专利名称：用作抗血小板聚集抑制剂和血管舒张剂的脒衍生物的制作方法
背景技术：
发明领域本发明涉及具有供给一氧化氮性质的新的脒衍生物及其药物组合物或制剂，以及它们的治疗应用，尤其是用来作为血小板聚集、血小板粘连和再狭窄的抑制剂，抗动脉粥样化剂，和用于治疗用途的血管舒张剂，包括对不稳定心绞痛，中风，心肌梗塞，心肌局部缺血和再灌注损伤，内脏局部缺血和再灌注损伤，动脉粥样硬化，充血性心衰，心律失常，血栓形成，高血压，肺病，转移和骨质疏松的治疗。相关技术纤维蛋白原是作为血浆正常成分存在的糖蛋白。在血液凝固的机制中，它参与了血小板的聚集和纤维蛋白的形成。
血小板是存在于全血中的细胞单元，它也参与了血液凝固。与血小板结合的纤维蛋白原在血液凝固机制中对正常的血小板功能至关重要。一旦血管受到损伤，与纤维蛋白原结合的血小板立即开始聚集并形成血栓。纤维蛋白原与血小板的作用是通过称作GP IIb/IIIa的膜糖蛋白复合物进行的；这是血小板功能一个重要特征。该作用的抑制剂对调节血小板的血栓形成有作用。
还已知道，叫做纤连蛋白的另一种大的糖蛋白是主要的胞外基质蛋白，它与血小板相互作用。已发现各种较大的多肽片断在纤连蛋白的细胞结合区域具有细胞附着活性。参见美国专利4,517,686；4,589,881和4,661,111。同一分子中某些较小的肽片断，发现当它固定到底物上时，增强了细胞对底物的附着，当它溶解或以悬浮状态存在时，则抑制附着作用。参见美国专利4,578,079和4,614,517。
美国专利4,683,291中公开了所设计的对血小板功能有抑制作用的合成肽，它是纤维蛋白原与血小板结合的高亲合性拮抗剂。美国专利4,857,508公开了具有血小板聚集抑制剂作用的四肽化合物。
其它的合成肽和它们作为纤维蛋白原与血小板结合的抑制剂的应用公开于Kozcewiak等《生物化学》(Biochem.)23，1767-1774(1984)；Plow等《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.)，82，8057-8061(1985)；Ruggeri等《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.)，83，5708-5712(1986)；Ginsberg等，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)260(7)，3931-3936(1985)；Haverstick等，《血液》(Blood)66(4)，946-952(1985)；和Ruoslahti和Piersbacher《科学》(Science)238，491-497(1987)。在欧洲专利申请275,748和298,820中公开了其它这种抑制性肽。
欧洲专利申请512,831公开了哌啶烷基-氮杂环烷酮，它抑制纤维蛋白原与血小板的结合，因而可用于抑制血小板的聚集。欧洲专利申请503,548公开了环脲衍生物(脒唑啉酮和三唑酮)，它们可用于抑制细胞间的作用，从而用于治疗或预防血栓，栓塞和转移。欧洲专利申请496,378公开了脒基二苯基化合物，它抑制细胞-细胞和细胞-基质间的作用，因此用于治疗血栓，脑血管疾病，肺栓塞，心肌梗塞，动脉粥样硬化，骨质疏松和肿瘤转移。
欧洲专利申请445,796公开了对粘连蛋白与血小板结合及血小板的聚集和细胞粘连有抑制作用的醋酸衍生物。欧洲专利申请372,486公开了N-酰基β-氨基酸衍生物和它们的盐。该公开的化合物在治疗血栓，中风，心肌梗塞，炎症和动脉粥样硬化中用于抑制血小板的聚集，并抑制转移。欧洲专利申请381,033公开了脒基或胍基芳基取代的链烷酸衍生物用于治疗血栓卒中，心肌梗塞，炎症，动脉粥样硬化和肿瘤。
国际专利申请WO 95/06038和WO 94/22820公开了苯基脒衍生物用作血小板聚集的抑制剂。美国专利5,220,050，5,239,113，5,254,573，5,272,162，5,378,727，5,314,902，5,344,957，5,344,837和5,354,738公开了新的血小板聚集抑制剂。
自80年代初就已知道由乙酰胆碱导致的血管的松弛作用依赖于内皮并将该活性归因于称作内皮细胞舒血管因子(EDRF)的不稳定体液因子。作为血管舒张药物一氧化氮(NO)的活性为人们熟知已远远超过100年，而且NO是亚硝酸戊酯，三硝酸甘油酯和其它硝基血管扩张药物的活性成分。近来对EDRF的鉴定如同NO一样与生物化学路径的发现一致，通过该途径在NO合成酶的作用下由L-精氨酸中合成出NO。通过组成酶进行的NO的释放起着一种转导机制的作用，构成了几种生理响应的基础。由诱导酶产生的NO是肿瘤细胞和侵入的微生物的细胞毒素分子。
NO是可溶性的鸟苷酸环化酶的内源刺激质，除了依赖于内皮的松驰作用包括吞噬细胞的细胞毒性和中枢神经系统内的细胞间通讯外，还有许多生物作用(参见Moncada等《生化药理学》(BiochemicalPharmacology)38，1709-1715(1989)和Moncada等《药理学评论》(Pharmacological RevieWS)43，109-142(1991))。另外，在动物模型中，NO已显示出具有抗血栓形成的作用(参见Radomski等《英国药理学杂志》(British Journal of Pharmacology)92，639-646(1987)，Moncada等《心血管药理学杂志》(Journal ofCardiovascular Pharmacology)17，S25(1991)，Yao等《循环》(Circulation)86，1302-1309(1992)，Byrne等，世界专利申请WO 9403421-A2和Schonafinger等，德国专利申请DE 4223800-A1)，支气管松驰作用(Persson等《欧洲药理学杂志》(European Journalof Pharmacology)249，R7-R8(1993)，消炎作用，杀微生物作用(Alspaugh和Granger《感染和免疫》(Infection and Immunity)59，2291-2296(1991)和胃保护作用(参见Wallace等《欧洲药理学杂志》，(European Journal of Pharmacology)257，249-255(1994)。此外，已经指出，在骨质疏松的体外模型中一氧化氮对骨损失具有疗效(MacIntyre等《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)88，2936-2940(1991) 。
因此，这些性质使得一氧化氮在前述的各种疾病的治疗中通过增加生物作用和减少副作用成为增强血小板聚集抑制剂作用的理想试剂。本发明涉及新的血小板聚集抑制剂的硝酸酯和亚硝酸酯，它们的制备方法，含有它们的药物组合物及它们的使用方法。发明概述按照本发明提供了新的脒衍生物。这些新的抑制剂化合物或其药学上适用的盐可用下面的化学式(I)代表
其中；A独立地选自下组基团
其中虚线代表单键或双键并且B选自羰基或亚氨基羰基基团；W选自氢，低级烷基，低级链烯基，低级炔基，脂环烃基和芳香烃基，其中所说的所有取代基均可任意用羟基，低级烷基，低级烷氧基，卤素，硝基，氨基，酰氧基，以及可用卤素、硝基、低级烷氧基和低级烷基任意取代的苯基和萘基所取代；Z，Z′独立地选自氢，卤素，氰基，磺酰基，羟基，低级烷氧基，和低级烷基；X是低级烷基，低级链烯基，低级炔基，羰基，脂环或杂环基；Y是硝酸酯基(ONO2)，亚硝酸酯基(ONO)，或一氧化氮供给化合物，优选为2-氧化呋咱衍生物或有机硝酸酯/亚硝酸酯化合物，例如S-亚硝基半胱氨酸，S-亚硝基青霉胺和下式
其中R是氧或亚氨基；n为1到约4的整数。本发明进一步涉及包括式(I)化合物的药物组合物。该化合物和组合物具有作为血小板聚集、血小板粘连和再狭窄抑制剂的用途，具有抗动脉粥样化剂，和有治疗作用的血管舒张剂的用途，包括对不稳定心绞痛，中风，心肌梗塞，心肌局部缺血和再灌注损伤，内脏局部缺血和再灌注损伤，动脉粥样硬化，充血性心衰，局部缺血性心律失常，血栓形成，高血压，肺病，转移和骨质疏松症的治疗。本发明还涉及一种在需要这种治疗的哺乳动物内抑制血小板聚集和血小板粘连，预防再狭窄，预防动脉粥样硬化和促进血管舒张作用的方法。发明详述本发明优选实施方案是式I化合物或其药学上适用的盐；
其中；A选自下列基团；
其中的虚线指单键或双键；B选自羰基或亚氨基羰基；W选自氢，1到约6个碳原子的低级烷基，2到约6个碳原子的低级链烯基，3到约6个碳原子的脂环烃基，和6到约12个碳原子的芳香烃基，其中所说的所有基团均可用羟基，低级烷氧基，低级烷基，卤素，硝基，氨基，和酰氧基任意取代；Z，Z′独立地选自氢，卤素，氰基，磺酰基，羟基，低级烷基和低级烷氧基；X是低级烷基，低级链烯基，低级炔基，羰基，脂环或杂环基；Y是硝酸酯基(ONO2)，亚硝酸酯基(ONO)，或一氧化氮供给基团，优选为2-氧化呋咱衍生物或有机硝酸酯亚硝酸酯(ONO)化合物，如S-亚硝基半胱氨酸，S-亚硝基青霉胺和下式基团，
其中R是氧或亚氨基；n是1到约4的整数。本发明的另一优选实施方案是式I化合物或其药学上适用的盐；
其中A选自下列基团，
其中虚线是指单键或双键；B选自羰基或亚氨基羰基；W选自氢，1到约6个碳原子的低级烷基，3到约6个碳原子的脂环烃基，和6到约12个碳原子的芳香烃基，其中所述的所有基团均可任选用羟基，低级烷氧基，低级烷基，卤素，硝基，氨基，和酰氧基取代；Z，Z′独立地选自氢，卤素，烷氧基，和低级烷基；X是低级烷基，羰基或脂环基；Y是硝酸酯基(ONO2)或一氧化氮供给基团，优选为2-氧化呋咱衍生物或有机硝酸酯化合物如下式
其中R是氧或亚氨基；n是1到约3的整数。
本发明的另一优选实施方案是式I化合物或其药学上适用的盐
其中A是
其中虚线代表单键或双键；B选自羰基或亚氨基羰基；W选自氢，甲基，乙基，丙基，环己基；Z，Z′独立地选自氢和羟基；X是羰基或脂环基；Y是硝酸酯基(ONO2)或一氧化氮供给基，优选2-氧化呋咱衍生物或有机硝酸酯化合物如下
其中R是氧或亚氨基；n是1到约3整数。本发明的又一优选实施方案是式I化合物或其药学上适用的盐
其中A是下式基团
其中的虚线代表单键或双键；B是羰基；W选自氢，乙基和环己基；Z，Z′是氢；X是羰基；Y是一氧化氮供给基团，优选是有机硝酸酯化合物如
其中R是氧；n是1到约2的整数。
虽然如上述所定义的制剂或化合物可以其未处理的化学制品形式给药，但优选是以药物制剂的形式给药。按另一方面，本发明提供了一种药物制剂，它包括如上定义的一种制剂或化合物或药学上适用的盐或其溶剂合物，以及一种或多种药学上适用载体和任选的一种或多种其它治疗成分。在和其它制剂成分可配伍并对其接受者无害的意义上该载体必须是“可接受”的。
制剂中包括适合口服，非肠胃外的(包括皮下，真皮内，肌内，静脉内和关节内)，直肠和局部(包括经皮，经颊，舌下和眼内)给药的各种形式制剂，但最合适的给药途径取决于接受者的状况和疾病。该制剂可方便地制成单位剂型，并可用药学领域熟知的方法制备。所有的方法都包括将上述所定义的制剂或化合物或其药学上适用的盐或溶剂合物(“活性成分”)与构成一种或多种辅助成分的载体进行组合的步骤。一般地，通过均匀和充分地将活性成分与液体载体或细碎的固体载体或这两种载体进行组合制备该制剂，如果必要将产品制成所需剂型。
适合于口服给药的本发明制剂可制成分离的单位如每一单位含有预定量活性成分的胶囊剂，扁囊剂或片剂；粉剂或颗粒剂；水或非水的溶液或悬浮液；或水包油型的乳状液或油包水型的乳状液。该活性成分也可制成浓缩药团、药糖剂或糊剂。
任选用一种或多种辅助成分，经压制或模压可制备片剂。压制片可在适合的机器上压制任选与粘合剂，润滑剂，惰性稀释剂，表面活性剂或分散剂混合的自由流动式的(如粉末或颗粒)活性成分制备。模压片可通过在合适的机器上模制用惰性液体稀释剂湿润的粉状化合物的混合物制备。该片剂可任选包衣或刻痕并可制成活性成分的缓释或控释片。
非肠胃外的给药的制剂包括水和非水的灭菌注射液，其中可以含有抗氧剂，缓冲剂，抑菌剂和使制剂与接受者血液等渗的溶质；还包括水和非水的灭菌的悬浮液，其中可以含有悬浮剂和增稠剂。该制剂可装在单剂量或多剂量的容器中，如密封于安瓿和小玻璃瓶中，也可在冷冻干燥条件下贮存，使用前只需加入无菌的液体载体，例如，生理盐水，注射用水。临时的注射液和悬浮液可从上述的这种无菌粉剂，粒剂和片剂制备。
直肠给药的制剂可用通常使用的载体如可可脂或聚乙二醇制成栓剂。
口腔中局部给药(例如通过颊或舌下给药)的制剂包括在矫味基料如蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶中含有活性成分的锭剂，和在如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶等基料中含有活性成分的软锭剂。
优选的单位剂型是如下列举的含有效剂量或其适当分数的有效成分的制剂。
理应理解，除了上面具体提到的有效成分外，本发明制剂可从包括在本技术领域对于所考虑的剂型常用的其它试剂，例如适合口服给药的剂型中可包括矫味剂。
本发明化合物可按每天0.1-500mg/kg剂量口服或注射给药。成人的剂量一般为5mg-5g/天。片剂或其它以分离单位存在的剂型中宜含有有效剂量或其倍数为有效剂量的本发明化合物，例如，单位制剂含2.5mg-500mg的化合物，通常约含5mg-200mg。
式(I)化合物优选通过口服或注射(静脉内或皮下)给药。给病人施用的化合物的准确剂量将由出诊医生负责。然而，所使用的剂量取决于许多因素，包括病人的年龄和性别，所治疗的确切病症和它的严重程度。给药途径也依赖于病情和程度而改变。
在此使用的术语“低级烷基”(独立或结合形式)指无环烷基，它含有1-约10个、优选1-约8个碳原子，更优选1-约6个碳原子。这类基团的实例包括甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基，戊基，异戊基，己基，辛基等。
术语“低级链烯基”指至少含有1个双键的不饱和的无环烃基。该基团含约2-约10个碳原子，优选约2-约8个碳原子而更优选2-约6个碳原子。适合的链烯基的实例包括丙烯基，丁烯-1-基，异丁烯基，戊烯-1-基，2-2-甲基丁烯-1-基，3-甲基丁烯-1-基，己烯-1-基，庚烯-1-基和辛烯-1-基等。
术语“低级炔基”指至少含一个或多个三键的不饱和无环烃基，这类基团含约2-约10个碳原子，优选含约2-约8个碳原子，更优选含2-约6个碳原子。合适的炔基的实例包括乙炔基，丙炔基，丁炔-1-基，丁炔-2-基，戊炔-1-基，戊炔-2-基，3-甲基丁炔-1-基，己炔-1-基，己炔-2-基，己炔-3-基，3，3-二甲基-丁炔-1-基等。
术语“低级烷氧基”(单独或结合形式)指烷基醚基，其中术语烷基定义如上且最好含有1到约4个碳原子。适合的烷基醚基的实例包括甲氧基，乙氧基，正丙氧基，异丙氧基，正丁氧基，异丁氧基，仲丁氧基，叔丁氧基等。
术语“脂环的”或“环烷基”指3到约10个碳原子的环状脂族基，优选为3到约6个碳原子。合适的脂环基的实例包括环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环己烯基等。
术语“芳香烃”指4到约16个碳原子的芳香基，优选6到约12个碳原子，更优选6到约10个碳原子。合适的芳烃基的实例包括苯基，萘基等。
术语“杂环基”指有4到约10个碳原子，优选约5-约6个碳原子的饱和或不饱和的环状烃基，包括芳香系烃基；其中1到约4个碳原子由氮、氧或硫所代替。该“杂环基”可稠合到芳香烃基上。合适的实例包括吡咯基，吡啶基，吡唑基，三唑基，嘧啶基，哒嗪基，噁唑基，异噁唑基，噻唑基，咪唑基，吲哚基，噻吩基，呋喃基，四唑基，2-吡咯啉基，3-吡咯啉基，吡咯烷基，1，3-二氧戊烷，2-咪唑啉基，咪唑烷基，2-吡唑啉基，吡唑烷基，异噁唑基，异噻唑基，噁二唑基，三唑基，噻二唑基，2H-吡喃基，4H-吡喃基，哌啶基，1，4-二噁烷基，吗啉基，1，4-二噻烷基，硫代吗啉基，吡嗪基，哌嗪基，三嗪基，1，3，5-三噻烷基，苯并噻吩基，苯并咪唑基，喹啉基等。
术语“卤素”指氟，氯，溴或碘。
术语“前药”指在体内会变得更有效的化合物。
在这里所用的涉及病人的“治疗”其意也包括预防。
本申请中所引用的所有美国或外国的参考文献，专利或申请，如文中所写出的那样被引入本文作为参考。
用来实施本发明的起始物是可从市场如西格马(Sigma)公司买到的。
本发明化合物的两个通用合成流程概括在下面。
流程I
流程II
为制备在此公开的本发明化合物而在起始物的选择和工艺条件方面进行改动对于本领域技术人员是显而易见的。
由下述的实施例说明本发明实施例1
将N-9-芴基甲氧羰基-天冬氨酸(OtBu)-OH(Fmoc-Asp(OtBu)-OH)(5.0g；10毫摩尔)，单硝酸异山梨醇酯(2.0g；10毫摩尔)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP，100mg)溶于二氯甲烷(150ml)中。在搅拌下向该溶液加入N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC，2.3g；12毫摩尔)。室温下将该混合物搅拌一个周末。取小份样品送检质谱，结果表明有所需的中间体(FAB-MS(M+Li)+＝591)的存在。经过滤除去固体脲并用二乙胺(DEA，40ml)处理滤液1小时。在旋转蒸发仪上蒸去溶剂后不需任何纯化直接使用残留物。FAB-MS(M+Li)+＝369。实施例2
按照实施例1所述方法从Fmoc-Asp(OtBu)-OH和2-氨基-1，43，6-二脱水山梨醇-5-硝酸酯制备标题化合物。实施例3
将4-脒基苯基戊酸盐酸盐(2.6g；10毫摩尔)，二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC，2.5g；10毫摩尔)和4-二甲基氨基吡啶(0.5g)于二甲基甲酰胺/吡啶(3∶1；200ml)中搅拌过夜。向该混合物中缓缓加入天冬氨酰(OtBu)-异山梨醇-5-单硝酸酯(实施例1)。该混合物室温下再搅拌一天后过滤。从滤液中得到的小份样品所作的质谱表明存在所需的中间体(FAB-MS(M+H)+＝565)。将滤液蒸发至干后残留物用三氟醋酸(TFA，100ml)处理1小时。在旋转蒸发仪上减压蒸去酸后，油状残留物经制备型反相高效液相层析在Deltapak C18柱上纯化，使用5-50％乙腈/水/0.05％三氟醋酸的线性梯度洗脱液。将产物冷冻干燥得到450mg白色固体产物。
FAB-MS(M+H)+＝508.9.1H-NMR(DMSO-d6)1.4-1.6(m，4H，-CH2-CH2-)，2.15(t，2H，CH2-苯基)，4.35 and5.1(d，2H，异山梨醇)，4.5(q，1H，α-CH)，4.92 and 5.5(t，2H，异山梨醇)，7.4 and 7.75(dd，4H，苯基)，8.34(m，1H，NH)，9.05 and 9.2(s，2H，脒)实施例4
从4-脒基苯基戊酸盐酸盐和实施例2的标题产物按实施例3所述的方法制备本标题化合物。实施例5
将实施例3产物(100mg)溶于含有10mM半胱氨酸的磷酸盐缓冲溶液(pH7.4；10ml)中并将该混合物于室温下搅拌一个周末。用分析型高效液相层析监测反应进程。通过制备型反相高效液相层析于Deltapak C18柱上用线性梯度的5％到50％乙腈/水/0.05％三氟醋酸洗脱将得到的混合物纯化。将该产物冷冻干燥得到5mg白色固体。FAB-MS(M+H)+＝464.4。实施例6
室温下将4-[[4-脒基苯基]-氨基]-4-氧代丁酸三氟醋酸盐(3.5g；10毫摩尔)加到无水二甲基甲酰胺(100ml)中再加N-甲基吗啉(NMM，1g；10毫摩尔)和氯甲酸异丁酯(1.37g；10毫摩尔)。向所得混合物中依次加入天冬氨酰(OtBu)-异山梨醇-5-单硝酸酯(实施例1；～10毫摩尔)和N-甲基吗啉(1g；10毫摩尔)。将反应混合物室温搅拌2小时后过滤。再将滤液蒸发至干并用三氟醋酸(TFA，50ml)处理残留物1小时。在旋转蒸发仪上减压蒸去该酸后，油状的残留物经制备型反相高效液相层析，在Deltapak C18柱上纯化，用线性梯度的5％到50％乙腈/水/0.05％三氟醋酸洗脱。将产物冷冻干燥后得到700mg的白色固体。F.AB-MS(M+H)+＝524.4.1H-NMR(DMSO-d6)4.35 and 5.05(d，2H，异山梨醇)，4.5(q，1H，α-CH)，4.92 and 5.5(m，2H，异山梨醇)，7.75(s，4H，苯基)，8.44(m，1H，NH)，8.85 and 9.15(s，2H，脒)实施例7
自4-[[4-脒基苯基]-氨基]-4-氧代丁酸三氟醋酸盐和实施例2的标题产物按实施例6所述的方法制备本标题化合物。实施例8
将实施例6产物(100mg)溶解于含有10mM半胱氨酸的碳酸氢钠稀溶液(pH7.4；5ml)中并将该混合物于室温下搅拌过夜。通过分析型高效液相层析监测反应进程。由制备型反相高效液相层析在DeltapakC18柱上用线性梯度的5％到50％的乙腈/水/0.05％三氟醋酸为洗脱液将所得混合物纯化。产品冷冻干燥后得到40mg白色固体。FAB-MS(M+H)+＝479.4。实施例9
自α-[1-[4-(氨基亚氨基甲基)苯基]-2-氧-吡咯烷-3-基]醋酸和实施例1的标题产物按实施例3所述的方法制备该标题化合物。实施例10
自α-[1-[4-(氨基亚氨基甲基)苯基]-2-氧-吡咯烷-3-基]醋酸和实施例2的标题产物按实施例3所述的方法制备本标题化合物。实施例11
从α-[1-[4-(氨基亚氨基甲基)苯基]-2-咪唑啉酮-3-基]醋酸和实施例1的标题产物按实施例3所述的方法制备该标题化合物。实施例12
从α-[1-[4-(氨基亚氨基甲基)苯基]-2-咪唑啉酮-3-基]醋酸和实施例2的标题产物按实施例3所述方法制备该标题化合物。实施例13
从α-[1-[4-(氨基亚氨基甲基)苯基]-2-巯基-咪唑啉-3-基]醋酸和实施例1的标题产物按实施例3所述的方法制备本标题化合物。实施例14
从α-[1-[4-(氨基亚氨基甲基)苯基]-2(3H)-氧-1H-咪唑-3-基]醋酸和实施例1的标题产物按实施例3所述的方法制备本标题化合物。实施例15
自α-[1-[4-(氨基亚氨基甲基)苯基]-2(3H)-氧-1H-咪唑-3-基]醋酸和实施例2的标题产物按实施例3所述的方法制备本标题化合物。实施例16
实施例3的产物(25mg)用氯化氢(气体)饱和的乙醇溶液(5ml)处理。将该混合物减压下蒸发至干，残留物通过反相高效液相层析，在Deltapak C18柱上用5％到50％乙腈/水/0.05％三氟醋酸线性梯度洗脱进行纯化，所得产物冷冻干燥得到20mg白色固体。FAB-MS(M+H)+＝536.9.1H-NMR(DMSO-d6)1.18(t，3H，CH3)，1.4-1.6(m，4H，-CH2-CH2-)，2.1(t，2H，CH2-苯基)，4.05(m，2H，-OCH2-)，4.35 and 5.1(d，2H，异山梨醇)，4.5(q，1H，α-CH)，4.95 and 5.5 (t，2H，异山梨醇)，7.4and 7.75(dd，4H，苯基)，8.38(m，1H，NH)，8.95 and 9.1(s，2H，脒)实施例17
按实施例16的方法将实施例6的产物(25mg)用氯化氢(气体)饱和的乙醇溶液处理生成白色固体的本标题化合物(20mg)。
FAB-MS(M+H)+＝552.5.1H-NMR(DMSO-d6)1.18(t，3H，CH3)，4.05(m，2H，-OCH2-)，4.35 and 5.05(d，2H，异山梨醇)，4.5(q，1H，α-CH)4.92 and 5.5(m，2H，异山梨醇)，7.75(s，4H，苯基)，8.44(m，1H，NH)，8.75 and 9.15 (s，2H，脒)实施例18
按实施例16的方法将实施例7的产物用氯化氢(气体)饱和的乙醇溶液处理生成本标题化合物。实施例19
按实施例16的方法将实施例11的产物用氯化氢(气体)饱和的乙醇溶液处理得到本标题化合物。实施例20
按实施例16的方法将实施例12的产物用氯化氢(气体)饱和的乙醇溶液处理得到本标题化合物。实施例21
将实施例16的方法将实施例9的产物用氯化氢(气体)饱和的乙醇溶液处理得到本标题化合物。实施例22
按实施例16的方法将实施例14的产物用氯化氢(气体)饱和的乙醇溶液处理得到本标题化合物。生物学将上述发明的化合物用在富血小板血浆(PRP)中的体外人血小板聚集试验法和对纯化的人纤维蛋白原及玻连蛋白受体的竞争性固相结合试验法进行试验。富血小板血浆中的体外人血小板聚集试验至少两星期没有接受抗血小板药物的健康男性或女性供血者，抽血前禁食8小时，然后用蝶形针和含有3ml 0.129M的柠檬酸钠缓冲液(3.8％)的30ml塑料注射器收集30ml全血。抽血时小心地转动注射器以使与柠檬酸盐混合。通过室温下在250×g下离心12分钟后不加制动使离心机自然停止的方法制备富含血小板的血浆(PRP)。从血中用塑料吸管吸出富含血小板血浆并将其放入室温下的50ml康宁锥形无菌带塑料盖的离心试管中。通过将除去PRP而将余下的血液在室温下于2000×g离心15分钟，不加制动而使离心机自然停下，制得贫血小板血浆(PPP)。用PPP将PRP调至含血小板数为每ml 2-3×108个。将450μl的PRP制品和50μl要试验的化合物或盐水于37°下在Payton集合度计(Payton科学公司，布法罗，N.Y(Payton Scientific，Inc.，Buffalo，N.Y.))中预温育1分钟。将50μl的腺苷5′-二磷酸(ADP)(200mM)加到样品池中并监测聚集过程1分钟。所有化合物均进行双份试验。按下式计算结果对照百分数＝[(最大光密度-化合物的起始光密度)/(最大光密度-对照盐水的起始光密度)]×100。抑制率(％)＝100-(对照百分数)。所试验化合物及其用半数抑制浓度(IC50)表示的活性结果记录在表1中。
表1对人的富含血小板血桨中ADP诱导的血小板聚集的抑制化合物 IC50[μM]实施例3 2.0实施例5 2.0实施例6 0.4实施例8 0.3固相受体试验这些试验基本上与上述报道的相同。用含有1.0mM Ca2+，Mg2+和Mn2+的pH7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水(TBS+++)将纯化的人的玻连蛋白受体(αvβ3)或纯化的人的纤维蛋白原受体(IIbβ3)从原溶液稀释为1.0μg/ml的溶液。立刻将稀释后的受体转移到每孔100μl的Linbro微量滴板中(100ng受体/孔)。将该板密封后在4℃保温过夜以便使受体与孔结合。以后所有步骤都在室温下进行。将试验板腾空并加入200μl的1％放射免疫测定级的牛血清白蛋白TBS+++溶液(TBS+++/BSA)以便封闭暴露的塑料表面。温育2小时后用TBS+++藉助96孔板洗涤器洗涤试验板。用2nM的生物素化的玻连蛋白在TBS+++/BSA中的溶液为稀释剂，将起始浓度为2mM的试验化合物和对照物按对数级稀释。所标记的配体与试验(或对照)的配体预先的混合以及随后将其50μl小份液样转移到试验板中是用CETUS自动加样器(CETUS Propette robot)进行的；最终标记的配体浓度是1nM而试验化合物的最高浓度是1.0×10-4M。竞争反应进行2小时后用板洗器如前一样洗涤所有的孔。同样，亲合纯化的辣根过氧化物酶所标记的山羊抗生物素抗体用TBS+++/BSA稀释成1∶3000并向每孔中加125μL。30分钟后，冲洗该板并与邻苯二胺/H2O2底物在pH5.0 100mM/L的柠檬酸缓冲溶液中温育。用微量滴定板读数器在450nm波长处读板并当最大结合的对照孔达到约为1的吸光度时，记录最终的A450用于分析。使用一个为了与EXCELTM电子数据表程序一起使用而书写的宏指令对数据进行分析。测定双份浓度样本的均数值，标准偏差和百分变异系数。A450均数值对4个最大结合的对照(没加竞争剂)的平均值进行规一化。该规一化数值按半对数比例作图，进行四参数曲线拟合计算，并报道算出的IC50值和相应的相关系数。将纤维蛋白原的肽片断，GRGDSP装入每一板中温育作阳性对照。
表2对纯化的人的纤维蛋白原和玻连蛋白受体的竞争性结合试验化合物 IC50[nM]纤维蛋白原受体玻连蛋白受体实施例3 3.11 ＞100,000实施例5 1.28 ＞100,000实施例6 0.25 ＞100,000实施例8 0.71 ＞100,000根据上述，本领域的技术人员很容易明确本发明的基本特点，在不改变其精神和范围的情况下，对本发明可进行各种变化和修改以使其适合各种应用和情况。
权利要求
1.具有式I结构的化合物或药学上适用的其盐
其中；A独立地选自以下基团
其中虚线代表单键或双键和B选自羰基或亚氨基羰基；W选自氢，低级烷基，低级链烯基，低级炔基，脂环烃基和芳香烃基，其中所说的所有取代基任选羟基，低级烷基，低级烷氧基，卤素，硝基，氨基，酰氧基，可用卤素、硝基、低级烷氧基、和低级烷基任选取的苯基和萘基所取代；Z，Z′独立地选自氢，卤素，氰基，磺酰基，羟基，低级烷氧基，和低级烷基；X是羰基，脂环或杂环基；Y是硝酸酯基(ONO2)，亚硝酸酯基(ONO)，S-亚硝基-半胱氨酸，S-亚硝基-青霉胺或下列基团之一
其中R是氧或亚氨基；n是1到约4的整数。
2.权利要求1中列举的化合物，其中；A选自
其中虚线代表单键或双键；B选自羰基或亚氨基羰基；W选自氢，1到约6个碳原子的低级烷基，2到约6个碳原子的低级烯基，3到约6个碳原子的脂环烃基，和6到约12个碳原子的芳香烃基，其中所说的所有基团均可任选用羟基，低级烷氧基，低级烷基，卤素，硝基，氨基，和酰氧基所取代；Z，Z′独立地选自氢，卤素，氰基，磺酰基，羟基，低级烷基和低级烷氧基；X是羰基，脂环或杂环基；Y是硝酸酯基(ONO2)，亚硝酸酯基(ONO)，S-亚硝基-半胱氨酸，S-亚硝基-青霉胺或下列基团之一
其中R是氧或亚氨基；和n是1到约4的整数。
3.权利要求2中列举的化合物，其中；A选自
其中虚线代表单键或双键；B选自羰基或亚氨基羰基；W选自氢，1到约6个碳原子的低级烷基，3到约6个碳原子的脂环烃基，和6到约12个碳原子的芳香烃基，其中所说的所有基团均可任选用羟基，低级烷氧基，低级烷基，卤素，硝基，氨基，和酰氧基所取代；Z，Z′独立地选自氢，卤素，烷氧基，和低级烷基；X是羰基或脂环基；Y是硝酸酯基(ONO2)，亚硝酸酯基(ONO)，S-亚硝基-半胱氨酸，S-亚硝基-青霉胺或下列基团之一
其中R是氧或亚氨基；和n是1到约3的整数。
4.权利要求3中列举的化合物，其中A是
其中的虚线代表单键或双键；B选自羰基或亚氨基羰基；W选自氢，甲基，乙基，丙基，环己基；Z，Z′选自氢和羟基；X是羰基或脂环基；Y是硝酸酯基(ONO2)，亚硝酸酯基(ONO)，S-亚硝基-半胱氨酸，S-亚硝基-青霉胺或下列基团之一
其中R是氧或亚氨基；和n是1-3的整数。
5.权利要求4中列举的化合物，其中A是
其中虚线代表单键或双键和B是羰基；W选自氢，乙基和环己基；Z，Z′是氢；X是羰基；Y是下列基团之一
其中R是氧；和n是1-2的整数。
6.一种药物组合物，其中包括权利要求1，2，3，4，或5的一种化合物和至少一种无毒的药学上适用的载体。
7.一种治疗哺乳动物的方法，用来抑制需要该治疗的哺乳动物的血小板聚集和促进血管扩张作用，该方法包括给哺乳动物有效治疗量的至少一种权利要求1，2，3，4或5的化合物。
全文摘要
本发明公开了具有供给一氧化氮性质的新的脒衍生物,其每一化合物都具有抑制血小板聚集和增强血管扩张的作用。
文档编号A61P7/02GK1189833SQ96195239
公开日1998年8月5日 申请日期1996年5月15日 优先权日1995年5月15日
发明者M·G·库尔里, F·S·乔恩, M·E·祖佩克 申请人:G.D.瑟尔公司