专利名称：多肽过渡金属盐以及增强多肽抗hiv活性的方法
技术领域：
本发明涉及脂多糖类，特别是对内毒素具有较强的亲和性的多肽的过渡金属盐，更具体的说，本发明涉及通过将该多肽制成过渡金属盐稳定的高度的显示出多肽所具有的抗病毒效果(例如抗HIV效果)的活性增强法以及以该多肽的过渡金属盐为活性成分用于抑制病毒特别是HIV的活动的制药学组合物和制剂学组合物。
背景技术：
如下述文献所述，汇报了以前从鲎分离对内毒素具有亲和性、抗菌性的2族多肽。
参见例如Shigenaga等，J.Biol.Chem.,265:21350～21354(1990)；Kawano等，J.Biol.Chem.,265:15365～15367(1990)；Muta等，J.Biochem.,108:261～266(1990)；特开平2-167230号公报；特开平2-152987号公报；特开平2-53799号公报；USP5068314(公告特许公报平2-500194)；Miyata等，J.Biochem.,106:663～668(1989)；Akaji等，Chem.Pharm.Bull.37:2661～2664(1989)；Tokunaga和Iwanaga,代谢，26:429～439(1989)；Shieh等，FEBSLett.,252:121～124(1989)；Nakamura等，J.Biol.Chem.,263:16709～16713(1989)。
一族(タキプレシン族)从日本产鲎Tachypleus属分离出来鉴定为TachypleusⅠ、Ⅱ和Ⅲ。另一族(ポリフェムシン族)从美国产鲎Limulus polyphemus分离出来鉴定为polyphemusⅠ和Ⅱ。
另外发现Tachypleus、polyphemus两族都在低浓度下抑制革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的任何一种或白色假丝酵母(Candidaalbicans)类的真菌的发育，形成细菌脂多糖和复合体。〔Shigenaga等，J.Biol.Chem.,265:21350～21354(1990)；Muta等，J.Biochem.,108:216～266(1990)〕。
另外，发现Tachypleus族的多肽对流感病毒、水疱性口内炎病毒〔Murakami等，Chemotherapy,37:327～334(1991)〕或人类免疫缺陷病毒〔Morimoto等，Chemotherapy,37:206～211(1991)〕等病毒中有的种具有抑制作用。
一方面希望开发一种与高度分化的人的生存维持有关，对于人类免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的后天性免疫缺陷综合症(AIDS)的发病有预防或治疗效果的药剂。
本发明者已经对这些内毒素亲和性多肽的结构变换与抗人类免疫缺陷病毒(抗HIV)活性的关系进行了研究，发现鲎的多肽的共同结构基本不同的一系列具有高的抗HIV活性的多肽群，并公开了以下文献。〔Nakashima等，Antimicrob.Agents Chemother.,36:1249～1255(1992)；Masuda等，Biochem.Biophys.Res.Commun.,189:845～850(1992)；Tamamura等，Chem.Pharm.Bull.,41:978～980(1993)；Tamamura等，Biochim.Biophys.Acta,1163:209～216(1993)；Masuda等，J.Pharmacobio.Dyn.,15:s-90(1992)；USP5571892(PCT国际公开公报WO92/04374号)；USP5449752(日本国特许公开公报特开平5-163298号公报)〕当初以从鲎得来的多肽的基本结构为模型，由于氨基酸16～18残基构成的多肽显示出抗HIV病毒活性对其必要结构进行了研究，根据其结果本发明者进一步提出了以最小必需结构概念为中心的改进发明〔PCT国际公开公报WO95/10534号〕。
本发明者将基于上述发明以鲎的多肽作为基准物质得到的具有抗HIV活性的先导化合物·多肽的结构概念集约成下式〔Ⅰ〕123 4 56 7 8 9 10 11 1213 14 15A1-A2-Cys-A2-A3-A3-X-Y-Z-A2-A3-A3-Cys-A3-A4………〔Ⅰ〕(序列号1)〔式中A1表示独立的选自Lys、Arg和Orn的碱性氨基酸残基；具有至少2个上述碱性氨基酸的肽残基；上述碱性氨基酸残基或上述肽残基的氨基酸末端氨基酸残基的N-α氢原子被酰基或取代硫代氨基甲酰基取代的N-α取代氨基酸残基或N-α取代肽残基，A2表示独立的选自Phe、Trp和Tyr的氨基酸残基，A3表示独立的选自Arg、Lys和Orn的碱性氨基酸残基，A4表示-OH(来源于羧基)或-NH2(来源于酰氨基)
X表示A2的1个氨基酸通过肽键连接在选自Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Met和Cys的1个氨基酸残基的次位上的有2个氨基酸残基的肽残基，Y表示Gly和A3的1个氨基酸残基组合成的有2个氨基酸残基的肽残基，或Pro和选自D-Arg、D-Lys及D-Orn的1个氨基酸残基组合成的有2个氨基酸残基的肽残基，Z表示Cys通过肽键连接在选自Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Met和A2的l个氨基酸残基的次位上形成的有2个氨基酸残基的肽残基，通过肽键连接的X-Y-Z残基的6位和10位的各氨基酸残基通过肽键连接起来，或者也可以由于XZ的同时缺失Y残基的6位和10位的各残基通过肽键连接起来，这时，构成Y的氨基酸的D-Lys、L-Lys、D-Orn或L-Orn的侧链ω-氨基的氢原子也可以被ω-氨基酰基取代〕。
正如已经明确指出的一样，具有上述式〔Ⅰ〕的结构时显示出高的抗HIV活性，而且即使对特定部位进行修饰活性也不会降低，可以通过对其进行修饰使具有基本结构的多肽的物理化学性质或治疗用法在很宽的范围内选择成为可能，例如增减亲水性、亲油性、选择的在特定组织、脏器、细胞积聚或增减其在体内的滞留时间的方法或剂型的展开。式〔Ⅰ〕所包含的多肽中，其自身具有较高的抗HIV活性的化合物如表1所示。
表1序号[Ⅰ] 123 4 5 6 7 8 9 10 11 1213 14 15A1-A2-Cys-A2-A3-A3-X-Y-Z-A2-A3-A3-Cys-A3-A4(序列号1)12 3 4 5 6 7 8 910 11 12 13 14 15(1) Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Lys-Gly-Tyr-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2(序列号2)12 3 4 5 6(7) 8 (9) 10 11 12 13 14 15(2) Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys---------DLys-Pro--------Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2(3) Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Arg-Gly-Ile-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2(序列号3)(4) Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Arg-Gly-Ile-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2(序列号4)(5) Ac-Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Arg-Cly-Ile-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2(序列号4)(6) Parm-Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Lys-Gly-Ile-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2(序列号5)(7) FTC-Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Lys-Gly-Tyr-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2(序列号2)表1(续)12 3 4 5 6(7) 8 (9) 10 11 12 13 14 15(8)Myr-Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Lys-Gly-Tyr-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2(序列号2)(9)Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-DLys-Pro-Tyr-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2(10) Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Pro-DLys-Ile-Cys-Tyr-Arg-Arg-Cys-Arg-NH2
(12) FTC-Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys---------DLys-Pro---------Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2
在本发明者对式〔Ⅰ〕表示的多肽表现出特异的抗HIV活性的理由进行研究的过程中，得知了该多肽和过渡金属形成盐可以保持多肽具有稳定的较高的抗HIV活性的事实，完成了本发明。
本发明的第1个目的是提供一种具有抗病毒活性的有特定结构式的多肽的新的过渡金属盐，第2个目的是提供一种通过将该多肽制成过渡金属盐增强生理活性特别是抗HIV活性等抗病毒活性，并且作为治疗剂在制剂学上具有稳定的活性的方法和制剂学组合物。
发明公开本发明涉及脂多糖，特别是对内毒素具有很强的亲和性的式〔Ⅰ〕所表示的多肽的过渡金属盐，进一步的说，本发明涉及通过将该多肽制成过渡金属盐稳定的高度的显示出多肽所具有的抗病毒效果(例如抗HIV效果)的活性增强法。
也就是说，本发明提供(1)多肽过渡金属盐化合物或该多肽过渡金属盐化合物的酸加成盐，该多肽过渡金属盐化合物是下式123 4 56 7 8 9 10 11 1213 14 15A1-A2-Cys-A2-A3-A3-X-Y-Z-A2-A3-A3-Cys-A3-A4………〔Ⅰ〕(序列号1)〔式中A1表示独立的选自Lys、Arg和Orn的碱性氨基酸残基；具有至少2个上述碱性氨基酸的肽残基；上述碱性氨基酸残基或上述肽残基的氨基酸末端氨基酸残基的N-α氢原子被酰基或取代硫代氨基甲酰基取代的N-α取代氨基酸残基或N-α取代肽残基，A2表示独立的选自Phe、Trp和Tyr的氨基酸残基，A3表示独立的选自Arg、Lys和Orn的碱性氨基酸残基，A4表示-OH(来源于羧基)或-NH2(来源于酸酰氨基)X表示A2的1个氨基酸通过肽键连接在选自Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Met和Cys的1个氨基酸残基的次位上的有2个氨基酸残基的肽残基，Y表示Gly和A3的1个氨基酸残基组合成的有2个氨基酸残基的肽残基，或Pro和选自D-Arg、D-Lys及D-Orn的1个氨基酸残基组合成的有2个氨基酸残基的肽残基，
Z表示Cys通过肽键连接在选自Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Met和A2的1个氨基酸残基的次位上形成的有2个氨基酸残基的肽残基，通过肽键连接的X-Y-Z残基的6位和10位的各氨基酸残基通过肽键连接起来，或者也可以由于XZ的同时缺失Y残基的6位和10位的各残基通过肽键连接起来，这时，构成Y的氨基酸的D-Lys、L-Lys、D-Orn或L-Orn的侧链ω-氨基的氢原子也可以被ω-氨基酰基取代〕所表示多肽化合物和过渡金属形成的盐。(2)如(1)的多肽过渡金属盐化合物或该多肽过渡金属盐的酸加成盐，与过渡金属形成的盐是络合物。(3)如(1)或(2)的多肽过渡金属盐化合物或多肽过渡金属盐化合物的酸加成盐，过渡金属是选自铁族(Fe、Co、Ni)、铜族(Cu、Ag、Au)、锌族(Zn、Cd、Hg)和锰族(Mn、Tc、Re)的过渡金属。(4)显示出下式123 4 56 7 8 9 10 11 1213 14 15A1-A2-Cys-A2-A3-A3-X-Y-Z-A2-A3-A3-Cys-A3-A4………〔Ⅰ〕(序列号1)〔式中A1表示独立的选自Lys、Arg和Orn的碱性氨基酸残基；具有至少2个上述碱性氨基酸的肽残基；上述碱性氨基酸残基或上述肽残基的氨基酸末端氨基酸残基的N-α氢原子被酰基或取代硫代氨基甲酰基取代的N-α取代氨基酸残基或N-α取代肽残基，A2表示独立的选自Phe、Trp和Tyr的氨基酸残基，A3表示独立的选自Arg、Lys和Orn的碱性氨基酸残基，A4表示-OH(来源于羧基)或-NH2(来源于酰氨基)X表示A2的1个氨基酸通过肽键连接在选自Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Met和Cys的1个氨基酸残基的次位上的有2个氨基酸残基的肽残基，Y表示Gly和A3的1个氨基酸残基组合成的有2个氨基酸残基的肽残基，或Pro和选自D-Arg、D-Lys及D-Orn的1个氨基酸残基组合成的有2个氨基酸残基的肽残基，Z表示Cys通过肽键连接在选自Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Met和A2的1个氨基酸残基的次位上形成的有2个氨基酸残基的肽残基，
通过肽键连接的X-Y-Z残基的6位和10位的各氨基酸残基通过肽键连接起来，或者也可以由于XZ的同时缺失Y残基的6位和10位的各残基通过肽键连接起来，这时，构成Y的氨基酸的D-Lys、L-Lys、D-Orn或L-Orn的侧链ω-氨基的氢原子也可以被ω-氨基酰基取代〕所表示的多肽化合物抗HIV作用活性的方法，通过与过渡金属形成盐显示出较高的抗HIV作用和稳定的活性。(5)含有有效量的(1)所述的多肽过渡金属盐化合物或该多肽过渡金属盐化合物的酸加成盐以及制药学载体的制药学或制剂学组合物。(6)用于抑制病毒活动的(5)的组合物。(7)用于抑制患者体内HIV活动的(5)的组合物。
上述取代N-a位的氢原子的酰基可以是碳原子数为2～18的酰基，具体的说例如乙酰基、丙酰基、丁酰基、己酰基、辛酰基、癸酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基、烟酰基等。上述取代N-α位氢原子的取代硫代氨基甲酰基的取代基有荧光素、苯基、取代苯基(例如二甲氨基苯基偶氮苯基等)。
上述取代构成Y的氨基酸的D-Lys、L-Lys、D-Orn或L-Orn的侧链ω-氨基上氢原子的ω-氨基酰基可以是碳原子数为2～6的ω-氨基酰基，具体的说例如ω-氨基乙酰基、ω-氨基丁酰基、ω-氨基己酰基等。
这里规定的多肽序列中，各标记是按照国际上承认的由三个字母表示的氨基酸残基或取代的氨基酸残基。即各个标记表示下述氨基酸或取代的氨基酸的残基。
Ala(丙氨酸)；Arg(精氨酸)；Cys(半胱氨酸)；Ile(异亮氨酸)；Gly(谷氨酸)；Leu(亮氨酸)；Ser(丝氨酸)；Met(甲硫氨酸)；Lys(赖氨酸)；Orn(鸟氨酸)；Phe(苯丙氨酸)；Pro(脯氨酸)；Trp(色氨酸)；Tyr(酪氨酸)；Val(缬氨酸)；DArg(D-精氨酸)；Dlys(D-赖氨酸)；DOrn(D-鸟氨酸)；Ac-Arg(N-α-乙酰基精氨酸)；FTC-Arg(N-a-荧光素硫代氨基甲酰基精氨酸)；Laur--Arg(N-α-月桂酰基精氨酸)；Myr-Arg(N-α-肉豆蔻酰基精氨酸)；Nicot-Arg(N-α-烟酰基精氨酸)；Oct-Arg(N-α-辛酰基精氨酸)；Parm-Arg(N-α-棕榈酰基精氨酸)；Parm-Orn(N-α-棕榈酰基鸟氨酸)；PTC-Arg(N-α-苯基硫代氨基甲酰基精氨酸)；ε-N-Ac-DLys(ε-N-ω-氨基乙酰基-D-赖氨酸)和ε-N-But-DLys(ε-N-ω-氨基丁酰基-D-赖氨酸)。
本发明是基于上述观点完成的，提供了一种多肽化合物的盐，该多肽化合物的盐是包含如下式〔Ⅰ〕123 4 56 7 8 9 10 11 1213 14 15A1-A2-Cys-A2-A3-A3-X-Y-Z-A2-A3-A3-Cys-A3-A4………〔Ⅰ〕(序列号1)〔式中A1表示独立的选自Lys、Arg和Orn的碱性氨基酸残基；具有至少2个上述碱性氨基酸的肽残基；上述碱性氨基酸残基或上述肽残基的氨基酸末端氨基酸残基的N-α氢原子被酰基或硫取代氨基甲酰基取代的N-α取代氨基酸残基或N-α取代肽残基，A2表示独立的选自Phe、Trp和Tyr的氨基酸残基，A3表示独立的选自Arg、Lys和Orn的碱性氨基酸残基，A4表示-OH(来源于羧基)或-NH2(来源于酰氨基)X表示A2的1个氨基酸通过肽键连接在选自Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Met和Cys的1个氨基酸残基的次位上的有2个氨基酸残基的肽残基，Y表示Gly和A3的1个氨基酸残基组合成的有2个氨基酸残基的肽残基，或Pro和选自D-Arg、D-Lys及D-Orn的1个氨基酸残基组合成的有2个氨基酸残基的肽残基，Z表示Cys通过肽键连接在选自Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Met和A2的1个氨基酸残基的次位上形成的有2个氨基酸残基的肽残基，通过肽键连接的X-Y-Z残基的6位和10位的各氨基酸残基通过肽键连接起来，或者也可以由于XZ的同时缺失Y残基的6位和10位的各残基通过肽键连接起来，这时，构成Y的氨基酸的D-Lys、L-Lys、D-Orn或L-Orn的侧链ω-氨基的氢原子也可以被ω-氨基酰基取代〕所表示的多肽化合物与选自铁族、铜族、锌族和锰族的过渡金属形成的盐，过渡金属盐的形态是络合物，其目的是提供一种能使具有较高抗HIV效果的式〔Ⅰ〕多肽化合物的活性稳定的而且高度的显示出来的盐形成物和活性增强法。
下面对本发明的新的多肽过渡金属盐化合物进行详细的说明。
多肽的制备本发明中如式〔Ⅰ〕所表示的多肽可以按照其本身公知的方法(例如Stewart&Young著，皮尔斯化学公司发行，罗克福德，伊利诺伊州(1984)“固相肽合成法”中记载的固相合成方法)制造。当式〔Ⅰ〕中A1上的氨基酸末端氨基酸残基的N-α位氢原子被酰基取代成为N-α-酰基氨基酸残基或N-α-酰基肽残基时，使直链状式〔Ⅰ〕的多肽与不溶性树脂结合制备成多肽树脂，使用缩合剂使该多肽树脂与相当于酰基的酸酐或羧酸进行反应，将N末端的氨基酰基化，形成N-酰基化多肽树脂，然后使不溶性树脂和氨基酸的保护基脱离，制得直链状式〔Ⅰ〕的多肽。当式〔Ⅰ〕中A1上的氨基末端N-α位氢原子被取代硫代氨基甲酰基取代成为N-α-取代硫代氨基甲酰基化氨基酸残基或N-α-取代硫代氨基甲酰基化肽残基时，通过使上述多肽与取代异硫氰酸酯化合物在微碱性条件下进行反应，可以得到本发明的N末端N-α取代硫代氨基甲酰基化多肽。
得到的多肽14位氨基酸残基的羧基末端是游离的(A4相当于-OH)，也可以变换为酰胺基(A4相当于-NH2)。
上述固相合成法中使用的各氨基酸如果没有特别的说明都是L构型，与构成8位Y的脯氨酸成对的碱性氨基酸限定为D构型。
至于其它的方法，本发明的多肽也可以按照重组DNA方法制得。也就是说，可以将形成线性的本发明多肽的碱基序列的多核苷酸克隆，利用已经公知的技术制得该多肽。
参考例如Maniatis等，Molecular Cloning,A LaboratoryMannual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY,1991。
因此，得到的多肽可以按照多肽其本身公知的分离纯化手段进行分离纯化，例如提取、重结晶、各种色谱分离法(凝胶过滤、离子交换、分配、吸附、反相)、电泳、逆流分配等，采用反相高效液相色谱法最有效。
采用这些制法的具体实施例可以参见已经公开的USP5571892(国际公开公报WO92/04374号)；USP5449752(特开平5-163298号公报)和国际公开公报WO95/10534号的说明书。
式〔Ⅰ〕所本身的多肽分子内包含Cys残基、Arg残基、Lys残基，通过观察其立体结构可以得知至少有1对Cys残基或Arg残基在立体结构的同一侧面形成-SH侧链或胍基侧链的构型，该侧链容易与过渡金属形成稳定的络合物。但是，通常由于该多肽氧化形成-S-S-构型后更容易与过渡金属形成络合物，因此在形成络合物时优选预先以-SH(还原)型与过渡金属形成盐。
例如，可以通过在该还原型的醋酸盐的中性水溶液中加入过渡金属的盐至少2当量以上，优选过渡金属与有机酸或无机酸形成的水溶性盐(例如醋酸锌)，从而与过渡金属形成盐。
本发明式〔Ⅰ〕所表示的多肽过渡金属盐化合物具有非常强的碱性。
由于其强碱性的原因，通过与酸加成形成加成盐。与药学上可接受的酸例如无机酸(盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸等)；有机羧酸(醋酸、卤代醋酸如三氟醋酸、丙酸、马来酸、琥珀酸、苹果酸、枸橼酸、酒石酸、水杨酸等)；葡糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖酸、抗坏血酸等酸性糖类；包括透明质酸、硫酸软骨素类、海藻酸等硫酸多糖在内的酸性多糖或有机磺酸(甲磺酸、对苯甲磺酸等)形成盐。本发明上述式〔Ⅰ〕所表示的多肽的过渡金属盐可以将其与药学上可接受的酸形成的加成盐用于制药学组合物。
式〔Ⅰ〕所表示的多肽的过渡金属盐化合物具有结合内毒素的能力、抗菌活性及内毒素感染血球溶血性。此外，本发明的多肽过渡金属盐化合物还具有非常高的抗病毒活性。作为实施方式，本发明的多肽过渡金属盐化合物具有抗HIV活性。
本发明涉及的药剂特别是抗HIV剂是作为药物组合物进行制备的，该药物组合物含有作为有效成分的式〔Ⅰ〕所表示的多肽过渡金属盐化合物或该多肽过渡金属盐化合物与药学上可接受的酸形成的加成盐以及根据给药方法和给药方式可以选择的药学上可接受的载体。作为药学上可接受的载体，例如Hank’s或Ringer’s溶液、生理盐水、葡萄糖生理盐水或其混合液以及已知的生理缓冲液肝素化枸橼酸/枸橼酸碳酸钠盐/葡萄糖溶液。另外，本发明的抗HIV剂，根据生物体内病毒疾病或生物体表等的生物体外病毒感染部位的治疗或消毒对象，可以经口或非经口给药，根据其给药方法选择适当的药物载体，制成粉末、颗粒、注射液或口服液、片剂、栓剂、阴道栓剂、软膏、霜剂、气溶胶等制剂。
实施例下面结合实施例对本发明作出更具体的说明，但本发明并不因此受到任何限定。
在下述实施例中说明了多肽(1)和多肽(2)的过渡金属盐的制造例和该多肽过渡金属盐的抗HIV活性检测结果，以及已知的内毒素亲和性多肽的这些内容。
实施例1多肽(1)锌络合物的制备下式所表示的多肽(1)按照USP5571892(PCT国际公开公报WO92/04374号)、USP5449752(日本特许公开公报特开平5-163298)记载的方法合成制备。123 4 56 7 8 9 10 11 1213 14 15A1-A2-Cys-A2-A3-A3-X-Y-Z-A2-A3-A3-Cys-A3-A4………〔Ⅰ〕(序列号1)12 3 4 5 6 7 8 910Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Lys-Gly-Tyr-Cys-Tyr-11 12 13 14 15Arg-Lys-Cys-Arg-NH2………(1)(序列号2)1.1多肽(1)的还原型的制备；将按照上述PCT国际公报等制得的多肽(1)醋酸盐(10.2mg，3.37μmol)溶于纯化水(0.5ml)中。在该溶液中加入相对于多肽(1)50倍当量的二硫苏糖醇(生化学工业(株)生产)(26.0mg,169μmol)，通入氮气，在氮气流下，室温条件下搅拌2小时。用HPLC追踪该还原反应进行的状况，确认还原反应进行完全。
将还原反应结束后得到的该反应溶液置于预先用25％醋酸水溶液平衡过的交联葡聚糖(Sephadex)G-25(细小的)(ファルマシァバィォテク(株))柱(2.5×70cm)中，用同样的25％醋酸水溶液解脱，进行分级分离(1级分=224滴)。收集埃尔曼反应〔G.L.Ellman,Arch.Biochem.Biophys.,82,70(1995)，硫醇基检测法〕和荧光胺反应〔A.M.Felix等，J.Chromatogr.,89,361(1974)，胺基的荧光检测法〕为阳性的级分号为26和27的级分，将该级分溶液减压浓缩，用10％醋酸水溶液稀释后将该溶液冷冻干燥，得到目的产物多肽(1)还原型醋酸盐。
产量6.8mg(收率67％)1.2对多肽(1)的还原型的分析；按照Liu等的方法〔T.-Y.Liu等，J.Biol.Chem.,251,1936(1976)〕，将由1.1得到的多肽(1)的还原型醋酸盐置于含有0.2％色胺的4M甲磺酸中，在115℃条件下酸加水分解24小时。其氨基酸的组成与多肽(1)还原型的氨基酸组成很一致。
得到的多肽(1)的还原型醋酸盐的比旋光度〔α〕20D为-26.0°(c=0.09,1M醋酸水溶液)。
而且，用在下述条件下的HPLC分析得到的多肽(1)的还原型醋酸盐，出现单峰。
<HPLC分析条件和结果>
柱TSK gel ODS-120T(0.46×15cm)(东ソ-(株))+TSK gurd gel ODS-120T(0.32×1.5cm)(东ソ-(株))梯度溶出溶出液10％乙腈/0.1％三氟醋酸(A液)80％乙腈/0.1％三氟醋酸(B液)梯度条件梯度时间 B液浓度 A液浓度1.0分 0％ 10％29.4分42％ 39.4％35.0分100％80％温度40℃流速0.8ml/分检测220nm和280nm用量5μl(肽浓度1mg/ml)洗脱时间多肽(1)的还原型醋酸盐19.27分多肽(1)的醋酸盐18.24分1.3多肽(1)还原型与锌(Ⅱ)离子的络合物的制备；将1.1得到的多肽(1)还原型醋酸盐溶于精制水或1M醋酸铵缓冲液(pH7.2)。
在该水溶液或缓冲液溶液中加入相当于多肽(1)还原型的2当量锌(Ⅱ)离子的0.005M醋酸锌水溶液。将最终的多肽浓度调整为5mg/ml，得到多肽(1)还原型与锌(Ⅱ)离子形成的络合物溶液。
1.4采用离子喷雾质谱分析法对多肽(1)还原型和锌(Ⅱ)离子形成的络合物进行的结构确认；取出由1.3得到的多肽(1)还原型和锌(Ⅱ)离子形成的络合物的一部分，将该溶液作为结构解析的检测溶液，在下述条件下采用离子喷雾质谱分析法进行结构分析。
<离子喷雾质谱分析条件>
装置三重等级四重极型质谱仪APⅢE型(Perkin-Elmer Sciex公司产品；宝酒造(株)处理)样品注入使用Harvard Apparatus syringe infusion pump22(South Natick,MASS)，以5μl/分的流速注入喷嘴(ォリイフィス)电压130V质谱范围等荷质比(m/n)600-1800(分成0.5amu.的阳离子模型片段，平均30次扫描)所得数据的分析用Macspec3.22(Sciex)分析<离子喷雾质谱分析结果>
分别观察电荷状态为2+和3+的荷质比(m/z:1277.00及851.67)，其再构成荷质比(m/z:2552.48)与多肽(1)+Zn-4H的计算荷质比(m/z:2552.40)非常一致。也就是说明还原多肽(1)和锌(Ⅱ)离子形成了多肽∶Zn=1∶1的络合物。<讨论>
已经报道过通过离子喷雾质谱分析或电子喷雾质谱分析可以鉴定出多肽或蛋白与金属的络合物的结构。参照例如H.E.Witkowska等的糖皮质激素受体的DNA结合部位的锌指结构的分析〔J.Amer.Chem.Soc.,117,3319(1995)〕,T.W.Hutchens等的锌指蛋白部位的铜配位结构的分析〔FEBS Lett.,309,170(1992)〕以及关于离子喷雾质谱分析法的梅田总论〔蛋白质核酸酶，36,1665(1991)〕等。
在这次的试验中也可以通过离子质谱分析法鉴定出多肽(1)还原型和锌(Ⅱ)离子形成的络合物的结构。
1.5通过对多肽(1)还原型和锌(Ⅱ)离子形成的络合物进行紫外吸收光谱测定分析确认结构；取出一部分1.1得到的多肽(1)还原型的水溶液和1.3得到的由多肽(1)还原型与锌(Ⅱ)离子形成的络合物溶液，以这样的每种溶液作为结构解析的检测溶液，在下述条件下测定紫外吸收光谱及其差光谱，通过对之分析进行结构分析。<紫外吸收光谱测定>
仪器紫外可见分光光度计Ubest-30(日本分光(株))测定波长200-340nm试样将新制备的各检测液装入测定管中后，通入氮气立即测定通常的紫外吸收光谱对照液蒸馏水检测液多肽(1)还原型溶液及多肽(1)还原型与锌(Ⅱ)形成的络合物溶液紫外吸收差光谱对照液多肽(1)还原型溶液检测液多肽(1)还原型与锌(Ⅱ)离子形成的络合物溶液<紫外吸收光谱测定结果>
通常的紫外吸收光谱多肽(1)还原型溶液在构成多肽(1)的氨基酸中Trp的特征吸收250-300nm处有最大吸收峰。在278nm处有最大吸收峰且在280nm处有肩峰，这是由于Trp引起的特有的吸收。
多肽(1)还原型和锌(Ⅱ)离子形成的络合物溶液得到了250nm附近到200nm处在上述多肽(1)还原型溶液的吸收曲线的基础上加宽的吸收曲线。为了使吸收波长更加明确，测定了下述差光谱。
紫外吸收差光谱得到了以215-235nm范围为差吸收峰的差光谱。<得到的紫外吸收光谱的分析>
如上所述，如果在多肽(1)还原型溶液中加入锌(Ⅱ)离子，可以观察到以215-235nm为中心紫外吸收向宽增加。
其观察结果表明，如下述讨论所述，在多肽(1)还原型与锌(Ⅱ)离子的溶液中多肽(1)还原型的Cys中的SH基与锌(Ⅱ)离子通过硫醇盐配位键形成络合物。<讨论>
与重金属解毒有关的蛋白、金属硫蛋白已知如果其构成Cys残基的SH基与镉(Ⅱ)、锌(Ⅱ)、铜(Ⅰ,Ⅱ)、汞(Ⅱ)离子等通过硫醇配位键形成络合物，脱金属硫蛋白(SH)通过硫醇配位键结合金属，则由于各金属硫醇配位键在其特有的波长范围内紫外吸收有所增大。例如，与锌(Ⅱ)离子形成的硫醇配位体时，以220-230nm范围为中心紫外吸收向宽增加〔参见J.H.R.Kagi和B.L.Vallee,J.Biol.Chem,236,2435(1961)；M.Vasak等，Biochemistry,20,2852(1981)；A.R.Thrower等，J.Biol.Chem,263,7037(1988)；J.H.R.Kagi等，Environmental Health Perspectives,54,93(1984)等〕。由于该锌(Ⅱ)离子的硫醇配位键引起的向宽增加的紫外吸收范围(220-230nm)与上述对多肽(1)还原型与锌(Ⅱ)离子的溶液进行观察得到的差光谱的增大波长范围一致。
也就是说，在多肽(1)还原型与锌(Ⅱ)离子的溶液中多肽(1)还原型的Cys的SH基与锌(Ⅱ)离子形成了硫醇配位键。
1.6多肽(1)还原型与锌(Ⅱ)离子形成的络合物的抗HIV活性；取出一部分1.3得到的多肽(1)还原型与锌(Ⅱ)离子形成的络合物溶液，以该溶液作为抗HIV活性测定的检测溶液，测定抗HIV活性。
实施例2多肽(2)锌络合物的制备下式所表示的多肽(2)按照PCT国际公开公报WO95/10534号记载的方法合成制备。123 4 567 8 9 10 11 1213 14 15A1-A2-Cys-A2-A3-A3-(X)-Y-(Z)-A2-A3-A3-Cys-A3-A4………〔Ⅰ〕(序列号1)1 2 3 4 5 6 (7) 8(9) 10 11Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-----DLys-Pro-----Tyr-Arg12 13 14 15-Lys-Cys-Arg-NH2………(2)2.1多肽(2)的还原型的制备；将按照上述PCT国际公报等制得的多肽(2)醋酸盐(10.0mg,3.94μmol)溶于纯化水(0.5ml)中。在该溶液中加入相对于多肽(2)53倍当量的二硫苏糖醇(生化学工业(株)生产)(32.0mg，207.5μmol)，通入氮气，在氮气流下，室温条件下搅拌2小时。
用HPLC追踪该还原反应进行的状况，确认还原反应进行完全。
将还原反应结束后得到的该反应溶液置于预先用25％醋酸水溶液平衡过的交联葡聚糖G-25(细小的)(ファルマシァバィォテク(株))柱(2.5×70cm)中，用同样的25％醋酸水溶液洗脱，进行分级分离(1级分=224滴)。收集埃尔曼反应和荧光胺反应为阳性的级分号为25-27的组分，将该级分溶液减压浓缩，用10％醋酸水溶液稀释后将该溶液冷冻干燥，得到目的产物多肽(1)还原型醋酸盐。
产量9.8mg(收率98％)2.2对多肽(2)的还原型的分析；与1.2的多肽(1)的场合相同，按照Liu等的方法，将由2.1得到的多肽(2)的还原型醋酸盐置于含有0.2％色胺的4M甲磺酸中，在115℃条件下酸加水分解24小时。其氨基酸的组成与多肽(2)还原型的氨基酸组成很一致。
得到的多肽(2)的还原型醋酸盐的比旋光度〔α〕20D为-23.3°(c=0.04,1M醋酸水溶液)。
而且，在与1.2的多肽(1)的HPLC分析条件相同的条件下，HPLC分析得到的多肽(2)的还原型醋酸盐，出现单峰。
<HPLC分析结果>
溶出时间多肽(2)的还原型醋酸盐 16.14分多肽(2)的醋酸盐15.87分2.3多肽(2)还原型与锌(Ⅱ)离子形成的络合物的制备；将2.1得到的多肽(2)还原型醋酸盐溶于精制水或1M醋酸铵缓冲液(pH7.2)。
在该水溶液或缓冲液溶液中加入相当于多肽(2)还原型的1当量锌(Ⅱ)离子的0.005M醋酸锌水溶液。将最终的多肽浓度调整为5mg/ml，得到多肽(2)还原型与锌(Ⅱ)离子形成的络合物溶液。
2.4采用离子喷雾质谱分析法对多肽(1)还原型和锌(Ⅱ)离子形成的络合物进行的结构确认；取出由2.3得到的多肽(2)还原型和锌(Ⅱ)离子形成的络合物溶液的一部分，将该溶液作为结构解析的检测溶液，在1.4的多肽(1)还原型与锌(Ⅱ)离子形成的络合物的离子喷雾质谱分析时相同的条件下采用离子喷雾质谱分析法进行结构分析。<离子喷雾质谱分析结果>
分别观察电荷状态为2+和3+的荷质比(m/z:1030.50及687.34)，其再构成荷质比(m/z:2059.98)与多肽(1)+Zn-4H的计算荷质比(m/z:2059.83)非常一致。
也就是说明还原多肽(2)和锌(Ⅱ)离子形成了多肽∶Zn=1∶1的络合物。
2.5通过对多肽(2)还原型和锌(Ⅱ)离子形成的络合物进行紫外吸收光谱测定分析确认结构；取出一部分2.1得到的多肽(2)还原型的水溶液和2.3得到的由多肽(2)还原型与锌(Ⅱ)离子形成的络合物溶液，以这样的每种溶液作为结构解析的检测溶液，在与1.5的多肽(1)的场合相同的条件下测定紫外吸收光谱及其差光谱。<紫外吸收光谱测定>
通常的紫外吸收光谱对照液蒸馏水检测液多肽(2)还原型溶液及多肽(2)还原型与锌(Ⅱ)形成的络合物溶液紫外吸收差光谱对照液多肽(2)还原型溶液检测液多肽(2)还原型与锌(Ⅱ)离子形成的络合物溶液<紫外吸收光谱测定结果>
通常的紫外吸收光谱多肽(2)还原型溶液在构成多肽(2)的氨基酸中Trp的特征吸收250-300nm处有最大吸收峰。在278nm处有最大吸收峰且在280nm处有肩峰，这是由于Trp引起的特有的吸收。
多肽(2)还原型和锌(Ⅱ)离子形成的络合物溶液得到了250nm附近到200nm处在上述多肽(2)还原型溶液的吸收曲线的基础上稍稍加宽的吸收曲线。
紫外吸收差光谱得到了在215-235nm范围有差吸收峰的差光谱。<得到的紫外吸收光谱的分析>
如上所述，如果在多肽(2)还原型溶液中加入锌(Ⅱ)离子，可以观察到以215-235nm为中心紫外吸收向宽增加。
其观察结果表明，如下述讨论所述，在多肽(2)还原型与锌(Ⅱ)离子的溶液中多肽(2)还原型的Cys中的SH基与锌(Ⅱ)离子通过硫醇配位键(mercaptide bond)形成络合物。2.6多肽(2)还原型与锌(Ⅱ)离子形成的络合物的抗HIV活性；取出一部分2.3得到的多肽(2)还原型与锌(Ⅱ)离子形成的络合物溶液，以该溶液作为抗HIV活性测定的检测溶液，测定抗HIV活性。实施例3对人类免疫缺陷病毒(HIV)的抗病毒活性按照以下方法进行实验评价实施例1制得的多肽(1)锌络合物和实施例2制得的多肽(2)锌络合物对HIV的抗病毒活性。
将各种浓度的实验物质以及HIV感染MT-4细胞(2.5×104细胞/孔、感染多重度(MOI):0.001)感染之后加入到96孔的微滴定板上。在CO2恒温箱中，在37℃条件下培养5天后，用MTT法〔Pauwels等，J.Virol.Methods 20,309～321(1988)〕测定存活细胞数。抗病毒活性用能抑制50％感染HIV的细胞死亡的浓度来表示。另一方面，为了知道实验物质对MT-4细胞的细胞毒性，与上述相同相同的条件下，将非病毒感染细胞与各种浓度的实验物质一起进行培养。细胞毒性用引起50％细胞障碍的实验物质的浓度表示(CC50:50％细胞毒浓度)来表示。另外，CC50与EC50的概略比(CC50/EC50)用有效比(SI)表示。
抗HIV活性测定结果与其它化合物的结果一同如表2所示。
表2.各种化合物的抗HIV活性化合物 CC50(μg/ml)EC50(μg/m SI(CC50/1) EC50)多肽(1) 41.35 0.0047 8928多肽(1)+Zn++(2eq) 38.66 0.008 4808多肽(1)的还原型 41.27 0.0052 8011〔多肽(1)/2eq Zn++〕络合物 40.63 0.0013 30683多肽(2) 44.60 0.029 1565多肽(2)+Zn++(1eq) 38.93 0.033 1172多肽(2)的还原型 41.17 0.040 1034〔多肽(2)/1eq Zn++〕络合物 54.63 0.014 4052Zn++(μM) 0.48 0.15 3葡聚糖硫酸 ＞10000.68＞1480AZT(μM)1.930.00111716序列表序列号1序列长度14序列类型氨基酸拓扑学线性序列类型肽序列的特征存在位置1其它信息Xaa表示独立的选自Lys、Arg和Orn的碱性氨基酸残基；至少有2个上述碱性氨基酸的肽残基；上述碱性氨基酸残基或上述肽残基的氨基末端氨基酸残基的N-α位氢原子被酰基或取代硫代氨基甲酰基取代的N-α取代氨基酸残基或N-α取代肽残基。存在位置2其它信息Xaa表示独立的选自Phe、Trp和Tyr的氨基酸残基。存在位置4其它信息Xaa表示独立的选自Phe、Trp和Tyr的氨基酸残基。存在位置5,6其它信息Xaa表示独立的选自Arg、Lys和Orn的碱性氨基酸残基。存在位置7其它信息Xaa表示在选自Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Met和Cys的1个氨基酸残基的次位通过肽键结合了Phe、Trp或Tyr中的1个氨基酸的有2个氨基酸残基的肽残基。存在位置8其它信息Xaa表示Gly与Arg、Lys或Orn中的1个氨基酸残基组成的有2个氨基酸残基的肽残基，或Pro与选自D-Arg、D-Lys和D-Orn中的1个氨基酸残基组成的有2个氨基酸残基的肽残基。存在位置9其它信息Xaa表示Cys通过肽键结合在选自Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Met、Phe、Trp和Tyr中的1个氨基酸残基的次位形成的有2个氨基酸残基的肽残基。存在位置7,8,9其它信息通过肽键结合的Xaa-Xaa-Xaa残基可以分别与6位和10位的氨基酸残基通过肽键结合起来，也可以由于7位的Xaa和9位Xaa同时缺失，8位的Xaa残基分别与6位和10位的氨基酸残基通过肽键直接结合，这时8位Xaa的构成氨基酸D-Lys、L-Lys、D-Orn或L-Orn的侧链ω-氨基的氢原子也可以被ω-氨基酰基取代。存在位置10其它信息Xaa表示独立的选自Phe、Trp和Tyr的氨基酸残基。存在位置11,12其它信息
Xaa表示独立的选自Arg、Lys和Orn的碱性氨基酸残基。存在位置14其它信息Xaa表示独立的选自Arg、Lys和Orn的碱性氨基酸残基。序列Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa15 10序列号2序列长度18序列类型氨基酸拓扑学线性序列类型肽序列Arg Arg Trp Cys Tyr Arg Lys Cys Tyr Lys Gly Tyr Cys Tyr Arg1 5 10 15Lys Cys Arg序列号3序列长度17序列类型氨基酸拓扑学线性序列类型肽序列Arg Trp Cys Tyr Arg Lys Cys Tyr Arg Gly Ile Cys Tyr Arg Lys1 5 10 15Cys Arg序列号4序列长度18序列类型氨基酸拓扑学线性序列类型肽序列Arg Arg Trp Cys Tyr Arg Lys Cys Tyr Arg Gly Ile Cys Tyr Arg1 5 10 15Lys Cys Arg序列号5序列长度18序列类型氨基酸拓扑学线性序列种类肽序列Arg Arg Trp Cys Tyr Arg Lys Cys Tyr Lys Gly Ile Cys Tyr Arg1 5 10 15Lys Cys Arg
权利要求
1．多肽过渡金属盐化合物或该多肽过渡金属盐化合物的酸加成盐，该多肽过渡金属盐化合物是下式1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15A1-A2-Cys-A2-A3-A3-X-Y-Z-A2-A3-A3-Cys-A3-A4………〔Ⅰ〕(序列号1)〔式中A1表示独立的选自Lys、Arg和Orn的碱性氨基酸残基；具有至少2个上述碱性氨基酸的肽残基；上述碱性氨基酸残基或上述肽残基的氨基酸末端氨基酸残基的N-α氢原子被酰基或取代硫代氨基甲酰基取代的N-α取代氨基酸残基或N-α取代肽残基，A2表示独立的选自Phe、Trp和Tyr的氨基酸残基，A3表示独立的选自Arg、Lys和Orn的碱性氨基酸残基，A4表示-OH(来源于羧基)或-NH2(来源于酰氨基)X表示A2的1个氨基酸通过肽键连接在选自Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Met和Cys的1个氨基酸残基的次位上的有2个氨基酸残基的肽残基，Y表示Gly和A3的1个氨基酸残基组合成的有2个氨基酸残基的肽残基，或Pro和选自D-Arg、D-Lys及D-Orn的1个氨基酸残基组合成的有2个氨基酸残基的肽残基，Z表示Cys通过肽键连接在选自Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Met和A2的1个氨基酸残基的次位上形成的有2个氨基酸残基的肽残基，通过肽键连接的X-Y-Z残基的6位和10位的各氨基酸残基通过肽键连接起来，或者也可以由于XZ的同时缺失Y残基的6位和10位的各残基通过肽键连接起来，这时，构成Y的氨基酸的D-Lys、L-Lys、D-Orn或L-Orn的侧链ω-氨基的氢原子也可以被ω-氨基酰基取代〕所表示多肽化合物和过渡金属形成的盐。
2．如权利要求1所述的多肽过渡金属盐化合物或该多肽过渡金属盐的酸加成盐，其中权利要求1的过渡金属盐是络合物盐。
3．如权利要求1或2所述的多肽过渡金属盐化合物或多肽过渡金属盐化合物的酸加成盐，其中过渡金属是选自铁族(Fe、Co、Ni)、铜族(Cu、Ag、Au)、锌族(Zn、Cd、Hg)和锰族(Mn、Tc、Re)的过渡金属。
4．使下式1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15A1-A2-Cys-A2-A3-A3-X-Y-Z-A2-A3-A3-Cys-A3-A4………〔Ⅰ〕(序列号1)〔式中A1表示独立的选自Lys、Arg和Orn的碱性氨基酸残基；具有至少2个上述碱性氨基酸的肽残基；上述碱性氨基酸残基或上述肽残基的氨基酸末端氨基酸残基的N-α氢原子被酰基或取代硫代氨基甲酰基取代的N-α取代氨基酸残基或N-α取代肽残基，A2表示独立的选自Phe、Trp和Tyr的氨基酸残基，A3表示独立的选自Arg、Lys和Orn的碱性氨基酸残基，A4表示-OH(来源于羧基)或-NH2(来源于酸酰氨基)X表示A2的1个氨基酸通过肽键连接在选自Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Met和Cys的1个氨基酸残基的次位上的有2个氨基酸残基的肽残基，Y表示Gly和A3的1个氨基酸残基组合成的有2个氨基酸残基的肽残基，或Pro和选自D-Arg、D-Lys及D-Orn的1个氨基酸残基组合成的有2个氨基酸残基的肽残基，Z表示Cys通过肽键连接在选自Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Met和A2的1个氨基酸残基的次位上形成的有2个氨基酸残基的肽残基，通过肽键连接的X-Y-Z残基的6位和10位的各氨基酸残基通过肽键连接起来，或者也可以由于XZ的同时缺失Y残基的6位和10位的各残基通过肽键连接起来，这时，构成Y的氨基酸的D-Lys、L-Lys、D-Orn或L-Orn的侧链ω-氨基的氢原子也可以被ω-氨基酰基取代〕所表示的多肽化合物抗HIV作用活性发挥出来的方法，通过与过渡金属形成盐而发挥出较高的抗HIV作用和稳定的活性。
5．含有有效量的权利要求1所述的多肽过渡金属盐化合物或该多肽过渡金属盐化合物的酸加成盐以及制药学载体的制药学或制剂学组合物。
6．权利要求5所述的组合物，用于抑制病毒活动。
7．权利要求5的组合物，用于抑制患者体内HIV活动。
全文摘要
本发明提供了一种对人类免疫缺陷病毒(HIV)具有较高抗病毒作用的式[Ⅰ]所表示的多肽与过渡金属的新的盐化合物。这些多肽的过渡金属盐化合物通过形成络合物以及通过与通常药学上可接受的酸形成离子性盐,稳定的表现出高度的抗HIV活性。代表性的多肽过渡金属盐化合物如下式(1)所示的化合物。
文档编号A61P31/18GK1233257SQ97198808
公开日1999年10月27日 申请日期1997年10月15日 优先权日1996年10月15日
发明者松本章义, 胁道典 申请人:生化学工业株式会社