PF-4708671在制备逆转厄罗替尼耐药的非小细胞肺癌药物中的应用的制作方法

本发明属于厄罗替尼耐药，特别涉及pf-4708671制备逆转非小细胞肺癌对厄罗替尼耐药药物中的应用。

背景技术：

肺癌是目前世界上罹患癌症的男性和女性中导致死亡的最主要的病因，非小细胞肺癌(nonsmallcelllungcancer,nsclc)占据了所有肺癌患者的85%。目前在全球范内非小细胞肺癌每年的新增病例及死亡人数都在不断的攀升，也广大的医务工作人员也带来了严峻的考验。而治愈性的手术切除通常只适用于早期发病。各种分期的肺癌五年生存率只有15%。对于检查出的疾病为局限期的患者来说，生存率也仅为49%，这说明，即使是早期的诊断，该疾病的复发和死亡也是很普遍的，因此，为肺癌患者寻找新的治疗方法十分关键。

厄罗替尼是第一代egfr靶向药物特罗凯。据了解，靶向药的有效率约70%，另外，靶向治疗的无病生存时间，明显高于化疗无病生存时间。特罗凯是目前治疗非小型细胞癌的有效药物，多数患者肿瘤能迅速明显缩小，病情得到控制。但是靶向药物都有一个共通点，就是很容易出现耐药。一般平均应用厄罗替尼9-11个月后容易产生耐药，一旦产生耐药患者的治疗效果和生存时间会大受影响。现有的研究可以部分阐明厄罗替尼的耐药机制，比如：t790m突变，met扩增等。但是对于如何逆转耐药的方法确比较少，因此需要我们在研究中发现延缓和逆转厄罗替尼耐药的方法则可以延长厄罗替尼的有效时间，延长肺癌患者的生存时间，节约患者的治疗费用。

pf-4708671是一种细胞渗透性p70ribosomals6kinase(s6k1亚型)抑制剂，在无细胞试验中ki/ic50为20nm/160nm，作用于s6k1比作用于s6k2选择性高400倍，作用于s6k1比作用于msk1和rsk1/2选择性分别高4和20倍以上，是第一个报道的s6k1特异性抑制剂。pf-4708671是一种哌嗪基嘧啶类似物，是第一个s6k1特异性抑制剂。pf-4708671不显著抑制紧密相关的s6k2亚型或一组其他agc激酶(akt1,akt2,pka,pkcα,pkcϵ,prk2,rock2,rsk1,rsk2或sgk1)的活性。pf-4708671抑制s6k1介导的响应igf-1（胰岛素样生长因子1）的s6蛋白的磷酸化，对pma-诱导的底物磷酸化没有作用效果，底物与rsk(p90核糖体s6激酶)和msk（丝分裂原和应激活化蛋白激酶）激酶高度相关。pf-4708671诱导s6k1的t型环和疏水性基序磷酸化，这种作用依赖于mtorc1(mtor复合体1)。pf-4708671不影响mtorc1的活性。

发明人进行进一步研究通过构建耐厄罗替尼的hcc-827/er细胞，首次发现耐厄罗替尼的hcc-827/er细胞中p-s6k1信号明显活化，通过应用s6k1特异性抑制剂pf-4708671可以部分逆转肺癌细胞对厄罗替尼的耐药性，为制备逆转非小细胞肺癌对厄罗替尼耐药的药物提供基础和实验依据。

技术实现要素：

发明目的

本发明的目的是提供pf-4708671在制备逆转非小细胞肺癌对厄罗替尼耐药药物中的应用。

具体来说：

1、我们通过浓度梯度的方法构建了hcc-827耐厄罗替尼的细胞株，发现与敏感的亲本细胞相比，耐厄罗替尼的hcc-827/er细胞中p-s6k1信号明显活化，因此我们在细胞水平发现一种有效的细胞渗透性s6k1抑制剂pf-4708671可以抑制肿瘤细胞分裂在细胞水平逆转耐厄罗替尼的肺癌细胞对厄罗替尼的敏感性。

有益效果

1.通过一种有效的细胞渗透性s6k1抑制剂pf-4708671可以抑制肿瘤细胞分裂在细胞水平逆转耐厄罗替尼的肺癌细胞对厄罗替尼的耐药性。

2.pf-4708671在制备逆转厄罗替尼耐药的非小细胞肺癌药物中的应用。

附图说明

图1.cck-8方法检测hcc-827、hcc-827/er细胞对厄罗替尼敏感性。

图2.蛋白免疫印迹实验检测hcc-827，hcc-827/er细胞中p-s6k1的活化水平。

图3.cck-8方法检测hcc-827/er细胞对厄罗替尼及厄罗替尼+pf-4708671敏感性，*p<0.05。

图4.流式细胞方法检测厄罗替尼及厄罗替尼+pf-4708671对hcc-827/er细胞周期的影响，*p<0.05。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，但不限制本发明。

一般性说明：

实施例中末注明具体条件的的实验方法，基本上都按照sambrook，j等人编著的《分子克隆实验指南（第3版）》（molecularcloning:alaboratorymanual,3^rded.黄培堂等译，科学出版社.2002.8）中所述的条件及方法或按照材料提供商所建议的条件及方法进行，其它没有详细描述的技术相应于本领域人员来说是熟知的标准方法。

本发明的材料：本申请中提及的细胞株、脂质体以及培养基均有商品供应或以别的途径能为公众所得，它们仅作举例，对本发明不是唯一的，可分别用其它适合的工具和生物材料来代替。

实施例1

cck-8方法检测hcc-827、hcc-827/er细胞对厄罗替尼敏感性：

1）接种细胞：用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％胎牛血清的1640培养液配成单个细胞悬液，以每孔2500个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200ul。

2）培养细胞：将培养板移入co2孵箱中，在37℃、5％co2：及相对湿度条件下，培养3天。

3）呈色：培养第1—3天后，每孔加入cck-8溶液20ul，37℃，继续孵育4h。

4）比色：490nm波长处测定光密度值(od)，每组3个复孔,重复三次实验。计算生存率。生存率=实验组od值/对照组od值×100%。

按如上方法将hcc-827，hcc-827/er种在96孔板上，3500个细胞/孔。每组给予不同浓度的吉非替尼处理，给药3天后cck-8染色法检测细胞活力，进而计算各自的药物ic50。

5）结果测定:如图结果测定:如图1。

6)结果分析:与hcc-827相比较，hcc-827/er明显表现对对厄罗替尼的耐药性。

实施例2

蛋白免疫印迹实验检测hcc-827，hcc-827/er细胞中p-s6k1的活化水平：

1.方法：提取细胞总蛋白；sds-page电泳；半干式转膜；免疫印迹；ecl检测

2.结果测定：如图2所示。

3.结果分析：厄罗替尼的耐药的hcc-827/er细胞株中p-s6k的表达水平要显著高于厄罗替尼敏感的hcc-827细胞株。

实施例3

.cck-8方法检测hcc-827/er细胞对厄罗替尼及厄罗替尼+pf-4708671敏感性:

1）接种细胞：用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％胎牛血清的1640培养液配成单个细胞悬液，以每孔2500个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200ul。

2）培养细胞：将培养板移入co2孵箱中，在37℃、5％co2：及相对湿度条件下，培养3天。

3）呈色：培养第1—3天后，每孔加入cck-8溶液20ul，37℃，继续孵育4h。

4）比色：490nm波长处测定光密度值(od)，每组3个复孔,重复三次实验。计算生存率。生存率=实验组od值/对照组od值×100%。

按如上方法将分别由厄罗替尼及厄罗替尼+pf-4708671处理的hcc-827/er种在96孔板上，3500个细胞/孔。每组给予不同浓度的吉非替尼处理，给药3天后cck-8染色法检测细胞活力，进而计算各自的药物ic50。

5）结果测定:如图结果测定:如图3。

6)结果分析:与厄罗替尼单独处理相比较，厄罗替尼+pf-4708671可以逆转hcc-827/er对厄罗替尼的耐药性。

实施例4

流式细胞方法检测厄罗替尼及厄罗替尼+pf-4708671对hcc-827/er细胞周期的影响：

1）hcc-827/er经过厄罗替尼及厄罗替尼+pf-4708671处理，培养一定时间后，经胰酶消化、pbs润洗。

2）800rpm离心5min，收集细胞沉淀，弃上清，用预冷pbs洗涤两次，加入预冷75%乙醇，于4℃固定4h以上。

3）细胞染色：1500rpm离心5min，弃上清，以3ml的pbs洗涤一次，加入400ul的ccaa溶液（pi染液，engreen），100ulrnasea（100ug/ml），4℃避光孵育30min。

4）流式分析：以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2~3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件modfit分析。

5）结果测定:如图结果测定:如图4。

6)结果分析:与厄罗替尼单独处理相比较，厄罗替尼+pf-4708671可以降低厄罗替尼耐药的hcc-827/er的分裂期细胞的比例。