专利名称：一种用于辐射损伤治疗的多肽类药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种以血小板第4因子(简称PF4)或其活性片段或它们的活性突变蛋白为有效成分的用于放射损伤治疗的多肽类药物及其在肿瘤放疗中作为造血保护剂的应用。
骨髓是哺乳动物体内对辐射最敏感的组织，骨髓损伤导致的造血功能衰竭是辐射致死的主要原因。因此，骨髓的辐射损伤防护及造血重建对于放射损伤的救治意义重大。造血干细胞是造血重建的关键细胞群，它们有很高的辐射敏感性，射线作用后其数量迅速减少，且增殖分裂自我更新和多向分化的功能明显受抑，但是一旦有条件再生，就可以很高的增殖速率增长。因此，干细胞增殖刺激因子可用于辐射损伤的治疗。目前治疗由放射导致血细胞减少的主要方法包括骨髓移植，使用能促细胞增殖的因子如粒细胞生长刺激因子(G-CSF)，粒单细胞生长刺激因子(GM-CSF)，红细胞生成素(EPO)，这些已获准正式投放市场并用于临床。还有一些因子如血小板生成素TPO等已进入临床试验，在实验动物身上已证实其促进造血重建的作用。
已知造血多能干细胞在一定的条件下能向粒单细胞、红细胞或巨核细胞的祖细胞分化，进一步增殖产生成熟的白细胞、红细胞和巨核细胞，每个巨核细胞又能产生数千个血小板。造血细胞的增殖和分化受许多因子的调节，这些因子包括白细胞介素1、3、6、11、12、13和SCF,GM-CSF,TPO以及EPO。它们单独使用或合用能刺激一个系列或多个系列造血细胞的生长和分化。在正常情况下，造血干细胞和祖细胞主要存在于骨髓中，新生儿脐带血和末梢血中可采集的造血干细胞绝对数较低，不能满足移植需要。
目前已发现的具有放射保护功能的试剂较多，包括细胞刺激因子，如干细胞因子SCF，白细胞介素IL-1,IL-6,IL-12等；细胞抑制因子，如肿瘤坏死因子TNF；免疫调节剂类，如细菌性脂多糖LPS。遗憾的是这些试剂至少要在放射前4小时使用才能发挥其对造血干细胞的放射保护作用，放射后使用无效，因此对放射损伤的病人无治疗作用。多年来临床上一直迫切需要一种具有双重功能的药物来加速放射损伤病人的造血恢复，也就是说这种药物不仅具有增加细胞损伤恢复的功能，而且还能促进干细胞的自我更新、增殖和分化。
已知PF4是趋化因子家族的一员，具有抑制巨核系造血的作用。研究已发现PF4的造血抑制作用是可逆的，在抑制干细胞增殖分化的同时，能保存其活力，故可保护造血干祖细胞免受化疗药物损伤。
本发明的目的在于提供一种用于辐射损伤治疗和防护的药物组合物及使用该药物组合物在肿瘤放疗中的造血保护。
本发明所述的用于辐射损伤治疗和防护的药物组合物是以血小板第4因子PF4和/或活性片段和/或它们的活性突变蛋白为有效成份。
上述血小板第4因子及其活性片段或它们的活性突变蛋白可以是天然的、基因重组的或它们的混合物。
所说的“活性突变蛋白”是指血小板第4因子的类似物，天然PF4或其活性片段的氨基酸残基所替换或缺失，或者一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基替换或缺失，或者一个或多个氨基酸残基被加入到天然PF4的顺序中，而且与天然PF4的活性片段相比，没有显著改变所得到的产物的活性。这些活性突变蛋白可以用已知的人工合成和/或定点诱变技术或任何其它已知的适合用于该目的技术来制备。
根据本发明，较佳的活性突变蛋白的改变是那些已知的“保守的”置换。PF4或多肽或它们的活性片段的保守的氨基酸置换会保留该分子的生物学功能。
本发明构思基于以下实践结果动物体内实验研究显示，接受PF4注射2次的小鼠(一次在放射前0小时，另一次在放射后4小时)，经7Gy射线照射后，存活时间较对照组延长，30天存活率从对照组的33％增至55％。这些结果表明，PF4能减低小鼠对放射的敏感性。
为阐明PF4对造血干细胞放射敏感性的影响，体外实验是将PF4(500ng/ml)与小鼠骨髓细胞在37℃培养箱中孵育4小时，照射7Gy后接种至预先照射15Gy的骨髓基质细胞单层上，然后再加入等量的PF4 1-2次，置于33℃,5％CO2孵育箱中培养4-5周，每周半量换液，测定其中的细胞数和细胞集落生长数。培养第5周用胰酶消化粘附基质细胞单层，测定其造血细胞集落生长数，用以估计培养中长期培养启始细胞，长期培养启始细胞(LTC-IC)目前被普遍认为是造血干细胞数。结果培养后1-5周，接种PF4处理3次的细胞的培养瓶中，其非粘附的细胞数和集落数较对照组和PF4处理2次组增多，这种差异随着培养时间的延长而趋明显。第3周开始，对照组粘附层已不再有造血细胞，而实验组造血细胞却不断增多，特别是PF4三次组，非粘附细胞增多更明显。第5周，对照组粘附基质层中未检测到集落形成细胞，CFCs为0，而集落形成细胞(CFCs)在PF4二次组和PF4三次组分别为77±6,590±46，由此可见PF4加入三次较加入二次更有利于造血干细胞辐射损伤的恢复。推测放射后2次加入PF4对造血的恢复与维持是至关重要的。
在本发明的另一实施例中，同样用检测放射的骨髓细胞重建放射基质培养能力的方法，比较了放射前后加PF4与单纯放射后加PF4对放射的造血细胞重建造血的影响。结果第5周，非粘附细胞及粘附CFCs在放射前后加PF4组较单纯放射后加PF4组略有增多，但两组无显著差异。说明单纯放射后加入2次PF4就能使辐射损伤的干细胞恢复重建造血的能力，这一研究结果提示了PF4可能具有修复造血干细胞的辐射损伤和刺激造血干细胞自我更新的双重能力。
实施例1取8-10周龄C57BL/6小鼠12只，分成二组，每组6只。在一组小鼠腹腔注射PF4，剂量为每只1微克，将另一组小鼠作为对照，腹腔注射等体积磷酸缓冲液(PBS),20小时后，将小鼠照射7Gy,4小时后再次注射相同剂量或等体积的PF4或PBS，然后观查小鼠照射后30天内的生存情况。从图1中可以看出，接受PF4注射的小鼠，经7Gy射线照射后，存活时间较对照组延长，30天存活率从对照组的33％增至55％，这一结果表明，PF4能减低小鼠对放射的敏感性。实施例2将5-氟脲嘧啶(150毫克/公斤体重)腹腔接种给小鼠，2天后取骨髓细胞，此细胞主要为造血干祖细胞。将此种细胞分为4组，分别与PBS(group A,as control),PF45μg/ml(group B),PF434-581μg/ml(group C)and PF433-601μg/ml(group D)(后两者为PF4的相关活性多肽)，在37℃,5％CO2培养箱中孵育48小时，然后照射7.5Gy，再继续培养24小时，用染色酶标检测仪(MTT)检测各组细胞的存活率。结果发现PF4及其相关活性多肽均能明显增加细胞在照射后24小时的存活率，提示PF4及其相关活性多肽能减低造血干祖细胞对放射的敏感性(如图2示)。
实施例3取5-氟脲嘧啶(150毫克/公斤体重)腹腔接种2大后的小鼠骨髓细胞，照射7.5Gy，将此细胞分为若干组，分别加入PBS及不同剂量的PF4(0.1-5μg/ml)，在37℃,5％CO2培养箱中孵育24小时，用MTT方法检测各组细胞的存活率。结果发现放射后加入PF4能明显增加细胞在照射后24小时的存活率，其中0.5微克/毫升PF4效果最好，提示PF4能减低放射对造血干祖细胞的损伤(如图3示)。实施例4将PF4(500ng/ml)与小鼠骨髓细胞在37℃培养箱中孵育4小时，照射7Gy后接种至预先照射15Gy的骨髓基质细胞单层上，然后再加入等量的PF4 1-2次，置于33℃,5％CO2孵育箱中培养4-5周，每周半量换液，测定其中的细胞数和细胞集落生长数。培养第5周用胰酶消化粘附基质细胞单层，测定其造血细胞集落生长数，用以估计培养中长期培养启始细胞，即造血干细胞数。具体结果见表1、表2和图4。
表1非粘附细胞中的集落形成细胞数(CFCs)每瓶中的CFCs
骨髓细胞与PF4(500ng/ml)孵育4小时，照射7Gy，然后接种至预建的照射15Gy的骨髓基质细胞单层上，相同剂量的PF4再加2次，间隔24小时表2培养35天后每瓶粘附细胞中的集落形成细胞数(CFCs
PF4二次分别在放射前4小时和放射后立即加入两次PF4 500ng/ml；PF4三次分别在放射前4小时和放射后立即及24小时加入三次PF4 500ng/ml；实施例5将小鼠骨髓细胞分为三组，一组细胞加PF4(500ng/ml)，另外两组细胞加磷酸缓冲液PBS，将细胞在37℃培养箱中孵育4小时，照射7Gy后接种至预先照射15Gy的骨髓基质细胞单层上，每组3-6瓶。接种PF4处理的细胞的培养瓶再加入等量的PF4 2次，间隔24小时；接种PBS处理的细胞的培养瓶再分成两组，一组再加入PF4 2次(500ng/ml)，间隔24小时；另一组继续加PBS2次，间隔24小时；将细胞置于33℃，5％CO2孵育箱中培养4-5周，每周半量换液，测定其中的细胞数和细胞集落生长数。培养第5周用胰酶消化粘附基质细胞单层，测定其造血细胞集落生长数，用以估计培养中长期培养启始细胞，即造血干细胞数。结果如下表3和图5所示；表3培养35天后每瓶粘附细胞中的集落形成细胞数(CFCs)<
PF42次分别放射后立即及24小时加入两次PF4 500ng/ml；PF43次分别在放射前4小时和放射后立即及24小时加入三次PF4 500ng/ml；实施例6将小鼠骨髓长期培养3-4周的非粘附细胞2×106分别接种至预先照射8Gy的骨髓基质TC-1细胞单层上(这种非粘附细胞主要包括髓系各阶段造血细胞，TC-1细胞是从小鼠骨髓长期培养中建立的基质细胞系，其可通过分泌因子刺激性造血细胞在体外生长)，其中一组细胞加PF433-60(50-100ng/ml)，另外一组细胞加磷酸缓冲液PBS，每组3瓶，接种PF433-60处理的细胞的培养瓶共加PF433-603次，间隔24小时，将细胞置于33℃,5％CO2孵育箱中培养3天，倒置显微镜下分别计数粘附基质细胞生长的；由6-100个以上的造血细胞组成的细胞集团数，结果见表4及图6、图7。由此可见，PF4多肽可增加造血细胞对基质细胞的粘附和增殖应答。
表4PF433-60对造血细胞在基质细胞上形成造血细胞岛(CAFC)的作用
图1PF4对放射小鼠生存能力的影响其中-20为照射7Gy前20小时，给小鼠腹腔注射PF4 1μg/只+4为照射后4小时再注射一次。图2PF4及其相关活性多肽对细胞照射7.5Gy后24小时的存活率影响其中A-对照组(PBS)B-PF4 5μg/ml组C-PF434-581μg/ml组(PF4的相关活性多肽)D-PF433-601μg/ml组(PF4的相关活性多肽)图3PF4对细胞在照射7.5Gy后24小时的存活率影响图4PF4对放射后长期培养启始细胞的保存作用其中--◆--PBS--■--PF4 500ng/ml加入三次---▲--PF4 500ng/ml加入二次图5PF4对放射后长期培养启始细胞的保存作用其中■-PBS
-PF4-4,0为放射前4小时和放射后立即加入
-PF4-4,0,24为放射前4小时，放射后立即和24小时加入□-PF4 0,24为放射后立即和24小时加入图6PBS组接种造血细胞后第48小时粘附层细胞图象其中，粘附层有少量造血细胞，造血细胞集团小图7PF433-60组接种造血细胞后第48小时粘附层细胞的图象其中，粘附层有大量造血细胞，并出现造血细胞岛。
权利要求
1.用于辐射损伤治疗及放射保护的药物组合物，其特征在于，含有作为有效成分的血小板第4因子和/或其活性片段和/或它们的突变蛋白。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述活性片断可以是血小板第4因子的中部活性区33-60个氨基酸残基也可以是血小板第4因子的任一区域。
3.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述突变旦白为与天然血小板第4因子具有80％的同源性的多肽。
4.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述突变旦白为与天然PF4和/或其活性片段具有80％的同源性的多肽。
5.如权利要求1所述的药物组合物在辐射损伤中的应用，其特征在于其可加速造血干细胞的损伤修复，放射前后合用效果最佳，但单纯放射后给药仍然有效。
全文摘要
本发明涉及一种以血小板第4因子(PF4)或其活性片段或它们的活性突变蛋白为有效成分用于放射损伤治疗的多肽类药物组合物，所说的药物组合物可以是天然的，基因重组的或它们的组合物，将PF4按规定程序与致死剂量照射的小鼠骨髓细胞共孵育，然后接种至放射的骨髓基质单层上培养至第5周，用胰酶消化粘附基质细胞单层，测定其造血细胞集落生长素，用以估算培养中长期培养启始细胞，即造血干细胞数，结果表明，放射前后使用该药物组合物效果最佳，单纯放射后给药仍有效果。
文档编号A61K38/19GK1238217SQ99109339
公开日1999年12月15日 申请日期1999年6月24日 优先权日1999年6月24日
发明者韩忠朝, 马月霞, 雅克·康, 莫妮卡·阿拉玛妮 申请人:中国医学科学院血液学研究所, 法国巴黎血管和血液研究所