盐水的荧光强度值没有发生明显的变化，证明gd-ala在光照条件下的确产生了单线态氧。

表1gd-ala和生理盐水光照前后荧光强度的变化

实施例3

人脐静脉内皮细胞(huvec)施用gd-ala、光照以及同时施用gd-ala加光照处理后的细胞膜形态的变化

将huvec以5×10⁴个每毫升的浓度分别接种在三个共聚小皿中。其中，第一个小皿用不含有gd-ala的培养基孵育并给予光照，第二个仅与gd-ala孵育，第三个小皿用含有gd-ala的培养基孵育并给予光照，第一个和第三个小皿的光照条件相同，条件均为：光照强度为50mw/cm²，光照时间为20min，波长为400-700nm。之后，三个小皿用浓度为5μg/ml的细胞膜染料dii和浓度为5μg/ml的细胞核染料hoechst33324进行染色。其中，染细胞核是为了定位细胞，染细胞膜则是为了观察细胞膜的形态变化。

结构由图4可知，只光照的第一个小皿或者仅用gd-ala孵育的第二个小皿中的细胞经过染色后细胞膜均呈现出完整的状态，而经过gd-ala孵育后并给予光照经过染色后第三个小皿中的细胞几乎没有完整的细胞膜的状态，进一步证明细胞膜被破坏。因此，同时经过gd-ala和光照处理后的细胞膜发生了明显的破坏。

实施例4

本发明实施例1中制得的n-金属富勒烯氨基酸纳米颗粒gd-ala不同条件下对小鼠肿瘤的治疗效果

动物模型建立：将50ml密度为10⁶个/毫升的小鼠乳腺癌细胞(4t1)分别接种在25只balb/c裸鼠臀部右侧，接种7天后将小鼠随机分成a-e五组，每组5只小鼠，其中五组小鼠的平均肿瘤大小无显著差异。

分别对a-e组的小鼠进行如下治疗：

a组：按照10mg/kg静脉注射实施例1所得gd-ala稀释液200μl，只给一次药，施用后立即给予白光光照30min，波长为400-700nm的混合波段，光照强度为100mw/cm²；

b组：静脉注射质量百分比浓度为0.9％的生理盐水200μl，只给一次药，后立即给予白光光照30min，波长为400-700nm的混合波段，光照30min，光照强度为100mw/cm²；

c组：按照10mg/kg静脉注射实施例1所得gd-ala稀释液200μl，不进行光照，只给一次药；

d组：静脉注射质量百分比浓度为0.9％的生理盐水200μl，不进行光照，只给一次药；

e组：按照10mg/kg静脉注射实施例1所得gd-ala稀释液200μl，只给一次药，随后施加射频(200mhz，5mw)，治疗30min。

观察a-e组小鼠治疗前和治疗后第1天、第3天的小鼠肿瘤的变化情况，结果如图4所示：仅施用生理盐水的d组和仅施用实施例1的gd-ala稀释液的c组以及施用生理盐水和光照的b组中的小鼠乳腺癌细胞第1天和第3天相比治疗前几乎没有变化；同时施用实施例1的gd-ala稀释液和射频辐照进行治疗的f组，第1天小鼠乳腺癌细胞有较少部分被损坏，第3天有四分之一左右的小鼠乳腺癌细胞被损坏；而同时施用实施例1的gd-ala稀释液和光照的a组，第1天治疗后就有大部分的小鼠乳腺癌细胞被损坏，而第3天几乎所有的小鼠乳腺癌细胞均被损坏。

由此可知，施用生理盐水的同时加光照和不加光照的情况下，小鼠肿瘤均几乎没有破坏，肿瘤没有得到抑制；仅施用gd-ala的情况下，小鼠肿瘤均几乎没有破坏，肿瘤没有得到抑制；同时施用gd-ala和射频的情况下，小鼠肿瘤仅有部分遭到破坏，小鼠肿瘤没有得到明显抑制；而同时施用gd-ala和光照的情况下，小鼠肿瘤得到了非常明显的抑制，治疗效果远远好于金属富勒烯衍生物在能量为射频条件下时治疗小鼠肿瘤的效果，因此，n-富勒烯氨基酸衍生物纳米颗粒能够较好的用于制备治疗肿瘤的光动力治疗药物中。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。