ITCNs组装体负载抗肿瘤化合物的应用的制作方法

本发明涉及抗肿瘤化合物领域，具体涉及一种ITCNs组装体负载抗肿瘤化合物的应用。

背景技术：

近年来研究发现，肿瘤组织中含有多种基质细胞，如成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞等。这些基质细胞对于肿瘤的增殖、转移及血管增生起着非常重要的作用。其与肿瘤细胞、细胞因子、趋化因子等共同组成了肿瘤微环境。然而，针对肿瘤细胞的特异性受体或抗原进行的主动靶向药物递送系统，往往忽视了基质细胞与肿瘤细胞的异质性，以达到理想的抗肿瘤疗效。特别是在以肿瘤细胞为靶点的治疗中极易产生肿瘤多药耐药性，导致化疗的失败。相较基于肿瘤特异性受体靶向而言，基于肿瘤微环境靶向具有其特有的优势：1)可对肿瘤细胞及肿瘤基质细胞进行广泛的杀伤，对于肿瘤抑制具有更加全面的控制，减少其转移与增生。2)由于肿瘤基质细胞具有稳定的遗传背景，不易产生多药耐药性。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种ITCNs组装体负载抗肿瘤化合物能基于肿瘤的弱酸性环境脱PEG保护而将负载的抗肿瘤化合物靶向地送至肿瘤细胞，并可依赖于吲哚美辛逆转肿瘤多药耐药性，从而对已经耐受多种抗肿瘤化合物的细胞仍有良好的治疗效果，提升癌症患者的治疗效果，为抗肿瘤化合物的开发提供一种新的研究方向。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的：

本发明提出一种ITCNs组装体负载抗肿瘤化合物在制备抗肿瘤多药耐药细胞纳米制剂中的应用。

本发明ITCNs组装体负载抗肿瘤化合物的应用的有益效果是：通过制备得到的ITCNs组装体负载抗肿瘤化合物对于已经耐受多种抗肿瘤化合物的细胞仍有良好的治疗效果，提升癌症患者的治疗效果，为抗肿瘤化合物的开发提供一种新的研究方向。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明提供的ITCNS组装体负载抗肿瘤化合物体内过程示意图；

图2为本发明实施例1提供的负载紫杉醇的ITCNS组装体负载抗肿瘤化合物的透射电镜图；

图3为本发明实施例1提供的PTX ITCNs组装体在不同pH的缓冲液中的表面电荷变化；

图4为本发明实施例1提供的不同pH的培养基中A549/MDR细胞中PTX的浓度柱状图；

图5为本发明实施例1提供的PTX ITCNs组装体对A549/MDR细胞毒性的分析图；

图6为本发明实施例1提供的PTX ITCNs组装体的WB结果分析图；

图7为本发明实施例1提供的PTX ITCNs组装体的A549耐药细胞中ATP含量分析图；

图8为本发明实施例1提供的PTX ITCNs组装体的A549耐药细胞中还原型谷胱甘肽含量分析图；

图9为本发明实施例2提供的负载多烯紫杉醇的ITCNS组装体负载抗肿瘤化合物的透射电镜图；

图10为本发明实施例2提供的负载多烯紫杉醇的ITCNs组装体对MCF7/MDR细胞毒性的半数抑制率柱状图；

图11为本发明实施例3提供的负载阿霉素的ITCNS组装体负载抗肿瘤化合物的透射电镜图；

图12为本发明实施例3提供的负载阿霉素的ITCNs组装体对B16F10/MDR细胞毒性的半数抑制率柱状图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

在本发明的描述中，需要说明的是，术语“第一”、“第二”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

下面对本发明实施例的ITCNs组装体负载抗肿瘤化合物的应用进行具体说明。

首先，本发明实施例提供一种PEG-PEI，其结构式如下：

本发明实施例的PEG-PEI是聚乙二醇(PEG)通过酸敏感基团修饰的聚乙烯亚胺(PEI)，其分子量在1000-15,000Da。

具体，是将含有甲醛基团的聚乙二醇类化合物、聚乙烯亚胺和三甲氧基甲烷发生催化反应后制备得到。具体的反应式如下：

具体过程是：首先，将mPEG(MW:2,000,0.059g；0.194mmol)溶于5mL二氯甲烷，然后加入0.038g(0.053mmol)甲基磺酸氯与0.04g(0.21mmol)1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，常温搅拌下反应24h后，采用透析袋(MW：1000)透析24-96h后，制备得到甲基磺酸化甲氧基聚乙二醇。

然后，将甲基磺酸化甲氧基聚乙二醇溶于5mL甲醇/原甲酸三乙酯比例10/1的混合溶剂中，然后加入0.243g聚乙烯亚胺(0.0097mmol)后常温下搅拌48h。所得反应液采用透析袋(MW：3500)透析24-96h后，冻干后获得席夫碱链接的PEG-PEI共聚物。

本发明实施例还提供一种ITCNS组装体负载抗肿瘤化合物，其是吲哚美辛、抗肿瘤化合物和PEG-PEI通过非化学键构成的纳米微粒。

由上述可知，吲哚美辛与PEG-PEI之间氢键作用、静电作用、疏水作用及包合作用来构建超分子组装体，并通过吲哚美辛、PEG-PEI与抗肿瘤化合物之间的疏水作用将抗肿瘤化合物包被于超分子组装体内部形成具有核-壳结构的纳米微粒，其中核区域主要由吲哚美辛与抗肿瘤化合物及PEI内侧的氨基基团构成，是药物的负载微区；而亲水性的外壳主要由亲水性的PEG链组成，能够赋予纳米组装体良好的体外胶体稳定性及长循环性质。即吲哚美辛(IND)和PEG-PEI通过氢键作用、静电作用、疏水作用及包合作用超分子组装体后，将抗肿瘤化合物(如紫杉醇、阿霉素与多烯紫杉醇等)包被与超分子组装体内部形成具有核-壳结构的纳米微粒。

通过图1ITCNS组装体负载抗肿瘤化合物体内过程示意图可知，负载有抗肿瘤化合物的ITCNs注射后，首先通过EPR效应靶向分布至肿瘤部位,在肿瘤弱酸性的微环境下，由于PEG-PEI腙键的断裂，纳米粒表面发生快速变化，外壳主要由PEI链组成，从而形成阳离子的纳米粒表面而增强细胞摄取。另外，纳米粒被肿瘤细胞摄取后，在抗肿瘤化合物释药过程中，可同时释放具有MDR抑制作用的吲哚美辛从而抑制肿瘤细胞对胞内抗肿瘤药物的泵出作用，起到抑制肿瘤多药耐药性的作用。

ITCNS组装体负载抗肿瘤化合物是将所述吲哚美辛、抗肿瘤化合物和PEG-PEI与水溶性有机溶剂混合后，再进行透析得到的。

具体地制备过程是：将10mg的抗肿瘤化合物、IND与PEG-PEI共溶于1mL甲醇或其他水溶性有机溶剂(比如二甲基亚砜或二甲基甲酰胺)中，在搅拌或超声作用下混合，得到的混合液在水溶液中透析12-24h即可得到组装体水溶液。

本发明实施例还提出提供一种ITCNs组装体负载抗肿瘤化合物用以负载抗肿瘤化合物在肿瘤多药耐药细胞治疗中的应用。该肿瘤多药耐药细胞是指基于MRP-1蛋白质高表达的肿瘤细胞株。即ITCNs组装体负载抗肿瘤化合物对于只要是基于MRP-1蛋白质表达的肿瘤多药耐药细胞具有良好的治疗效果，不管该肿瘤细胞的来源。

进一步地，上述抗肿瘤化合物包括破坏DNA结构的化合物、二氢叶酸还原酶抑制剂类化合物、作用于核酸转录的化合物以及作用于有丝分裂M期干扰微管蛋白合成的化合物。

上述破坏DNA结构的化合物包括铂类化合物，铂类化合物包括顺铂、卡铂或者奥沙利铂；二氢叶酸还原酶抑制剂类化合物包括甲氨蝶呤或者培美曲塞；作用于核酸转录的化合物包括阿霉素、柔红霉素和表柔比星；作用于有丝分裂M期干扰微管蛋白合成的化合物包括紫杉醇类化合物和长春碱类化合物，紫杉醇类化合物包括紫杉醇和抗肿瘤化合物，长春碱类化合物包括长春花碱。

需要说明的是，与PEG-PEI和吲哚美辛作用形成ITCNs组装体负载抗肿瘤化合物的抗肿瘤化合物可选自现有的具有抗肿瘤化合物中的一个。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种PEG-PEI，其结构式如下：

本实施例提供一种PEG-PEI的制备方法：首先，将mPEG(MW:2,000,0.059g；0.194mmol)溶于5mL二氯甲烷，然后加入0.038g(0.053mmol)甲基磺酸氯与0.04g(0.21mmol)1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，常温搅拌下反应24h后，采用透析袋(MW：1000)透析24-96h后，制备得到甲基磺酸化甲氧基聚乙二醇。

然后，将甲基磺酸化甲氧基聚乙二醇溶于5mL甲醇/原甲酸三乙酯比例10/1的混合溶剂中，然后加入0.243g聚乙烯亚胺(0.0097mmol)后常温下搅拌48h。所得反应液采用透析袋(MW：3500)透析24-96h后，冻干后获得席夫碱链接的PEG-PEI共聚物。

本实施例提供一种负载紫杉醇的ITCNS组装体负载抗肿瘤化合物(PTX ITCNs)。

本实施例提供一种负载紫杉醇的ITCNS组装体负载抗肿瘤化合物的制备方法：将10mg的PTX、IND与PEG-PEI共溶于1mL甲醇或其他水溶性有机溶剂(比如二甲基亚砜或二甲基甲酰胺)中，在搅拌或超声作用下混合，得到的混合液在水溶液中透析12-24h即可得到组装体水溶液。图2为其透射电镜图。

本实施例还提供一种负载紫杉醇的ITCNs组装体负载抗肿瘤化合物酸敏感性评价：将细胞培养基调节到pH6.5和pH7.4等不同pH值后，将PTX ITCNs组装体加入到培养基，与A549耐药细胞株一起孵育2小时后，裂解细胞后，采用叔丁基甲醚提取紫杉醇，采用液相质谱测定紫杉醇的浓度。具体结果参见图3-PTX ITCNs在不同pH的缓冲液中的表面电荷变化和图4-PTX在不同pH的缓冲液中的浓度。

根据图3可知，由于酸性环境下，腙键的断裂，纳米粒表面PEG脱落，导致纳米粒表面电荷大幅提升。

根据图4可知，PTX ITCNs在酸性培养基中，细胞对紫杉醇的摄取量得以大幅提升。PTX ITCN是在酸性培养基中的IC50值为34.21±4.461μg/mL,远低于其在正常培养基中的IC50值(142.5±8.214)。

本实施例还提一种PTX ITCNs组装体负载抗肿瘤化合物对耐药细胞细胞毒性的评价，选择耐药株(人肺癌细胞,A549)进行的肿瘤多药耐药性评价。共设置空白、紫杉醇注射液(Taxol)、紫杉醇+吲哚美辛(Taxol+IND)、负载紫杉醇的熊去氧胆酸纳米粒(PTX UTCNs)、ITCNs(PTX ITCNs)组装体5组，将药物与细胞共同孵育24h后，采用CCK8方法测定细胞毒性。具体结果参见图5。

根据图5，到PTX ITCNs，相较于其他组，可有效的杀灭肿瘤细胞。

本实施例还提一种PTX ITCNS组装体负载抗肿瘤化合物抗肿瘤多药耐药性评价：

选择肿瘤细胞耐药株(人肺癌耐药细胞,A549/MDR)与非耐药株(人肺癌细胞,A549)进行的肿瘤多药耐药性评价。共设置空白、紫杉醇注射液(Taxol)、紫杉醇+吲哚美辛(Taxol+IND)、负载紫杉醇的熊去氧胆酸纳米粒(PTX UTCNs)、ITCNs(PTX ITCNs)组装体5组，将药物与细胞共同孵育24h后，采用Western-blot方法测定Taxol、Taxol+IND、PTX UTCNs、ITCNs组装体对A549耐药株细胞内COX-2与MPR1耐药相关蛋白表达的影响。并检测细胞内的ATP含量和还原型谷胱甘肽含量。检测结果参见图6-图8。

根据图6可知，根据WB结果显示PTX ITCNs组装体负载抗肿瘤化合物对耐受顺铂和紫杉醇的A549有良好抑制效果。

同时，根据图7可知，PTX ITCNs组装体负载抗肿瘤化合物能够明显降低耐受顺铂和紫杉醇的A549细胞中ATP含量。

同时，根据图8可知，PTX ITCNs组装体负载抗肿瘤化合物能够明显提升耐受顺铂和紫杉醇的A549细胞中还原型谷胱甘肽(GSH)含量。

综上所述，PTX ITCNS组装体负载抗肿瘤化合物能够对同时耐受两种肿瘤药物的癌症患者有良好的治疗效果。

综上所述，PTX ITCNS组装体负载抗肿瘤化合物对多药耐药肿瘤细胞具有良好的治疗效果，并具有对肿瘤微环境中低pH环境具有良好的响应性。

实施例2

本实施例采用的ITCNs组装体负载抗肿瘤化合物抗肿瘤多药耐药性评价的方法和基本步骤与实施例1基本一致，不同点在于，所负载的抗肿瘤化合物为多烯紫杉醇(DTX)。本实施例采用的肿瘤细胞株是人乳腺癌耐药细胞，MCF7/MDR。

本实施例提供一种负载多烯紫杉醇的ITCNs组装体负载抗肿瘤化合物(DTX ITCNs)的制备方法：将10mg的DTX、IND与PEG-PEI共溶于1mL甲醇或其他水溶性有机溶剂(比如二甲基亚砜或二甲基甲酰胺)中，在搅拌或超声作用下混合，得到的混合液在水溶液中透析12-24h即可得到组装体水溶液。图9为其透射电镜图。

本实施例的检测结果参见图10。根据图10可知，根据细胞毒性实验结果显示负载多烯紫杉醇的ITCNs组装体负载抗肿瘤化合物对人乳腺癌耐药细胞，MCF7/MDR有良好抑制效果。

实施例3

本实施例采用的ITCNs自组装体抗肿瘤多药耐药性评价的方法和基本步骤与实施例1基本一致，不同点在于，所负载的抗肿瘤化合物为阿霉素(DOX)。本实施例采用的是人黑色素瘤细胞株B16F10耐药细胞株与敏感株。

本实施例提供一种负载阿霉素的ITCNs自组装体(DOX ITCNs)的制备方法：将10mg的DOX、IND与PEG-PEI共溶于1mL甲醇或其他水溶性有机溶剂(比如二甲基亚砜或二甲基甲酰胺)中，在搅拌或超声作用下混合，得到的混合液在水溶液中透析12-24h即可得到组装体水溶液。图11为其透射电镜图。

本实施例的检测结果参见图12。根据图12可知，根据细胞毒性实验结果显示负载阿霉素的ITCNs组装体负载抗肿瘤化合物对人黑色素瘤细胞株B16F10耐药细胞株有良好抑制效果。

综上所述，本发明实施例可通过简单的透析法制备得到的负载不同抗肿瘤化合物的ITCNs自组装体，该ITCNs组装体负载抗肿瘤化合物能基于肿瘤的弱酸性环境脱除PEG保护而将负载的抗肿瘤化合物靶向地送至肿瘤细胞，并可依赖于吲哚美辛逆转肿瘤多药耐药性，从而对多种多药耐药肿瘤细胞仍有良好的治疗效果，提升癌症患者的治疗效果，为抗肿瘤化合物的开发提供一种新的研究方向。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。