雷帕霉素用于抑制疟原虫传播的应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种将雷帕霉素用于抑制疟疾传播媒介传播疟原虫的新应用。

背景技术

疟疾是疟原虫经按蚊叮咬进行传播的全球性虫媒传染病，是联合国千年发展目标中重点防控的传染病之一，与艾滋病、结核病一起被世界卫生组织列为全球急需控制的三大公共卫生问题。由于缺乏有效疫苗，存在疟原虫对传统治疗药物抗性增加的问题，对疟疾的控制主要依赖于对传播媒介按蚊的防控。但是目前控制虫媒方法面临着巨大的挑战。在多个地区都出现了针对传统杀虫剂的抗药性虫媒，在某些地区甚至出现了同一种虫媒对现有四种杀虫剂都具有抗性，因此迫切需要替代途径阻碍虫媒传播疟原虫。

雷帕霉素(rapamycin)分子式为c51h79no13，是一种大环内酯类免疫抑制剂，由吸水链霉菌产生。对雷帕霉素最早的研究主要是将其作为低毒性的抗真菌药物，尤其是抗白色念珠菌。在过去的10年里，雷帕霉素及其类似物已经被美国fda批准作为肾癌、胃癌等多种癌症的治疗药物。由于代谢通路和免疫通路的相互作用，雷帕霉素目前也被作为一种免疫抑制剂用于器官移植的免疫排斥治疗。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题一方面在于，提供一种新的阻碍虫媒传播疟原虫的方法及试剂产品，以解决目前控制疟原虫虫媒方法的困难及挑战。

为解决上述技术问题，本发明提供的一种技术方案是：将雷帕霉素用于抑制经虫媒传播疟原虫的新应用。

具体的，所述新应用包括将雷帕霉素用于降低虫媒体内疟原虫卵囊数量。

具体的，所述新应用包括将雷帕霉素用于提高虫媒的抗疟原虫感染能力。

具体的，所述新应用包括将雷帕霉素用于提高虫媒的免疫效应分子tep1的表达水平。

在上述的技术方案中，所述虫媒为按蚊。

本发明还提供一种技术方案是：将雷帕霉素用于制备抑制经虫媒传播疟原虫的试剂的应用。

具体的，所述新应用包括将雷帕霉素用于制备成降低虫媒体内疟原虫卵囊数量的试剂。

具体的，所述新应用包括将雷帕霉素用于制备成提高虫媒的抗疟原虫感染能力的试剂。

具体的，所述新应用包括将雷帕霉素用于制备成提高虫媒的免疫效应分子tep1的表达水平的试剂。

在上述的技术方案中，所述虫媒为按蚊。

本发明还提供一种技术方案是：一种抑制虫媒传播疟原虫的含雷帕霉素的试剂，是将雷帕霉素用dmso配置成20mm母液，工作溶液用pbs进行1：1000稀释，使终浓度为20μm。

本发明还提供一种技术方案是：一种抑制虫媒传播疟原虫的含雷帕霉素的试剂，是将雷帕霉素用无水乙醇配成25μg/μl母液，使用前用稀释液稀释250倍，使终浓度为0.1μg/μl；所述稀释液的配方为：体积分数为5％的吐温-80，5％的聚乙二醇，4％的乙醇，86％的去离子水。

本申请发现了雷帕霉素可以调控蚊虫主要免疫效应因子pet-1、gam和ppo的表达水平。本申请发现了雷帕霉素可以通过提高pet-1的表达水平来提高蚊虫的抗感染能力，可达到降低虫媒体内疟原虫卵囊数量、有效抑制按蚊传播疟原虫的目的，可以作为一种蚊虫传播疟原虫的阻断药物。本申请利用雷帕霉素降低了蚊虫传播疟原虫的风险。

附图说明

图1为实施例1中实验组与对照组的按蚊体内疟原虫卵囊数量分析图。

图2为实施例2中实验组与对照组的按蚊体内疟原虫卵囊数量分析图。

图3a为实施例3中实验组与对照组的八种免疫效应分子的表达水平分析图。

图3b为实施例3中敲低tep1实验的八种免疫效应分子的表达水平分析图。

图3c为实施例3中敲低tep1组与未敲低tep1组的按蚊体内疟原虫卵囊数量分析图。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施方式中涉及的实验材料来源如下：

按蚊：斯氏按蚊(anophelesstephensi(strainhor))，来源于中国人民解放军海军军医大学；老鼠：balb/c小鼠，购自上海斯莱克公司/上海西普尔－必凯实验动物有限公司；疟原虫：伯氏疟原虫(plasmodiumbergheianka)，来源于中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所。雷帕霉素：购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号为a606203。

实施例1

配制雷帕霉素试剂1：将雷帕霉素用dmso配置成20mm母液，工作溶液用pbs进行1：1000稀释，使终浓度为20μm。

空白试剂1：dmso用pbs进行1：1000稀释。

实验组利用显微注射的方式将69nl20μm的雷帕霉素试剂1注射入按蚊体腔；注射12h后，使用感染疟原虫的老鼠饲喂按蚊；8天以后检测蚊虫中疟原虫的感染率。对照组使用空白试剂1替代雷帕霉素试剂1，按照相同的实验步骤进行。

结果显示：实验组经雷帕霉素处理后的按蚊体内疟原虫卵囊数量相比对照组显著减少(图1)，**表示p＜0.01。说明雷帕霉素具有提高按蚊的抗疟原虫感染能力，抑制虫媒体内疟原虫卵囊数量，可抑制疟原虫通过按蚊的传播途径。

实施例2

配制雷帕霉素试剂2：将雷帕霉素用无水乙醇配成25μg/μl母液，使用前用稀释液稀释250倍，使终浓度为0.1μg/μl；稀释液的配方为：体积分数为5％的吐温-80，5％的聚乙二醇，4％的乙醇，86％的去离子水。

空白试剂2：无水乙醇用相同的稀释液稀释250倍。

老鼠感染疟原虫4天后，经检测虫血密度达到3％-5％。实验组：将感染后的老鼠采用尾静脉注射雷帕霉素试剂2，注射剂量为每20g小鼠体重注射200μl；注射15min后麻醉小鼠，饲喂蚊虫，8天后检测蚊虫中疟原虫卵囊的数量。对照用使用空白试剂2替代帕霉素试剂2，按照相同的实验步骤进行。

结果显示：实验组中，叮咬经雷帕霉素处理的小鼠的按蚊中肠内疟原虫卵囊数量显著降低(图2)，****表示p＜0.0001。说明雷帕霉素能够抑制疟原虫经蚊虫传播，降低虫媒体内疟原虫卵囊数量。

实施例3测定雷帕霉素对按蚊免疫系统的调节作用

配制雷帕霉素试剂1：将雷帕霉素用dmso配置成20mm母液，工作溶液用pbs进行1：1000稀释，使终浓度为20μm。

空白试剂1：dmso用pbs进行1：1000稀释。

实验组利用显微注射的方式将69nl20μm的雷帕霉素试剂1注射入按蚊体腔；注射12h后，使用感染疟原虫的老鼠饲喂按蚊；8天以后检测蚊虫中八种免疫效应分子的表达水平。对照组使用空白试剂1替代雷帕霉素试剂1，按照相同的实验步骤进行。

分别测定实验组和对照组的按蚊体内主要免疫分子的表达水平，发现免疫效应分子gambicin和tep1的表达水平发生显著上调(图3a)，**表示p＜0.01，说明雷帕霉素参与了按蚊体内的免疫反应调控，具有提高虫媒免疫效应分子tep1的表达水平的作用。

敲低tep1实验：利用显微注射的方式将69nl3.5μg/μl的tep1双链rna(dstep1)注射入按蚊体腔，两天后，抽提rna检测免疫效应分子tep1的表达水平，发现tep1的表达水平显著降低，其他免疫效应分子如att、cec、gam、ppo等无显著变化(图3b)。

以经敲低tep1实验处理的按蚊为实验组，以未经敲低tep1实验处理的按蚊为对照组。实验组和对照组均利用显微注射的方式将69nl20μm的雷帕霉素试剂1注射入按蚊体腔；注射12h后，使用感染疟原虫的老鼠饲喂按蚊；8天以后检测蚊虫中疟原虫的感染率。

实验结果显示，实验组的蚊虫经敲低tep1实验处理后再经过雷帕霉素处理，其对疟原虫的感染率相比对照组显著升高(图3c)，***表示p＜0.001，说明蚊虫中免疫效应因子tep1的表达水平与蚊虫对疟原虫的抗感染能力密切相关，雷帕霉素可以通过调控主要免疫效应因子tep1的表达水平，提高蚊虫对疟原虫的抗感染能力。

综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。