本发明涉及凝结芽孢杆菌在制备诱导抗肿瘤免疫及免疫检查点抑制剂增敏制剂中的应用，具体是用凝结芽孢杆菌制备诱导抗肿瘤免疫及免疫检查点抑制剂增敏制剂，并提供该制剂联合免疫检查点抑制剂治疗癌症的方法，属于生物医药领域。
背景技术：
免疫检查点阻断治疗是目前肿瘤免疫疗法的热点，ctla-4(细胞毒性t淋巴细胞相关抗原)、pd-1(程序性细胞死亡蛋白1)和pd-l1(pd-1配体1)是目前研究较清楚的免疫检查点分子，针对这些免疫检查点分子的抗体能阻断相关信号通路，增强内源性抗肿瘤免疫效应，这些抗体分子即为免疫检查点抑制剂。虽然免疫检查点阻断治疗在临床应用中带来持久的肿瘤抑制作用，但仅对部分患者有效，目前通常在未经挑选的实体瘤中，单独使用的应答率为15-20％，如何提高免疫检查点抗体药物应答率是目前面临的主要难题。目前医学研究认为，免疫检查点阻断治疗的持续治疗能带来更好的治疗效果，然而在有限的免疫检查点应答患者中，强烈的副反应如严重的消化道不良反应、皮肤剧烈瘙痒、肝损伤、肺炎、肾功能损害等使得这些患者不得不中止免疫治疗，从而无法获得预期的临床受益。
本发明人经过研究发现，凝结芽孢杆菌能够有效诱导抗肿瘤免疫，增加免疫检查点抑制剂应答率和治疗效果，降低副作用，延长生存期，效果优于双歧杆菌，且未见相关研究报道，特申请此发明专利。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种能够有效诱导抗肿瘤免疫、增加免疫检查点抑制剂应答率和治疗效果并降低副作用的制剂，该制剂主要由凝结芽孢杆菌制成。
本发明的微生态制剂的制备优选是通过下述步骤实施的，但不局限于此制备工艺，公知的能实现的制备工艺均可以：采取可能含凝结芽孢杆菌的样品，然后将样品置于灭菌瓶内，研究时从中取一定量的样品加入18ml灭菌的稀释液中，充分混匀，在无菌操作台内，进行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7梯度稀释，取10-5、10-6、10-7三个稀释梯度，分别涂布于凝结芽孢杆菌选择性单菌落分离固体培养基上，置于培养箱，37℃下培养48小时，选择长势良好的单菌落分别接种于液体扩增培养基中，置于培养箱内，37℃下扩增培养48小时。将所得培养液离心(12000rpm)分离出菌体后，将菌体冷冻真空干燥，调制出干燥菌粉，然后根据《伯杰细菌鉴定手册》、相关细菌鉴定文献或16srrna序列对比分析进行凝结芽孢杆菌鉴定和毒性试验，将无毒性的凝结芽孢杆菌干燥菌粉按需要比例添加辅料制成片剂、胶囊、散剂、粉剂或液体制剂等各种剂型，也可加入其他活菌或低聚果糖、低聚木糖等低聚糖起到协同作用。
凝结芽孢杆菌选择性单菌落分离固体培养基优选但不局限于：纯化水1000ml，蛋白胨10g，牛肉浸取物10g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，酵母粉5g，葡萄糖5g，磷酸二氢钾2g，吐温801.0ml，碳酸钙20g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，琼脂15g，调ph6.2-6.5，115℃高压灭菌20min。
凝结芽孢杆菌液体扩增培养基优选但不局限于：纯化水1000ml，蛋白胨10g，牛肉浸取物3g，氯化钠5g，葡萄糖5g，调ph7，115℃高压灭菌20min。
为进一步具体说明本发明，发明人利用上述方法通过凝结芽孢杆菌选择性单菌落分离固体培养基分离鉴定出了无毒性的凝结芽孢杆菌，本发明所述凝结芽孢杆菌并不局限于为说明本发明所述的菌，只要无毒性的凝结芽孢杆菌均是本发明所述，均在本发明的保护范围内。
本发明所述凝结芽孢杆菌优选但不限于凝结芽孢杆菌tbc169保藏编号cgmccno.1207或凝结芽孢杆菌dh156保藏编号cgmccno.13136。
本发明实施说明中优选使用的凝结芽孢杆菌的细菌学性质：
1、菌落形态
显微镜观察：杆状，革兰氏染色阳性。
平板形态：菌落呈白色、圆形、边缘整齐、大小2-3mm。
2、生理生化鉴定
明胶液化：－；过氧化氢酶：+；vp试验：+；苯丙氨酸脱氨酶试验－。
3、糖酵解实验鉴定
葡萄糖：+；麦芽糖：+；蔗糖：+；木糖：－；果糖：+；鼠李糖：－；乳糖：+；菊粉：+；半乳糖：+；糊精：+。
4、分离的菌进行16srrna基因测序，测得序列用blast与genbank和rdp数据库中的基因序列进行相似性分析，确定分离的菌为凝结芽孢杆菌bacilluscoagulans。
本发明所述的凝结芽孢杆菌指活的生物个体。
本发明是以有效剂量按上述方法分离的凝结芽孢杆菌作为主要活性成份，按照一定的制剂工艺，加入常规的赋形剂、调味剂、崩解剂、防腐剂、润滑剂、湿润剂、黏合剂、溶剂、增稠剂、增溶剂等辅料，制成任何一种适合于使用的剂型，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、液体制剂、粉剂等剂型。
本发明所述凝结芽孢杆菌作为主要药物活性成份制成活菌制剂。
本发明所指有效剂量是指按上述方法分离的凝结芽孢杆菌根据上面所述单独或组合作为主要药物活性成份制成的固体活菌制剂包含的总活菌数不能低于1×106cfu/g，一般在1×108cfu/g以上，最高可达到1×1012cfu/g或1×1012cfu/g以上，或液体活菌制剂包含的总活菌数不能低于1×106cfu/ml，一般在1×108cfu/ml以上，最高可达到1×1012cfu/ml或1×1012cfu/ml以上。
本发明所述制剂包括凝结芽孢杆菌单独应用或与其他药物联合应用，尤其包括凝结芽孢杆菌单独应用或与双歧杆菌联合应用。
本发明所述双歧杆菌指活的生物个体。
本发明所述双歧杆菌联合应用的制剂中，固体制剂包含的双歧杆菌总活菌数不低于1×106cfu/g，一般在1×107cfu/g以上，最高可达到1×1012cfu/g或1×1012cfu/g以上；或液体制剂包含的双歧杆菌总活菌数不低于1×106cfu/ml，一般在1×107cfu/ml以上，最高可达到1×1012cfu/ml或1×1012cfu/ml以上。
本发明所述免疫检查点抑制剂包括pd-1、pd-l1、pd-l2、pdl3、pd-l4、ctla-4、lag3、b7-h3、b7-h4、kir或tim3的抑制剂，进一步地，所述免疫检查点抑制剂包括纳武利尤单抗(nivolumab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、得瓦卢单抗(durvalumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、avelumab、cemiplimab-rwlc、特瑞普利单抗(toripalimab)、信迪利单抗、替雷丽珠单抗(tislelizumab)、卡瑞利珠单抗或以上抑制剂的任何组合。
本发明还公开了一种癌症的治疗方法，所述方法将有效量的凝结芽孢杆菌作为主要活性成份制成的制剂和有效量的免疫检查点抑制剂共同施用至有需要的对象，进一步地，所述共同施用包括将两类制剂同时、分别或顺序施用。
本发明所述癌症包括肺癌、肠癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、子宫颈癌、头颈癌、黑色素瘤、胶质母细胞瘤、骨髓瘤、淋巴瘤或白血病，进一步地，所述肺癌包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌，所述肠癌包括结肠癌和直肠癌，所述肾癌包括肾细胞癌，所述黑色素瘤包括恶性黑色素瘤，所述淋巴瘤包括霍奇金淋巴瘤。
由于本发明首次公开了凝结芽孢杆菌作为主要活性成份制成制剂在诱导抗肿瘤免疫及免疫检查点抑制剂增敏中的应用，因此含上述凝结芽孢杆菌的制剂在诱导抗肿瘤免疫及免疫检查点抑制剂增敏中的应用均属于本发明的保护范围。
本发明所述的凝结芽孢杆菌在制成任何一种剂型时，均具有诱导抗肿瘤免疫及免疫检查点抑制剂增敏的作用。如果其组份中含有凝结芽孢杆菌成份制备成制剂，在其包装或说明书等标识上或者在其他任何宣传品上只要注明或提示具有诱导抗肿瘤免疫及免疫检查点抑制剂增敏的作用，则落入本发明的保护范围之内。
本发明所述的凝结芽孢杆菌可以制成药品、保健食品、食品或饮品等。
具体实施方式
制备例说明：上述已经对凝结芽孢杆菌制剂的制备进行说明，这里通过凝结芽孢杆菌tbc169保藏编号cgmccno.1207或凝结芽孢杆菌dh156保藏编号cgmccno.13136为例进行具体说明，其他凝结芽孢杆菌菌种制剂的制备方法本领域技术人员通过本实施例很容易掌握，其他剂型的制备方法本领域技术人员通过本实施很容易掌握，在此不再一一叙述说明。制备方法并不局限于本发明实施例所述，公知的能够达到制备目的的方法均可以，实施例的制备说明只是对本发明的说明，并不是对本发明保护范围的限制。
制备实施例1凝结芽孢杆菌粉剂的制备
1菌粉的制备和菌种的鉴定
采取人的粪便等样品，然后将样品置于灭菌瓶内，从中取2克样品加入18ml灭菌的稀释液中，充分混匀，在无菌操作台内，进行10-1、10-2、10-3、10-4，10-5，10-6，10-7梯度稀释，取10-5，10-6，10-7三个稀释梯度，涂布于凝结芽孢杆菌选择性单菌落分离固体培养基上，置于培养箱，37℃下培养48小时，选择长势良好的单菌落接种到凝结芽孢杆菌液体扩增培养基中，37℃下扩增培养48小时。将所得培养液离心(12000rpm)分离出菌体后，将菌体冷冻真空干燥，调制出干燥菌粉，活菌数均为1×1010cfu/g以上，然后进行菌种鉴定。经生理生化和16srrna序列对比分析鉴定为凝结芽孢杆菌，为凝结芽孢杆菌tbc169保藏编号cgmccno.1207或凝结芽孢杆菌dh156保藏编号cgmccno.13136。
凝结芽孢杆菌tbc169保藏编号cgmccno.1207或凝结芽孢杆菌dh156保藏编号cgmccno.13136菌粉制备，将凝结芽孢杆菌tbc169保藏编号cgmccno.1207或凝结芽孢杆菌dh156保藏编号cgmccno.13136接种到凝结芽孢杆菌液体扩增培养基中，37℃下扩增培养48小时。将所得培养液离心(12000rpm)分离出菌体后，将菌体冷冻真空干燥，调制出干燥菌粉，活菌数均为1×1010cfu/g以上。
2毒性试验
2.1动物及分组取30只spf级别大鼠，6-8周龄，体重14-18g，随机分入凝结芽孢杆菌tbc169组、凝结芽孢杆菌dh156组和未给药组，每组10只。
2.2制备菌液将上述不同的凝结芽孢杆菌菌粉分别用纯化水调制为含菌数均为1×1010cfu/ml的菌液。
2.3方法各凝结芽孢杆菌组和未给药组均给予相同的基础饲料，且饲养条件均一致，各凝结芽孢杆菌组每天灌服凝结芽孢杆菌菌液0.5ml，未给药组每天灌服纯化水0.5ml，饲喂14天，观察体重及毒性反应。
2.4结果
各组大鼠均未出现异常情况，未发生振颤、痉挛、运动失调、姿态异常，无眼球突出，排尿正常，皮肤、呼吸正常，无死亡情况，未见中毒反应。
3制备成粉剂等剂型
根据上述步骤和方法分离鉴定后，经实验检验无毒性，就可将凝结芽孢杆菌菌种制成菌粉，然后按照需要添加相关辅料制成各种剂型，优选据凝结芽孢杆菌菌粉的活菌数，按比例添加淀粉制成粉剂，使活菌数不低于1×108cfu/g，然后装袋。
应用效果实施例说明：
本发明以凝结芽孢杆菌tbc169保藏编号cgmccno.1207或凝结芽孢杆菌dh156保藏编号cgmccno.13136为代表说明凝结芽孢杆菌的应用效果，菌粉由青岛东海药业有限公司提供。本发明中使用的双歧杆菌来自于市场销售产品，公众能够购买到的双歧杆菌活菌均可。本发明中使用的pd-1抑制剂来自于市售。
应用效果实施例1：凝结芽孢杆菌联合免疫检查点抑制剂在治疗肺癌中的应用
1模型组制备：
1.1实验动物6-8周龄的雄性c57小鼠，体重18-22g。实验前按昼夜节律采光12h，控制温度、湿度，自由摄取食物和水，每日定时更换饲料，排除其它应激因素干扰。
1.2制备方式采用移植瘤模型的方法建立小鼠肺癌模型。取对数生长期的非小细胞肺癌细胞系a549，用pbs调整细胞数为5×107个/ml，对小鼠皮下右侧腹股沟区接种细胞悬液0.2ml；肿瘤接种6天左右，选肿瘤直径达5mm左右的造模成功的小鼠进行试验。
1.3模型组制备结果造模成功。
2药物治疗实验：
2.1实验方法将造模成功的小鼠随机分为a：凝结芽孢杆菌(tbc169)+pd-1抑制剂治疗组、b：凝结芽孢杆菌(dh156)+pd-1抑制剂治疗组、c：双歧杆菌+pd-1抑制剂治疗组、d：pd-1抑制剂治疗组、e：模型对照组。每组样本量15只，所有对象均给予相同的基础饲料，且饲养条件均一致。给药组每周腹腔注射一次pd-1抑制剂药物(5mg/kg)，并每天使用含菌数为1×106cfu/ml(用0.9％生理盐水调制菌粉)的菌液灌服0.5ml，模型组注射等量生理盐水并灌服0.9％生理盐水0.5ml，连续给药4周。4周后处死部分小鼠获取瘤组织并进行相关检测，其余小鼠继续按照之前方案给药，计算各组生存期。
2.2检测4周后处死部分小鼠获取瘤组织行抑瘤率测定(抑瘤率＝(模型组平均瘤质量-给药组平均瘤质量)/模型组平均瘤质量×100％)，同时测定肿瘤组织cd8+ifn-γ+t细胞占比。数据使用spss21.0进行统计学分析。
3结果
与模型对照组相比，各治疗组均取得了显著的肺癌治疗效果。与pd-1抑制剂治疗组相比，凝结芽孢杆菌tbc169和dh156联合治疗后，肿瘤显著缩小(p＜0.01)、ifn-γ+cd8+显著增加(p＜0.01)、生存期显著延长(p＜0.01)，差异具有统计学意义。与双歧杆菌联合治疗组相比，凝结芽孢杆菌tbc169联合治疗组和dh156联合治疗组肿瘤显著缩小(p＜0.05)、ifn-γ+cd8+显著增加(p＜0.05)、生存期显著延长(p＜0.05)，差异具有统计学意义。凝结芽孢杆菌tbc169联合治疗组和dh156联合治疗组之间，各项指标均无统计学差异(p＞0.05)。凝结芽孢杆菌联合pd-1抑制剂对肺癌有显著治疗作用，疗效显著优于pd-1抑制剂单独治疗和双歧杆菌联合治疗组。见表1。
表1不同组别肺癌治疗效果统计分析
4讨论
凝结芽孢杆菌联合pd-1抑制剂能够提高pd-1抑制剂对肿瘤的抑制效果，显著延长生存期，对肺癌有显著治疗作用，且该种作用显著优于双歧杆菌联合pd-1抑制剂的协同效果。
应用效果实施例2：凝结芽孢杆菌联合免疫检查点抑制剂在治疗肠癌中的应用
1模型组制备：
1.1实验动物6-8周龄雌性balb/c小鼠，体重18-22g。实验前按昼夜节律采光12h，控制温度、湿度，自由摄取食物和水，每日定时更换饲料，排除其它应激因素干扰。
1.2制备方式采用移植瘤模型的方法建立小鼠肠癌模型。取对数生长期的结肠癌细胞系ct26，用pbs调整细胞数为5×107个/ml，对小鼠皮下右侧腹股沟区接种细胞悬液0.2ml；肿瘤接种6天左右，选肿瘤直径达5mm左右的造模成功的小鼠进行试验。
1.3模型组制备结果造模成功。
2药物治疗实验：
2.1实验方法将造模成功的小鼠随机分为a：凝结芽孢杆菌(tbc169)+pd-1抑制剂治疗组、b：凝结芽孢杆菌(dh156)+pd-1抑制剂治疗组、c：双歧杆菌+pd-1抑制剂治疗组、d：pd-1抑制剂治疗组、e：模型对照组。每组样本量15只，所有对象均给予相同的基础饲料，且饲养条件均一致。给药组每周腹腔注射一次pd-1抑制剂药物(5mg/kg)，并每天使用含菌数为1×106cfu/ml(用0.9％生理盐水调制菌粉)的菌液灌服0.5ml，模型组注射等量生理盐水并灌服0.9％生理盐水0.5ml，连续给药4周。4周后处死部分小鼠获取瘤组织并进行相关检测，其余小鼠继续按照之前方案给药，计算各组生存期。
2.2检测4周后处死部分小鼠获取瘤组织行抑瘤率测定(抑瘤率＝(模型组平均瘤质量-给药组平均瘤质量)/模型组平均瘤质量×100％)，同时测定肿瘤组织cd8+ifn-γ+t细胞占比。数据使用spss21.0进行统计学分析。
3结果
与模型对照组相比，各治疗组均取得了显著的肠癌治疗效果。与pd-1抑制剂治疗组相比，凝结芽孢杆菌tbc169和dh156联合治疗后，肿瘤显著缩小(p＜0.01)、ifn-γ+cd8+显著增加(p＜0.01)、生存期显著延长(p＜0.01)，差异具有统计学意义。与双歧杆菌联合治疗组相比，凝结芽孢杆菌tbc169联合治疗组和dh156联合治疗组肿瘤显著缩小(p＜0.05)、ifn-γ+cd8+显著增加(p＜0.05)、生存期显著延长(p＜0.05)，差异具有统计学意义。凝结芽孢杆菌tbc169联合治疗组和dh156联合治疗组之间，各项指标均无统计学差异(p＞0.05)。凝结芽孢杆菌联合pd-1抑制剂对肠癌有显著治疗作用，疗效显著优于pd-1抑制剂单独治疗和双歧杆菌联合治疗组。见表2。
表2不同组别肠癌治疗效果统计分析
4讨论
凝结芽孢杆菌联合pd-1抑制剂能够提高pd-1抑制剂对肿瘤的抑制效果，显著延长生存期，对肠癌有显著治疗作用，且该种作用显著优于双歧杆菌联合pd-1抑制剂的协同效果。
综上，凝结芽孢杆菌能够有效诱导抗肿瘤免疫、显著增加免疫检查点抑制剂应答率和治疗效果，并降低副作用、显著延长生存期，是癌症治疗领域的新方法、新突破。
本发明在实施过程中所使用的微生物菌种已于2016年10月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所邮编100101)保藏。分类命名：凝结芽孢杆菌bacilluscoagulans，保藏编号cgmccno.13136。上述菌种经该微生物中心检测，检测结果为存活。
凝结芽孢杆菌tbc169保藏编号cgmccno.1207由本发明申请单位自行分离获得，已在商业渠道销售，并且已经授权专利保护(专利号200410098660.4)，按照专利审查指南的规定，公众能够从商业渠道买到或已经授权，不用保藏，即不用提供保藏证明，因此，本发明未提供凝结芽孢杆菌tbc169保藏编号cgmccno.1207保藏证明。