本发明属于放射性药物及核医学领域，具体涉及一种her2亲合体的68ga标记物及其制备方法、应用。
背景技术：
人表皮生长因子受体2(humanepidermalgrowthfactorreceptor2，her2)，是一种分子质量为185kda的跨膜糖蛋白，在调节细胞增殖、分化和生存等过程中发挥着重要作用。her2在多种肿瘤如乳腺癌，上皮性卵巢癌，结直肠癌，膀胱癌，非小细胞肺癌，前列腺癌和胰腺癌等组织中呈现过度表达，而在正常组织呈现低表达。因此，her2已成为肿瘤诊治的重要靶标。
临床上对her2表达检测一般采用取活检标本进行病理学检查的方法。虽然病理活检是评价her2表达的金指标，但是这种有创性的检查不能作为肿瘤疗效评价的常规检查而多次进行，活检的局部情况不能反映肿瘤的整体情况，缺乏时效性和全面性。常规解剖学影像如ct和mri可以确定肿瘤边界，但无法测定肿瘤her2表达。因此，对her2的表达检测需要一种特异和动态的体内评价方法。
正电子发射断层扫描(pet)作为21世纪生物医学研究和临床诊断的尖端技术，被称为“活体生化显像”技术，可以从体外无创、定量、动态地观察人体内的生理、生化变化，洞察标记药物在正常人或病人体内的活动，在疾病早期诊断、疗效判断以及疾病发生和发展的生物学特性研究等方面有重要作用。特异性探针是pet监测靶分子水平的关键，64cu/89zr标记的单克隆抗体如赫赛汀等虽可与her2结合，但其在血液中清除慢且组织渗透低，注射后数天甚至数周才能获得对比度满意的图像，实际应用具有较大的局限性。
亲和体(affibody)又称“人工抗体”，是一类基于非免疫蛋白亲和配体的新型支架蛋白，与抗体相比具有合成便捷、靶点选择性、亲和性高和组织渗透力强，可快速浓聚于靶部位，且在血液中清除快等优点，在疾病的诊疗等相关生物医学领域应用前景广阔。
zher2：342是通过对成熟的亲合体系列进行定点变异而筛选得到的第二代亲合体，亲和力较第一代显著提高。其与her2具有特异性的结合能力，是her2探针的理想载体。gabrielakramer-marek等制备了18f-fbem-cys-zher2：342并用于临床前研究，[kramer-marekg,etal,eurjnuclmedmolimaging.2008；35(5):1008-18.]结果表明，her2阳性肿瘤对18f-fbem-cys-zher2：342高度摄取，但需要两次hplc纯化，合成时间约3小时，制备工艺繁琐，效率低，同时存在肝肠摄取过高等多种因素制约了其在临床上的广泛应用。此前，有人提出对cys-zher2：342进行修饰，引入亲水性连接剂gggrdn改善药代动力学性能，同时耦合双功能螯合剂mal-nota制得标记前体nota-mal-cys-ggggrdn-zher2：342(简写为nota-mal-mzher2)，然后采用一步法制得18f-al-nota-mal-mzher2。临床前实验表明，该探针与her2高度亲和且腹部本底显影低，显像性能较满意([xuyetal,jcancer.2017；8(7):1170-1178])。然而由于18f需由加速器制备，价格昂贵，更重要的是采用18f-al标记nota-mal-mzher2，产率较低(约10％)，不利于18f-al-nota-mal-mzher2的推广应用。同时，18f-al-nota-mal-mzher2作为pet显像剂用时图像分辨率低。在此基础上，本发明提供一种一步法制备68ga标记her2探针，以解决成本高、标记率低和显像性能差的问题，有望在临床上得以推广应用。
技术实现要素：
因此，本发明要解决的技术问题在于现有的18f-al标记nota-mal-mzher2的显像剂成本高、标记率低和显像性能差，进而提供成本低、标记率高和显像性能强一种her2亲合体的68ga标记物及其制备方法、应用。
为此，本发明提供了一种her2亲合体的68ga标记物，具有如下所示的结构：68ga-nota-mal-mzher2。
本发明提供了一种制备所述的her2亲合体的68ga标记物的方法，采用68ga标记nota-mal-mzher2。
所述的方法，包括如下步骤：nota-mal-mzher2经缓冲液溶解后，加入新鲜淋洗的68ga溶液，在密闭条件下于80-120℃下反应8-12分钟，然后将所得反应液进行冷却、分离、纯化，即得。
所述的方法，包括如下步骤：nota-mal-mzher2经缓冲液溶解后，加入新鲜淋洗的68ga溶液，在密闭条件下于100℃下反应10分钟，然后将所得反应液进行冷却、分离、纯化，即得。
所述的方法，所述缓冲液为醋酸钠溶液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)溶液或碳酸钠溶液；所述缓冲液的ph值为7-10。
所述的方法，取nota-mal-mzher2的冻干粉50-1000μg加入浓度为0.1～1m、体积为100-2000μl的缓冲液中溶解。
所述的方法，取nota-mal-mzher2的冻干粉80-200μg加入浓度为0.2～0.5m、体积为200-1000μl醋酸钠溶液中溶解。。
所述的方法，所述nota-mal-mzher2的冻干粉为白色粉末状。
所述的方法，所述68ga溶液为1-20mci。
所述的方法，所述68ga溶液为采用1-4ml的0.01-1m盐酸新鲜淋洗得到的。
所述的her2亲合体的68ga标记物或所述的制备方法制备得到的her2亲合体的68ga标记物在制备pet显像剂中的应用。
本发明提供了一种显像剂，包括所述的her2亲合体的68ga标记物或所述的制备方法制备得到的her2亲合体的68ga标记物。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供了一种her2亲合体的68ga标记物，具有如下所示的结构：68ga-nota-mal-mzher2，所述68ga-nota-mal-mzher2在作为pet显像剂时，具有较高的摄取、靶/非靶比值及良好的药代动力学特点，生物性能优良，完全可以满足肿瘤her2受体pet显像剂的要求，具有较高的图像分辨率，显像特异性高，可实现良好的显像效果。
2.本发明一种制备权利要求1所述的her2亲合体的68ga标记物的方法，步骤简单易行，且标记结果直观准确。经实验表明，本发明的标记方法，具有较高的产率(～80％)和放化纯(95％)。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明中68ga-nota-mal-mzher2化学结构图；
图2是本发明实施例5中68ga-nota-mal-mzher2的hplc图；
图3是本发明对比例1中68ga-nota-mal-mzher2的hplc图；
图4是本发明实验例1中68ga-nota-mal-mzher2在pbs中的稳定性结果图；
图5是本发明实验例2中68ga-nota-mal-mzher2在skov-3移植瘤模型鼠体内pet显像图；
图6是本发明实验例2中skov-3移植瘤模型鼠体内肝、肾和肌肉对68ga-nota-mal-mzher2的定量摄取值柱形图(rois用平均％id/g±sd表示)；
图7是本发明实验例2中68ga-nota-mal-mzher2在bt474移植瘤模型鼠体内pet显像图；
图8是本发明实验例2中bt474移植瘤模型鼠体内肝、肾和肌肉对68ga-nota-mal-mzher2的定量摄取值柱形图(rois用平均％id/g±sd表示)。
具体实施方式
下述实施例中涉及的试剂均为市售产品。
nota-mal-mzher2的制备方法(具体可参见xuyetal,jcancer.2017；8(7):1170-1178或《亲水基因修饰抗her2亲合体的～(18)氟定点标记及在her2过表达胃癌中的示踪作用》)如下：
取加入2ml的3mg(0.4μmol)mzher2的0.2m乙酸胺溶液中加入100μl的含有260μg(0.60μmol)mal-nota的0.2m乙酸胺溶液。室温反应1小时后，使用制备型hplc纯化，冻干后得到白色粉末nota-mal-mzher2。hplc检测产品纯度>95％。
实施例1
本实施例提供了一种制备her2亲合体的68ga标记物的方法，包括如下步骤：
取nota-mal-mzher2的冻干粉50μg加入ph值为7.5、浓度为1m(1m＝1mol/l)、体积为100μl的醋酸钠溶液中溶解，待溶解后，加入采用1ml的1m盐酸溶液新鲜淋洗得到的68ga溶液1mci，在密闭条件下于120℃下反应8分钟，然后将所得反应液进行冷却，加入水稀释并注入c18分离小柱(安捷伦、varianbondelutc18,100mg,1ml厂家、型号)，用ph值为7的pbs缓冲液冲洗柱子，然后用0.5ml的10mm乙醇溶液洗脱标记产物，用生理盐水(质量浓度为0.9％)稀释后无菌过滤即得68ga-nota-mal-mzher2，产率为80±3％(产率(％)＝标记产物放射性活度/初始放射性活度×100％)；所述的68ga-nota-mal-mzher2化学结构图如图1所示。
实施例2
本实施例提供了一种制备her2亲合体的68ga标记物的方法，包括如下步骤：
取nota-mal-mzher2的冻干粉1000μg加入ph值为7、浓度为0.1m、体积为2000μl的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)溶液中溶解，待溶解后，加入采用4ml的0.01m盐酸溶液新鲜淋洗得到的68ga溶液20mci，在密闭条件下于80℃下反应12分钟，然后将所得反应液进行冷却，加入水稀释并注入c18分离小柱，用ph值为7的pbs缓冲液冲洗柱子，然后用0.8ml的8mm乙醇溶液洗脱标记产物，用生理盐水(质量浓度为0.9％)稀释后无菌过滤即得68ga-nota-mal-mzher2，产率为81±3％；所述的68ga-nota-mal-mzher2化学结构图如图1所示。
实施例3
本实施例提供了一种制备her2亲合体的68ga标记物的方法，包括如下步骤：
取nota-mal-mzher2的冻干粉80μg加入ph值为10、浓度为0.5m、体积为200μl的碳酸钠溶液中溶解，待溶解后，加入采用2ml的0.5m盐酸新鲜淋洗得到的68ga溶液5mci，在密闭条件下于90℃下反应11分钟，然后将所得反应液进行冷却，加入水稀释并注入c18分离小柱，用ph值为7的pbs缓冲液冲洗柱子，然后用0.5ml的10mm乙醇溶液洗脱标记产物，用生理盐水(质量浓度为0.9％)稀释后无菌过滤即得68ga-nota-mal-mzher2，产率为83±3％；所述的68ga-nota-mal-mzher2化学结构图如图1所示。
实施例4
本实施例提供了一种制备her2亲合体的68ga标记物的方法，包括如下步骤：
取nota-mal-mzher2的冻干粉200μg加入ph值为8、浓度为0.2m、体积为1000μl的醋酸钠溶液中溶解，待溶解后，加入采用1ml的0.09m盐酸新鲜淋洗得到的68ga溶液15mci，在密闭条件下于110℃下反应9分钟，然后将所得反应液进行冷却，加入水稀释并注入c18分离小柱，用ph值为7的pbs缓冲液冲洗柱子，然后用0.4ml的11mm乙醇溶液洗脱标记产物，用生理盐水(质量浓度为0.9％)稀释后无菌过滤即得68ga-nota-mal-mzher2，产率为82±3％；所述的68ga-nota-mal-mzher2化学结构图如图1所示。
实施例5
本实施例提供了一种制备her2亲合体的68ga标记物的方法，包括如下步骤：
取nota-mal-mzher2的冻干粉100μg加入ph值为7、浓度为0.25m、体积为250μl的醋酸钠溶液中溶解，待溶解后，加入采用3ml的0.5m盐酸新鲜淋洗得到的68ga溶液10mci，在密闭条件下于100℃下反应10分钟，然后将所得反应液进行冷却，加入水稀释并注入c18分离小柱，用ph值为7的pbs缓冲液冲洗柱子，然后用0.5ml的10mm乙醇溶液洗脱标记产物，用生理盐水(质量浓度为0.9％)稀释后无菌过滤即得68ga-nota-mal-mzher2，产率为85±3％；所述的68ga-nota-mal-mzher2化学结构图如图1所示。
将上述方法得到的标记产物68ga-nota-mal-mzher2采用高效液相色谱(hplc)法检测：色谱柱为phenomenexlunac-18(4.6×250mm)分析柱，waters515泵，紫外检测器(λ＝218nm)，放射性γ检测器；流动相为：流动相a：含0.1％三氟乙酸(tfa)的乙腈溶液；流动相b：含0.1％tfa的水溶液；梯度洗脱：梯度从2分钟的5％a和95％b增加到32分钟的65％a和35％b；流速为1ml/min。68ga-nota-mal-mzher2的保留时间约为15min。标记产物68ga-nota-mal-mzher2的hplc色谱图如图2所示，由图中可知标记产物68ga-nota-mal-mzher2的放射化学纯度大于95％。
对比例1
本实施例提供了一种制备her2亲合体的68ga标记物的方法，包括如下步骤：
取nota-mal-mzher2的冻干粉20μg加入ph值为7、浓度为0.05m、体积为50μl的醋酸钠溶液中溶解，待溶解后，加入采用1ml的0.05m盐酸新鲜淋洗得到的68ga溶液10mci，在密闭条件下于100℃下反应10分钟，然后将所得反应液进行冷却，加入水稀释并注入c18分离小柱，用ph值为7的pbs缓冲液冲洗柱子，然后用0.5ml的10mm乙醇溶液洗脱标记产物，用生理盐水(质量浓度为0.9％)稀释后无菌过滤即得68ga-nota-mal-mzher2，产率为39±2％。
按照实施例5中相同的高效液相色谱法(hplc)测定放化纯为70％，具体见图3所示。
实验例1体外稳定性测定
本实验例目的在于考察本发明制备得到的68ga-nota-mal-mzher2在体外的稳定性
取实施例5制备得到的68ga-nota-mal-mzher2(100μl)加入ph值为7、(体积500μl)的pbs溶液中，等分成三份，依次在室温下放置0.5小时、1小时和2小时，然后进行hplc分析，按照实施例5中相同的高效液相色谱法(hplc)测定放射化学纯度，不同时间的放射化学纯度如图4所示，由图中结果表明：68ga-nota-mal-mzher2在室温下可稳定存放2小时以上，其外观和放射化学纯度无明显变化。
实验例2模型鼠micropet显像和分析
本实验例目的在于考察本发明制备得到的68ga-nota-mal-mzher2作为pet显像剂对模型鼠的micropet显像和分析
模型鼠的制备：人卵巢癌skov-3移植瘤模型鼠和人卵巢癌bt474移植瘤模型鼠按照下述方法构建：选择良好状态的bt474和skov-3肿瘤细胞用胰酶消化，重悬于pbs中并计数。收集到约5×106个bt474或skov-3细胞置入在0.2mlpbs中，放入冰盒带入动物房中，然后用无菌注射器将上述肿瘤细胞皮下植入3-4周龄雌性balb/c裸鼠的右侧腋下。每周观察两次，肿瘤大小达到100-300mm3，将动物用于体内成像研究；
实验药物：实施例5制备得到的68ga-nota-mal-mzher2；
给药剂量：3.7mbq(100uci)；
给药方法：鼠尾静脉注射；
实验方法：采用异氟烷麻醉模型鼠，分别在人卵巢癌skov-3移植瘤模型鼠和人卵巢癌bt474移植瘤模型鼠的鼠尾静脉注射约3.7mbq(100uci)实施例5所得68ga-nota-mal-mzher2。分别在注射后30min、60min、120min将上述模型鼠置于micropet扫描仪器(simeons、inveon)上进行扫描，采用二维有序子集期望最大化(二维osem)算法进行图像重建。每次micropet扫描时，在全身衰变校正冠状图像上使用供应商提供的软件勾画感兴趣区(roi)。从多个roi平均像素值中获得肿瘤、肌肉、肝和肾中的放射性活度(累计)并转化为mbq/ml。所得值除以注射剂量获得％id/g(假定组织密度为1g/ml)。结果如图5-图8所示。
由图5和图7中可知，her2阳性表达移植瘤显影清晰，与周围正常组织对比度良好。由图6和图8可知，注射后60分钟，skov-3和bt474肿瘤对68ga-nota-mal-mzher2摄取值分别为12.27±1.13％id/g和16.12±2.19％id/g，表明本发明制备的68ga-nota-mal-mzher2显像剂药代动力学性能良好，腹部本底(例如肝等)显影低。此外，显像剂在肾中高度浓聚，提示其主要通过泌尿系统排泄。
上述实验证明，本发明制备得到的68ga-nota-mal-mzher2具有优良的生物性能，完全能够满足作为肿瘤her2受体显像剂的条件，可以在临床上推广应用。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。