一种灰黄霉素四唑衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用

本发明属于药物化学和药理学技术领域，具体涉及一种灰黄霉素四唑衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术：

灰黄霉素是一种螺环苯并呋喃-3-酮类天然产物，结构如下式所示，1939年由oxford等人首次从丝状真菌分离，是具有较强抗真菌活性的非多烯类的抗真菌抗生素，它能强烈抑制真菌有丝分裂，干扰真菌dna合成，并且它与微管蛋白结合,能阻止真菌细胞分裂。目前，灰黄霉素普遍被作为抗真菌药物在临床使用。如何以价廉易得的灰黄霉素为原料，通过化学方法，对其进行大的结构改造，得到新的化合物，并开发其在药物化学和药理学技术领域的应用，具有重要意义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种灰黄霉素四唑衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，此类化合物结构中具有四唑结构，并且具有较强的抑制肿瘤细胞增殖活性，可用于制备抗肿瘤药物。

本发明提供了一种灰黄霉素四唑衍生物，该衍生物具有式(i)所示结构：

其中，r表示氢、c1-8烃基、苄基、2’-苯乙基和3’-苯丙基中的一种。

进一步的，所述灰黄霉素四唑衍生物具有如式3a～3d中任意一项所示的结构：

其中，

r为苄基时，该四唑衍生物为式3a所示结构的化合物；

r为2’-丙炔基时，该四唑衍生物为式3b所示结构的化合物；

r为3’-苯丙基时，该四唑衍生物为式3c所示结构的化合物；

r为正丁基时，该四唑衍生物为式3d所示结构的化合物；

本发明还提供了一种灰黄霉素四唑衍生物的制备方法，包括以下步骤：

由灰黄霉素与叠氮钠在三氟乙酸中发生重排反应得到四唑中间体1。然后四唑中间体1在二氯甲烷中用三溴化硼脱除甲基，得到四唑中间体2；四唑中间体2与溴代烃，在碳酸钾存在下，在n,n-二甲基甲酰胺中进行取代反应，得到相应的灰黄霉素四唑衍生物(下列反应式中3对应的结构式)；

其中，所述反应的反应式为：

其中，r选自c1-8烃基、苄基、2’-苯乙基和3’-苯丙基中的一种。

所述制备方法包括以下步骤：

(1)将灰黄霉素溶于三氟乙酸中，加入叠氮钠，室温下进行反应，得第一反应液，将所述第一反应液用有机溶剂稀释后，依次经过饱和碳酸氢钠洗，水洗，饱和食盐水洗，mgso4干燥，减压干燥，然后柱层析得到四唑中间体1；

(2)将步骤(1)得到的四唑中间体1溶于二氯甲烷中，加入三溴化硼的二氯甲烷溶液进行反应，得第二反应液，将所述第二反应液用饱和碳酸氢钠水溶液淬灭，用有机溶剂稀释后，依次经过水洗，饱和食盐水洗，mgso4干燥，减压干燥，然后柱层析得到四唑中间体2；

(3)将步骤(2)得到的四唑中间体2溶于n,n-二甲基甲酰胺，依次加入无水碳酸钾和溴代烃进行反应，得第三反应液，将所述第三反应液用有机溶剂稀释后，依次经过水洗，饱和食盐水洗，mgso4干燥，减压干燥，然后柱层析得到灰黄霉素四唑衍生物；

其中，所述有机溶剂为乙酸乙酯、乙醚和苯中的至少一种；所述溴代烃为c1-8溴代烃或苄基溴、2’-苯乙基溴、3’-苯丙基溴中的一种。

优选的，上述制备方法的步骤(1)中，灰黄霉素、叠氮钠的摩尔比为1:5。

优选的，上述制备方法的步骤(1)中，所述反应的反应温度为25℃，反应时间为6h。

优选的，上述制备方法的步骤(2)中，所述灰黄霉素四唑中间体1、三溴化硼的摩尔比为1：5。

优选的，上述制备方法的步骤(2)中，所述反应的反应温度为25℃，反应时间为12h。

优选的，上述制备方法的步骤(3)中，所述脱甲基中间体2、溴代烃、无水碳酸钾的摩尔比为1：1.5：2。

优选的，上述制备方法的步骤(3)中，所述反应的反应温度为25℃，反应时间为12h。

优选的，上述应用中，所述肿瘤包括胃癌、食管癌、结肠癌、人肺腺癌、子宫颈癌和肝癌中的一种。

与现有技术相比，本申请提供了一类新的化合物灰黄霉素四唑衍生物及其制备方法，该化合物能明显提高对肿瘤细胞的增殖抑制作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例1提供的灰黄霉素四唑衍生物(3a)的核磁共振¹h谱图；

图2为本发明实施例1提供的灰黄霉素四唑衍生物(3a)的核磁共振¹³c谱图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

将176mg(0.5mmol)的灰黄霉素溶于三氟乙酸(1ml)中，加入163mg(2.5mmol)的叠氮化钠，室温反应6h。tlc检测反应结束，用饱和碳酸氢钠淬灭，乙酸乙酯萃取(10ml×3)，合并有机相，然后依次水洗、饱和食盐水洗，旋干，柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝2:1)得到淡黄色固体(四唑中间体1)122mg(产率＝62％)。

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实施例2

将78mg(0.2mmol)的1溶于的无水二氯甲烷(10ml)中，氮气保护，冰浴至0℃，然后加入2ml的bbr3的二氯甲烷溶液，半小时后恢复室温反应过夜。tlc检测反应结束，用饱和碳酸氢钠淬灭，dcm萃取(20ml×3)，合并有机相，然后依次水洗、饱和食盐水洗，旋干，柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝1:1,rf＝0.2)得到白色固体(四唑中间体2)70mg(产率＝93％)。

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实施例3

将35mg(0.1mmol)的2溶于无水dmf(1ml)中，加入21mg(0.12mmol)的溴化苄和28mg(0.2mmol)的无水碳酸钾，室温反应过夜。tlc检测反应结束，加入20ml的乙酸乙酯稀释，然后依次水洗、饱和食盐水洗，旋干，柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝1:1)得到白色固体(3a)40mg(产率＝87％)。其核磁共振¹h谱图如图1所示，核磁共振¹³c谱图如图2所示。

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实施例4

将47mg(0.1mmol)的2溶于无水dmf(1ml)中，加入13mg(0.12mmol)的3-溴丙炔和28mg(0.2mmol)的无水碳酸钾，室温反应过夜。tlc检测反应结束，加入20ml的乙酸乙酯稀释，然后依次水洗、饱和食盐水洗，旋干，柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝1:1)得到白色固体(3b)28mg(产率＝72％)。

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实施例5

将47mg(0.1mmol)的2溶于无水dmf(1ml)中，加入24mg(0.12mmol)的3-苯基-1-溴丙烷和28mg(0.2mmol)的无水碳酸钾，室温反应过夜。反应结束，加入20ml的乙酸乙酯稀释，然后依次水洗、饱和食盐水洗，旋干，柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝1:1)得到白色固体(3c)38mg(产率＝83％)。¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.31-7.24(m,3h,arh),7.19(s,2h,arh),6.01(s,1h,arh),5.43(d,j＝1.4hz,1h,c＝ch,ch2),4.09(t,j＝6.4hz,2h,ch2),3.92(s,3h,och3),3.54(s,3h,och3),3.10(dd,j＝15.0,6.3hz,1h,ch2),2.58–2.41(m,1h,ch),2.20(q,j＝6.9hz,2h,ch2),0.99(d,j＝7.2hz,3h,ch3).¹³cnmr(100mhz,cdcl3):δ193.5(c＝o),168.7(c＝on),167.9(＝coch3),164.1(arc),162.6(arc),161.2(arc),157.1(arc),140.9(arc),128.6(arc),128.5(arc),126.1(arc),106.0(arc),102.0(arc),97.0(arc),92.8(arc),90.3(occ＝o),68.1,56.9(och3),55.9(och3),41.1(ch2),39.0(ch),31.6(ch2),30.1(ch2),13.1(ch3).hrms(esi):m/zcalcdforc25h27no6cl:472.1527；found:472.1534[m+h]⁺.

实施例6

将47mg(0.1mmol)的2溶于无水dmf(1ml)中，加入16mg(0.12mmol)的溴代正丁烷和28mg(0.2mmol)的无水碳酸钾，室温反应过夜。tlc检测反应结束，加入20ml的乙酸乙酯稀释，然后依次水洗、饱和食盐水洗，旋干，柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝1:1)得到白色固体(3d)35mg(产率＝86％)。

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为了更好地理解本发明的实质，下面分别用本发明提供的灰黄霉素四唑衍生物对六种肿瘤细胞株的生长的抑制作用的药理实验结果，说明其在抗肿瘤药物研究领域中的新用途。药理实施例给出了代表性化合物的部分活性数据。必须说明，本发明的药理实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

药物实验例1：化合物3a～3d和紫杉醇对人食管癌细胞(te-13)细胞毒活性测试

人食管癌细胞te-13用rpmi1640培养基培养，培养基中含有10％的胎牛血清，100u/ml青霉素和100u/ml的链霉素。细胞以每孔5×10³的浓度加入到96孔板中，在37℃含有5％co2的潮湿空气的培养箱中培养24小时。

将化合物3a～3d溶于dmso中，配制1×10^-2mol/l的母液，用完全培养基将母液稀释到相应浓度取对数生长期细胞接种于96孔板，24h贴壁后加入不同浓度的化合物溶液，每个浓度设4个平行孔，培养68h后加入四甲基偶氮唑盐(mtt)溶液，继续培养4h，弃去培养液，加入二甲亚砜150μl，振荡10min，用酶标仪测定570nm吸收度(a)值，计算半数抑制浓度(ic50)，具体如表1所示。根据表1可知，化合物3a的ic50为1×10^-7m，而阳性对照紫杉醇对te-13细胞的ic50为3×10^-7m。

药物实验例2-6：化合物3a～3d和紫杉醇对人胃癌细胞(mgc803)，人肺腺癌细胞(a549)，人子宫颈癌细胞(hela)，人结肠癌细胞(hct-116)，人肝癌细胞(hepg2)细胞毒活性测试。

采用药物实验例1所示方法，对人胃癌细胞(mgc803)，人肺腺癌细胞(a549)，人子宫颈癌细胞(hela)，人结肠癌细胞(hct-116)，人肝癌细胞(hepg2)的生长抑制作用进行药理实验，计算半数抑制浓度(ic50)，具体如表1所示。

表1化合物3a～3d和紫杉醇的细胞毒活性测试结果

根据表1可知，本发明提供的灰黄霉素四唑衍生物具有重要的生物活性，体外对人胃癌细胞(mgc803)，人食管癌细胞(te-13)，人结肠癌细胞(hct-116)，人肺腺癌细胞(a549)，人子宫颈癌细胞(hela)，人肝癌细胞(hepg2)共六种肿瘤细胞的细胞毒活性试验表明：此类式(1)所示结构的灰黄霉素四唑衍生物对肿瘤细胞生长具有抑制作用，有可能发展成为新的防治肿瘤药物。从以上药理实施例中我们可以看出这些化合物对这六种肿瘤细胞都显示了较强的细胞毒活性，细胞毒活性超过或与阳性对照紫杉醇相当，具有开发成抗肿瘤药物的潜力。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。