本发明涉及一种盐酸奈康唑的药物组合物，具体地说涉及一种以西吡氯铵和盐酸奈康唑的药物组合物及其在制备治疗眼部真菌感染药物中的用途。
背景技术：
真菌性角膜炎(Fungal keratitis，FK)是一种严重致盲的眼病，近年来其发病率呈逐年上升趋势。迄今全球发现70余种真菌可引起角膜感染，主要致病菌多集中于镰刀菌属，曲霉菌属和白念珠菌。目前临床上对于真菌感染特别是眼部真菌性角膜炎的治疗主要以药物治疗为主，但仍缺乏低毒、高效、价廉的治疗药物，使其治疗成为临床上相当棘手的问题。药物联合应用成为治疗真菌性角膜炎的一个发展方向。目前尚未见盐酸奈康唑和西吡氯铵联合用药对真菌性角膜炎致病菌的研究。
盐酸奈康唑是一种新型咪唑类抗真菌药物，具有抑菌和杀菌双重功效。其抗菌谱广，对酵母样真菌、皮肤癣菌、花斑癣菌、着色真菌以及其他丝状真菌具有广谱抗菌作用；对光滑假丝酵母、毛癣菌属、小孢子菌属以及适应症外的着色真菌属、曲霉菌属均具有强抗菌活性。其中对光滑假丝酵母及皮肤癣菌(特别是红色毛癣菌、须癣毛癣菌)、犬小孢子菌、石膏样小孢子菌、絮状表皮癣菌的抗真菌作用比克霉唑及联苯苄唑强。可蓄积于皮肤角质层，长时间持续发挥药效，1天1次用药，患者依从性高。盐酸奈康唑由日本SS制药公司研制开发，1993年首先在日本上市。临床用于治疗皮肤癣菌病(足癣、体癣、股癣)、皮肤念珠菌病(指趾间糜烂、间擦疹)、花斑癣。该药物通过两种途径发挥其对敏感真菌的杀菌和抑菌双重作用:1.直接损伤真菌细胞膜；2.抑制真菌细胞构成成分麦角甾醇合成西吡氯铵，化学名称为1－氯化十六烷基吡啶的一水合物，为阳离子季铵化合物，作为表面活性剂，主要通过降低表面张力而抑制和杀灭细菌。体外试验结果提示西吡氯铵对多种致病菌和非致病菌有抑制和杀灭作用。动物试验结果表明西吡氯铵对口腔粘膜无明显刺激性。
中国专利申请200910045463.9公开了一种包含二氧化氯、西吡氯铵和锌离子的复方漱口水组合物及其制备方法，该复方药物组合物的优点是对口腔粘膜刺激性小，可长效抑制口气。中国专利02117618.3公开了一种应用于眼科真菌感染的治疗用氟康唑滴眼液，但其缺点在于抗菌谱窄，药物的治疗有效浓度相对较高，对眼部皮肤刺激性大。
目前临床上对于真菌感染特别是眼部真菌性角膜炎的治疗主要以药物治疗为主，但仍缺乏低毒、高效、价廉的治疗药物，使其治疗成为临床上相当棘手的问题，开发一种副作用更小，抑菌浓度更低，疗效确切的药物成为真菌性角膜炎治疗领域是迫切需要的，本发明人创造性的将西吡氯铵和盐酸奈康唑制备成药物组合物形式用于真菌感染的治疗取得了令人惊喜的治疗效果，该药物组合物具有十分广阔的临床应用前景。目前尚未见以盐酸奈康唑和西吡氯铵为药物有效成分的药物组合物及其对真菌感染疾病特别是真菌性角膜炎致病菌有确切治疗的报道。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种盐酸奈康唑的药物组合物，该药物组合物具有很好的抗真菌作用，以为相关医生和患者提供更好的选择。本发明人通过研究盐酸奈康唑和西吡氯铵对真菌性角膜炎致病菌体外联合药敏试验中的相互作用，首次发现西吡氯铵和盐酸奈康唑联合用药不但使每种成分的治疗有效剂量与单剂量用药相比大大减少，并具有抗真菌能力显著增强的作用。主要表现为：
(1)由于西吡氯铵和盐酸奈康唑的药物作用机制不同，两种药物的药物作用机制的互补，从而使抗真菌效果显著增强。实施例8证明了西吡氯铵和盐酸奈康唑药物联用或制备成组合物形式用于抗真菌感染时取得了显著的协同作用，在保证抗真菌效果的前提下，两种药物成分相对于单药用药组剂量大大减少。
(2)盐酸奈康唑减轻了西吡氯铵引起的过敏反应和色素沉着现象，从而增强了用药依从性。
(3)西吡氯铵增加了盐酸奈康唑制剂特别是液体制剂的稳定性，使组合物的抗真菌效果能够维持更长时间。
(4)西吡氯铵和盐酸奈康唑联合用药使药物的抗真菌谱更广，且更长效。
因此，本发明提供一种盐酸奈康唑的药物组合物，其药物活性成分为西吡氯铵和盐酸奈康唑。
上述药物组合物中，西吡氯铵和盐酸奈康唑的重量比为1：0.1～1000，优选为1：10～100，进一步优选为1：20～70，更优选为1：20。
本发明所述的药物组合物可以制备成合适的剂型，用于抗真菌感染的治疗。本发明药物组合物还可以含有制剂工艺上可接受的辅料赋形剂制备成合适的用药剂型。本发明的药物组合物剂型可以为口服药物剂型或注射药物剂型。口服药物剂型可以为片剂、缓控释片剂、胶囊剂、口服液等。所属片剂含有一种或多种如下辅料：淀粉、糊精、低取代羟丙基纤维素、硬脂酸镁，微晶纤维素，羟丙基纤维素，淀粉浆乳糖、甘露醇、微粉硅胶、交联羧甲基纤维素钠、交联聚乙烯吡咯烷酮。所述胶囊剂或颗粒剂含有一种或多种如下辅料：可压性淀粉、乳糖、低取代羟丙基纤维素、微晶纤维素、微粉硅胶。所述缓释剂或控释剂含有一种或多种如下辅料：可压性淀粉、乳糖、低取代羟丙基纤维素、微晶纤维素、微粉硅胶、卡波姆，海藻酸钠、海藻酸钙，甲壳素。注射药物剂型可以为粉针剂或注射液形式。
本发明的药物组合物制剂优选为液体制剂或半固体药物制剂，液体制剂优选为滴眼液、漱口液。按照本发明所述药物组合物制备的液体药物制剂中，每一制剂单位中1mL药物中含有西吡氯铵的有效量为0.1mg-10mg，含有盐酸奈康唑的有效量为0.1mg-50mg。
本发明的另一目的是公开本发明药物组合物在制备治疗抗真菌感染药物中的用途。本发明药物组合物尤其对真菌性角膜炎的治疗有效。本发明实施例9表明本发明药物组合物对真菌性角膜炎有色兔模型的治疗与单药治疗组相比，治疗有效率大大提高，病情控制时间和治愈时间大大减少。
具体实施方式
以下通过具体实施例来进一步说明本发明的内容，下述实施例仅用于说明本发明的发明内容，而不依任何方式限定本发明。在不背离权利要求书的前提下，本领域技术人员对本发明各个方面的修改，均属于本发明保护范围。
实施例1盐酸奈康唑西吡氯铵滴眼液
制备方法：称取处方量的盐酸奈康唑和西吡氯铵，与丙二醇搅拌混合，使之分散均匀；加适量注射用水，使其充分溶解得均一稳定溶液；另取苯扎溴铵，加水溶解后加入到上述溶液中，搅拌均匀；补水至全量后过滤，加热灭菌，分装即得。
实施例2盐酸奈康唑西吡氯铵漱口液
制备方法：称取处方量的盐酸奈康唑和西吡氯铵，与丙二醇搅拌混合，使之分散均匀；加适量注射用水，使其充分溶解得均一稳定溶液；另取苯扎溴铵，加水溶解后加入到上述溶液中，搅拌均匀；补水至全量后过滤，加热灭菌，分装即得。
实施例3盐酸奈康唑西吡氯铵凝胶剂
制备工艺：将卡波姆缓慢加入到处方量50％左右的水中，边加边搅拌直至形成透明的凝胶基质，将盐酸奈康唑、西吡氯铵溶于适量水中，再加入基质中，搅拌均匀，加入丙二醇、甘油、纯化水至全量，三乙醇胺调节PH值至中性，即得。
实施例4盐酸奈康唑西吡氯铵滴眼液
制备工艺：将卡波姆缓慢加入到处方量50％左右的水中，边加边搅拌直至形成透明的凝胶基质，将盐酸奈康唑、西吡氯铵溶于适量水中，再加入基质中，搅拌均匀，加入丙二醇、甘油、纯化水至全量，三乙醇胺调节PH值至中性，即得。
实施例5盐酸奈康唑西吡氯铵乳膏剂
制备工艺：按处方量取单硬脂酸甘油酯、硬脂酸、白凡士林、三乙醇胺水浴加热至熔化，混匀，作为油相。另外取适量的纯化水，将盐酸奈康唑、西吡氯铵溶解到水中。取甘油、十二烷基硫酸钠、纯化水、尼泊金乙脂混合加热至80℃左右，作为水相。待油相温度为80℃左右时，搅拌下将盐酸奈康唑、西吡氯铵溶液加入其中，并使温度保持在80℃左右。将搅拌均匀后的油相，在慢速搅拌下，缓缓加入水相中，后加速搅拌30分钟，停止搅拌，即得乳膏。
实施例6盐酸奈康唑西吡氯铵片剂
制备工艺：将盐酸奈康唑、西吡氯铵和辅料微晶纤维素、羧甲基淀粉钠混合均匀，加入适量的淀粉浆制软材，然过16目筛制粒。湿颗粒在60℃干燥，干颗粒过16目筛整粒，筛出干粒中的细粉，与硬脂酸镁混匀，然后再与干颗粒混匀，压片，即得。
实施例7盐酸奈康唑西吡氯铵药物组合物抑菌浓度的测定
1材料与方法
1.1.受试菌株
白念珠菌ATCC32354、白念珠菌CMCC C1a、黄曲霉CMCC A2、烟曲霉CMCCA1、茄病镰刀菌CMCC B24。以上菌株均购买于中国医学科学院皮肤病研究所真菌保藏中心。
1.2供试药品
盐酸奈康唑(盐酸奈康唑)：扬子江海瑞药业有限公司提供，批号：012060805；西吡氯铵(西吡氯铵)：扬子江海瑞药业有限公司提供，批号：CPD0708001。将上述两种药物用蒸馏水溶解配制成1280μg/ml的供试药液，0.22μmm滤膜过滤，分装至无菌聚丙烯小管，小心密封后置﹣20℃贮存备用。
1.3培养基
改良沙堡固体培养基(SDA)、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)及RPMI1640液体培养基。
1.4主要试剂和器材
RPMI 1640粉(Gibco)、MOPS(Sigma)、96孔细胞培养板(Biofil)、麦氏比浊管、UV-2000紫外分光光度计(Unico)、MK3酶标仪(Thermo)、BHC-1300ⅡA/B3生物安全柜(Airtech)。
1.5方法
1.5.1白念珠菌菌悬液的制备
将白念珠菌ATCC32354和白念珠菌CMCC C1a两受试菌株接种在SDA培养基上，置35℃，传代培养。挑取生长24h直径1mm左右的菌落3～5个，悬浮于5ml 0.9％无菌生理盐水中，利用麦氏比浊管调整其浊度达到0.5麦氏标准。取此菌悬液用RPMI 1640培养基进行1：20稀释后，再行1：50稀释作为待接种物，此时菌悬液浓度为1×103～5×103CFU/ml。
1.5.2丝状真菌菌悬液的制备
将黄曲霉CMCCA2和烟曲霉CMCCA1两受试菌株接种于PDA培养基上，35℃温育7d；将茄病镰刀菌CMCC B24先在35℃温育72h，再将平板移到26℃继续温育至第7d。在孵育7d的菌落上滴加0.9％无菌生理盐水1ml，制备悬液。利用UV-2000紫外分光光度计在605nm测定孢子悬液吸光度(A)；黄曲霉和烟曲霉调整A为0.09～0.11；茄病镰刀菌A值调至0.15～0.17。制备的菌悬液用RPMI 1640培养基1：50稀释后作为待接种物。
1.5.4抗真菌药敏试验
用RPMI 1640培养基对﹣20℃贮存的药品供试液进行2倍稀释，然后将药物加入96孔细胞培养板内。首行(首列)第一孔作为阴性对照，第12列为阳性对照，余为两药单独及联合时的2倍药物终浓度(μg/ml)。其中第一行的2～11孔和第一列的2～8孔为单独用药的倍比稀释液100μl，其余孔为两药联合时的倍比稀释液各50μl。接种时除阴性对照孔外其余各孔均加入100μl的菌悬液，35℃孵育48h后利用MK3酶标仪进行结果判读。
1.5.5最低抑菌浓度(MIC)的判定
单独及联合用药时两药的MIC终点为：与生长对照孔比较100％的生长抑制。
1.5.6联合用药效果评价
采用非参数法即分数抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index，FIC)来对联合用药效果进行评价。FIC即联合用药时各药的最低抑菌浓度分别除以各药单用时MIC值的商之和，表示为FIC＝MICA联合/MICA单独+MICB联合/MICB单独。当FIC≤0.5时为协同作用；0.5＜FIC≤1时为相加作用；1＜FIC≤2时为无关作用；当FIC＞2时为拮抗作用。
2结果与分析
表1盐酸奈康唑和西吡氯铵抗真菌MIC测定结果
盐酸奈康唑和西吡氯铵抗真菌试验结果见表1。单一药物的MIC结果表明，盐酸奈康唑和西吡氯铵对白念珠菌ATCC32354和CMCC C1a两菌株均具有较强的抗菌能力。并且盐酸奈康唑和西吡氯铵也对茄病镰刀菌表现出较强的抗菌能力。但是盐酸奈康唑对黄曲霉和烟曲霉的MIC仅为160和320μg/ml，抗菌能力明显弱于西吡氯铵，这与文献报道一致。联合药敏MIC结果表明，两者联用对白念珠菌CMCC C1a和烟曲霉CMCCA1呈现协同作用，对白念珠菌ATCC32354、黄曲霉CMCC A2及茄病镰刀菌CMCC B24呈现出相加作用，此结果显示出两药联用能够明显提高抗真菌性能。
盐酸奈康唑属吡咯类抗真菌药，高度选择性干扰真菌细胞色素P-450的活性，抑制真菌细胞膜上麦角固醇的生物合成，使细胞膜通透性增加，影响真菌生长繁殖，导致真菌死亡；西吡氯铵是一种阳离子表面活性剂，通过降低表面张力的作用使细菌、真菌和病毒失活，这是一种物理反应，与盐酸奈康唑的药理作用迥然不同。体外药敏试验未发现二药有拮抗作用而主要表现为协同和相加作用，故推测二药联合治疗眼部真菌感染具有良好的临床治疗价值，既可以提高疗效，减少耐药菌的发生，又可以防止病原细菌对真菌性角膜炎患者的感染，但尚需临床研究进一步证实。
实施例8药物组合物对兔真菌性角膜炎模型的治疗作用
镰刀菌和曲霉菌是多数国家和地区主要的角膜致病真菌，因此本实验以最具有代表性的曲霉菌作为真菌性角膜炎的致病菌为例说明药物组合物对真菌性角膜炎的治疗作用。其他致病真菌的实验造模与其相同。
8.1实验动物及模型建立
健康成年有色兔80只，体质量2.0～2.5kg，雌雄兼用(扬子江海瑞药业药理中心提供),使用前裂隙灯显微镜检查，证实无眼前节病。
实验前3d给予妥布霉素眼液点眼4次/d,将24只兔右眼作为模型眼，左眼为对照眼。皮下注射速眠新Ⅱ0.2mL/kg进行全身麻醉，10g/L地卡因液结膜囊表面麻醉，然后用5mL/L庆大霉素溶液冲洗右结膜囊，用Φ5mm环钻在角膜中央划痕，用15号无菌手术刀轻轻刮除划痕中的角膜上皮.取制备好的角膜植片从内皮面作“#”形划痕，用10-0尼龙缝线放射状间断缝合8针将其固定于刮除上皮的角膜上.用注射器抽取0.1mL曲霉菌混悬液(浓度为106个孢子/L)，将其注入右眼的植片与植床角膜层间的中央，结膜囊涂红霉素眼膏，3-0丝线缝和上下眼睑.左眼与右眼制作方法相同，植片与植床角膜层间注入0.1mL生理盐水作对照。3d后拆除眼睑缝线，去除角膜植片，观察有色兔角膜情况，妥布霉素眼液点眼，4次/d。
分别在菌株接种后的第3，7，10日作裂隙灯显微镜查、角膜刮片检查、角膜共焦显微镜(日本NIDEK公司confoscan 3)检查、角膜病理切片检查，并用沙保氏培养基培养。三次裂隙灯检查发现65只有色兔眼一次接种成功，3日内可观察到浅层角膜真菌病变，结膜囊有黄白色分泌物，基质混浊水肿，前房无积脓，虹膜无新生血管。将未一次成功接种的15有色兔重新接种。第7日，可见明显溃疡灶，前房可见积脓，角膜虹膜可见新生血管。第二次接种成功10只。两次合并共有75只有色兔成功造模真菌性角膜炎成功，造膜成功率93.75％。
8.2分组及给药
选取造模成功的有色兔72只，随机分成6个治疗组。
盐酸奈康唑组：每100mL药液中含有盐酸奈康唑500mg
西吡氯铵组：每100mL药液中含有西吡氯铵25mg
复方一组：每100mL药液中含有盐酸奈康唑10mg和西吡氯铵100mg
复方二组：每100mL药液中含有盐酸奈康唑100mg和西吡氯铵2mg
复方三组：每100mL药液中含有盐酸奈康唑500mg和西吡氯铵0.5mg
阳性对照药纳他霉素组：每100mL药液中含有纳他霉素5mg
各给药组均滴眼给药，每日分早中晚分别给药三次，每次1mL，连续给药50天。
8.3实验结果
观察各给药组有色兔右眼状况，并与左眼进行对照，评价药物的治疗情况。各给药组对曲霉菌致真菌性角膜炎有色兔模型的治疗结果如表2所示。其中相关术语解释如下：
病情控制时间：为从开始给药到病情得到控制的时间。病情得到控制表现为溃疡部分不蔓延或减小，积脓减少或消失。
药物无效率：用药后病情加重或病情没有得到控制。
治愈：积脓消失，溃疡愈合。
表2复方对曲霉菌致真菌性角膜炎有色兔模型的治疗效果
与盐酸奈康唑组相比，##P＜0.01；与西吡氯铵组相比，*P＜0.01；
与纳他霉素组相比，&P＜0.05.
由以上治疗结果可以看出，复方组在治疗由曲霉菌引起的真菌性角膜炎的治疗效果不但显著的由于阳性对照药那他霉素组，也显著的优于盐酸奈康唑组和西吡氯铵组，表明盐酸奈康唑和西吡氯铵在治疗真菌性角膜炎时有显著的协同作用，包含盐酸奈康唑和西吡氯按药物成分的药物组合物在治疗真菌性结膜炎方面也显著优于市场常用药那他霉素，因此具有十分广阔的应用前景。
按照实施例8中的造膜方法制作镰刀菌引发的真菌性角膜炎有色兔模型，复方组治疗效果也显著优于盐酸奈康唑单药组和西吡氯铵单药组，西吡氯铵和盐酸奈康唑在治疗真菌性角膜炎方面体现出显著的协同作用。