角质细胞生长因子2的治疗应用的制作方法

专利名称：角质细胞生长因子2的治疗应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及投用角质细胞生长因子2(KGF-2)以刺激血小板增殖并增加纤维蛋白原、白蛋白、球蛋白和总血清蛋白质。此外，本发明涉及投用KGF-2以保护或治疗膀胱与前列腺。再者，本发明涉及投用KGF-2以刺激鼻、口腔和食道粘膜、泪腺、唾液腺及杯形细胞的生长。
背景技术：
血小板减少是一种循环血液中血小板数目异常减少的病理状况(Stedman＇s Medical Dictionary,26th edition,Marjory Spraycar,Editor(1995))。血小板减少可因各种原因造成，但最终还是因血小板被破坏、在体内汇集或不能产生而导致的。血小板减少的鉴别诊断是范围很宽并很复杂的，而且在各紊乱间还有很大程度的交迭(Doyle B,and PorterD.L.A.A.C.N.Clin.Issues 8:469-480(1997))。
血小板减少可因多种机制引起，其中包括但不只限于药物诱导的超敏反应、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、输血后紫癜、新生儿血小板减少、与骨内转移瘤有关的骨髓缺乏、再生障碍性贫血、骨髓纤维变性、急性和单核细胞白血病、包括弥散性血管内凝血(DIC)的微血管病溶血性贫血、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、溶血性尿毒综合症、人工瓣膜性溶血综合症、肿瘤化疗、Zieve氏综合症、脓毒症、HELLP子痫前期综合症、由于B21和叶酸缺乏引起的巨成红细胞贫血、腹膜炎之类感染(没有败血症)、先天性风疹综合症、HIV-1病毒感染、EB病毒感染性单核细胞增多症、系统性狼疮等类风湿性胶原病、子痫前期相关妊娠高血压、甲状腺毒症和尿毒症(Clinical guide to Laboratory tests(3rd ed.).Philadelphia,W.B.Saunders Company,1995；Clinical LaboratoryMedicine,Clinical application of laboratory data.(6th ed.)St.Louis,Mosby,1995)。
纤维蛋白原是在肝脏合成的丰富的血浆糖蛋白。凝血酶相继裂解纤维蛋白原α和β链中的血纤肽A和B，以产生血纤蛋白单体，然后这些单体聚合形成血纤蛋白凝块，构成凝血过程中的最后一个主要步骤。已鉴定了一些突变，包括改变血纤肽从纤维蛋白原α和β链上的释放、血纤蛋白单体的聚合速率，以及血纤蛋白交联的位点。这些突变导致几乎总是作为常染色体显性性状遗传的纤维蛋白原异常血症。患纤维蛋白原缺乏血症的病人血浆或血小板中测不到纤维蛋白原，也可能偶尔有过中度自发性出血的经历(Harrison＇s Principles of Internal Medicine 11thedition Eugene Braunwald et al.,Editors(1987))。
低纤维蛋白原血症是指循环血浆中纤维蛋白原浓度异常低的病理状况(Stedman＇s Medical Dictionary,26th edition,Marjory Spraycar,Editor(1995))。引起低纤维蛋白原血症的各种病理状况或病症包括但不只限于与急性肝炎或肝硬化等有关的肝脏合成异常，以及弥漫性血管内凝血(DIC)。
白蛋白作为主要血清蛋白质，其负责维持正常血清胶体渗透压、运输某些激素并维持内源性氨基酸来源(Buehler,B.A.,Ann,Clin.Lab.Sci.8:283-286(1978))。低白蛋白血症是一种表现为循环血液中白蛋白浓度异常低下的病理状况。血清白蛋白水平是一般健康状况的几种临床参数之一。低白蛋白水平与住院病人的发病和死亡率有着重要关系。因此，在住院病人中低白蛋白血症是很常见的。已知低白蛋白血症与伤口延迟愈合有关。低白蛋白血症状态影响胃肠道正常功能的发挥。肾脏疾病时发生的白蛋白分子的质的改变可损害肾单位。低血清白蛋白可给凝血系统带来不利影响(Doweiko,J.P.,and Nompleggi,D.J.J.P.E.N.J.Parenter.Enteral.Nutr.15:476-483(1991))。
血清白蛋白过少的各种病因可包括但不只限于出血、烧伤、渗出、风湿病、肉芽肿、大多数细菌感染、合并有组织破坏的病毒感染、组织坏死、血管炎、溃疡性肠道疾病、浆膜炎、亚急性细菌性心内膜炎、寄生虫侵染、急性和慢性肝病、淀粉样变、营养不良、癌、充血性心力衰竭、狭窄性心包炎、心脏瓣膜病、肾病综合症、创伤和粉碎性损伤、胃肠和淋巴瘘，以及蛋白质丢失性胃肠病(Clinical guide to laboratory tests.(3rd ed.).Philadelphia,W.B.Saunders Company,1995；Clinicallaboratory Medicine.Clinical application of laboratory data.(6th ed.)St.Louis,Mosby,1995)。
球蛋白是用半饱和硫酸铵从血浆或血清中沉淀出来的蛋白质家族成员之一。可根据溶解性和电泳特性、超滤及其他分离方法将球蛋白分成许多亚组，主要亚组是α-、β-和γ-球蛋白。其差异涉及相关的脂质或碳水化合物，以及许多重要生理活性因子的含量。球蛋白在β和γ部分中包括免疫球蛋白、在α和β部分中包括脂蛋白、另外还包括糖蛋白或粘蛋白(血清类粘蛋白、结合球蛋白(haptoglobulin))，以及金属结合蛋白和金属运输蛋白质(如转铁蛋白、铁传递蛋白、血浆铜蓝蛋白)。见于球蛋白部分中的其他物质是巨球蛋白、纤溶酶原、凝血酶原、优球蛋白、抗血友病球蛋白、纤维蛋白原及冷沉球蛋白(Stedman＇s medicalDectionary,26th edition,Marjory Spraycar,Editor(1995))。
在对急性病症的反应中，血浆蛋白质水平发生某些可预见的改变。低球蛋白血症是一种循环血浆中球蛋白浓度异常降低的病症。造成血浆球蛋白过少的各种病理状况包括但不只限于α-1抗胰蛋白酶缺乏、严重肝病、雌激素治疗、巨成红细胞性贫血、血丙球蛋白过少及丙球蛋白缺乏血症等(Clinical guide to laboratory tests.(3rd ed.).Philadelphia,W.B.Saunders Company,1995；Clinical laboratory Medicine.Clinicalapplication oflaboratory data.(6th ed.)St.Louis,Mosby,1995)。
总血清蛋白质降低与蛋白质丢失(蛋白质丢失性胃肠病变、急性烧伤、肾病综合症)及蛋白质合成减少(慢性肝病、吸收不良综合症、营养不良和丙球蛋白缺乏血症)有关。
出血性膀胱炎是与某些疾病状态以及接触毒品、病毒和毒素有关的综合症。其表现为膀胱内皮层的弥散性出血。治疗包括使用膀胱内、全身用药及非药物疗法(West,N.J.Pharmacotherapy 17:696-706(1997))。
丧失产生足够量唾液和泪的能力是影响到数百万人的一大临床问题，而且目前对这些患者也没有多少治疗办法。口腔干燥的病人大多吞咽困难、口腔干裂疼痛，而且有时味觉降低。这种病理状况可因Sjogren氏综合症引起，为头颈部肿痛病人放疗和药物治疗的继发症状。Sjogren氏综合症病人有时有干燥性角结膜炎或眼睛干燥。这种状况可以是因Sjogren氏综合症、结节病、衰老、HIV感染、烧伤等所致的泪腺损伤引起的。病人表现有急躁、视物模糊、烧灼感、疼痛及增加的感染危险。有数百万病人患有Sjogren氏综合症，而且治疗上没有太好的方法。
与口腔干燥一样，对患有角膜结膜炎干燥症状也没有好的治疗办法。当前，美国约有一千万患者需要使用人工泪制剂(Lemp,M.A.,Adv.Exp.Med.Biol.438:791-803(1998))。现时也没有取代唾液腺和泪腺细胞的治疗方法。
鼻窦感染通常发生在上呼吸道感染、变态反应或解剖缺陷(鼻窦或鼻中隔内)等情况下，并且可导致头痛、面部疼痛、发烧及化脓性鼻液溢(EvansKL.,Drugs 56(1):59-71(1998))等症状。鼻过敏反应的症状与慢性筛鼻炎有重迭，并且变应性病人治疗失败可能提示存在有慢性鼻窦炎。慢性筛窦炎可能是患有长期过敏反应的病人鼻溢和鼻阻塞的主要原因(Bertrandet al.,Acta Otorhinolaryngol Belg.51(4):227-237(1997))。急性筛窦炎多发生于有鼻炎史的病人，其来源上可以是变应性或非变应性的。患有解剖变异(Evans KL.Drugs 56(1):59-71(1998))和囊性纤维样变性(Brihayeet al.,Acta Otorhinolaryngol Belg 51(4):323-337(1997)；Ramsey et al.,J.Allergy Clin.Immunol.90(3Pt2):547-552(1992)；Davidson et al.,Laryngoscope 105(4Pt1):354-358(1995)；Jones et al.,Int.J.Pediatr.Otorhinolaryngol.28(1):25-32(1993))的病人也有发展成鼻窦炎的高度危险。具体地说，已知筛窦口阻塞造成恶性循环，进而导致并维持鼻窦炎(Reily J.S.Otolaryngology Head and Neck Surgery 103(5):856-862(1990))。治疗急性和慢性鼻窦炎的目的是控制鼻炎，改善窦的通气，并改善鼻窦清除分泌物的功能(Evans KL.,Drugs 56(1)059-71(1998))。
一般认为只有当药物手段不能控制鼻窦炎时才对鼻窦进行外科治疗。治疗的目的是同样的改善通气以及促进或恢复鼻窦导流。另一个目的是外科治疗有时可改善局部用药向窦内的穿透。在美国，每年要进行多达250,000个手术。然而，在进行鼻窦手术治疗过程中，会撕脱或损伤粘膜表面。在进行大范围外科治疗的情况下，鼻窦内下层骨组织可暴露达6个月，然后才能重新长满粘膜，而纤毛密度恢复则要长达2年之久。据信手术后鼻窦的上皮重新生成延迟与增加感染的危险、导致疾病复发的瘢痕形成(上皮下的纤维变性)、以及囊肿生成有关。随访两年后，约有2-5％的病人有复发，并且有多达15％的病人要进行再次手术(EvausKL.,Drugs 56(1):59-71(1998))。
因此，本领域内特别需要提供能够增加血小板、纤维蛋白原、白蛋白、球蛋白及总血清蛋白质水平的治疗用蛋白质。另外，需要找到能够治疗或保护因膀胱炎造成的损伤的方法。再者，也需要有办法刺激唾液腺和泪腺中细胞增殖的方法，以及刺激外科手术后鼻窦中鼻粘膜生长及鼻窦重新上皮化的方法。
发明简述本发明提供包括编码角质细胞生长因子(KGF-2)之多核苷酸的分离的核酸分子，其中所说的KGF-2具有

图1[SEQ ID NO:2]所示的氨基酸序列或由1994年12月16日以登记号ATCC 75977保藏的cDNA克隆编码的氨基酸序列。如图1[[SEQ ID NO:1]所示的，经测定KGF-2保藏克隆所确定的核苷酸序列含有编码208个氨基酸残基之多肽的阅读框，其中包括1-3位上的起始密码子，所说的多肽有大约35或36个氨基酸残基的预测前导序列，并且推导的分子量约为23.4KDa。图1中显示成熟KGF-2的氨基酸序列，即氨基酸残基约36或37至208[SEQ IDNO:2]。
已将本发明的多肽鉴定为FGF家族的成员，特别是因为它与其他FGF家族成员的氨基酸序列有同源性而被鉴定为KGF-2。
根据本发明的一个方面，提供了作为KGF-2的新的成熟多肽，以及其生物学上有活性的，并且在诊断或治疗上有用的片段、类似物和衍生物。本发明的多肽是人源的。
根据本发明的另一个方面，提供了编码人KGF-2的分离的核酸分子，包括mRNA、DNA、cDNA、基因组DNA及其反义类似物，以及它们有生物学活性并在诊断上或治疗上有用的片段。
根据本发明的另一个方面，提供了使用重组载体，例如可用作重组生产KGF-2蛋白质之试剂的克隆和表达质粒，以及包含人KGF-2核酸序列的重组原核和/或真核宿主细胞，通过重组技术生产这些多肽的方法。
根据本发明的再一个方面，提供了为缓解血小板减少之目的投用KGF-2以增加血小板水平的治疗方法。还可使用KGF-2增加血浆纤维蛋白原的水平，此可见于异常肝合成(例如与急性肝炎或肝硬化相关)和弥散性血管内凝血的情况下。还可使用KGF-2增加低白蛋白血症病人的血清白蛋白水平。还可使用KGF-2增加低球蛋白血症病人的血清球蛋白水平。还可使用KGF-2增加其有蛋白质丢失及蛋白质合成减少症状的病人的总血清蛋白质水平。
另外，可使用KGF-2抑制对前列腺和膀胱的毒性作用，并减小膀胱炎所致溃疡的程度。
也可使用KGF-2刺激窦上皮、鼻粘膜、泪腺及唾液腺的生长。
附图简述图1A-1C显示本发明多肽的cDNA及由之推测的氨基酸序列。前35或36个氨基酸残基代表假定的前导序列(划下线者)。使用氨基酸的标准单字母缩写。当试图确定多核苷酸序列时，测序不准确是常有的事。使用373自动DNA序列仪(Applied Biosystems,Inc.)进行序列测定。预计测序准确性大于97％。[[SEQ ID NO:1]。
图2A-2D显示本发明的多肽与其他成纤维细胞生长因子之氨基酸序列的比较。[SEQ ID NO:13-22]图3A-3D显示KGF-2基因的全长度mRNA和氨基酸序列。[SEQID NO:23和24]图4A-4E显示对KGF-2氨基酸序列的分析。其中显示了α、β区、转角区和卷曲区；亲水性和疏水性、两亲区域；柔性区域；抗原性指数和表面概率。在“抗原性指数-Jameson-Wolf”图中，图1[SEQ IDNO:2]中的氨基酸残基41-109相当于所示的KGF-2蛋白质的高抗原区。疏水区(Hopp-Woods曲线图)落在中线下方(负值)而亲水区(Kyte-Doolittle曲线图)则见于中线下方(正值，例如氨基酸残基41-109)。线图跨越208个氨基酸的ORF。
图5显示由pQE60-Cys37构建体DNA序列和表达的蛋白质。所表达的KGF-2蛋白质含有从37位半胱氨酸至208位丝氨酸的序列，其中有连接到蛋白质N末端上的6X(His)标志。
图6(A)显示KGF-2对正常原代上皮角质细胞增殖的刺激作用。(B)显示KGF-2Δ33对正常原代上皮角质细胞增殖的刺激作用。(C)显示KGF-2Δ28对正常原代上皮角质细胞的刺激作用。将人的正常原代上皮角质细胞与各种不同浓度的KGF-2、KGF-2Δ33或KGF-2Δ28保温三天。然后所有三个实验中都加alamarBlue保温16小时，并根据O.D.570nm和O.D.600nm间的差异，测定细胞将alamarBlue转化成红色的强度。对于各种KGF-2蛋白质，在同一试验平板中均包括含完全角质细胞生长培养基(KGM)的阳性对照，和含角质细胞基本培养基(KBM)的阴性对照。
图7(A)显示KGF-2和FGF7对FGFR1b和FGFR2转染的Baf3细胞中胸苷掺入的刺激作用。检查KGF-2(右框)和FGF7(左框)对FGFR1ⅲb(空心圈)或FGFR2ⅲb/KGFR(实心圈)转染的Baf3细胞增殖的作用。Y轴代表Baf3细胞中DNA的[3H]胸苷掺入量(cpm),X-轴代表加到组织培养基中的KGF-2或FGF7的终浓度。(B)显示KGF-2Δ33对FGFR2ⅲb转染的Baf3细胞中胸苷掺入的刺激作用。(C)显示KGF-2(白色条)、KGF-2Δ33(黑色条)和KGF-2Δ28(灰色条)对FGFR2ⅲb转染的Baf3细胞中胸苷掺入的刺激作用。
图8显示pHE4-5表达载体(SEQ ID NO:147)和亚克隆的KGF-2cDNA编码序列的图解略图。其中指出了卡那霉素抗性基因、KGF-2编码序列、oriC序列，及lacⅠq编码序列的位置。
图9显示pHE启动子之调节元件的核苷酸序列(SEQ ID NO:148)。其中指出了两个lac操纵基因序列、Shine-Delgarno序列(S/D)、末端HindⅢ和NdeⅠ限制性位点(斜体字)。
图10显示大肠杆菌优化的全长度KGF-2的DNA和蛋白质序列[SEQ ID NO:38和39]。
图11A和B显示大肠杆菌优化的成熟KGF-2的DNA和蛋白质序列[SEQ ID NO:42、43、54和55]。
图12显示包括KGF-2之氨基酸36至208的KGF-2缺失构建体的DNA和所编码的蛋白质序列[SEQ ID NO:65和66]。
图13显示包括KGF-2之氨基酸63至208的KGF-2缺失构建体的DNA和所编码的蛋白质序列[SEQ ID NO:67和68]。
图14显示包括KGF-2之氨基酸77至208的KGF-2缺失构建体的DNA和所编码的蛋白质序列[SEQ ID NO:69和70]。
图15显示包括KGF-2之氨基酸93至208的KGF-2缺失构建体的DNA和所编码的蛋白质序列[SEQ ID NO:71和72]。
图16显示包括KGF-2之氨基酸104至208的KGF-2缺失构建体的DNA和所编码的蛋白质序列[SEQ ID NO:73和74]。
图17显示包括KGF-2之氨基酸123至208的KGF-2缺失构建体的DNA和所编码的蛋白质序列[SEQ ID NO:75和76]。
图18显示包括KGF-2之氨基酸138至208的KGF-2缺失构建体的DNA和所编码的蛋白质序列[SEQ ID NO:77和78]。
图19显示包括KGF-2之氨基酸36至153的KGF-2缺失构建体的DNA和所编码的蛋白质序列[SEQ ID NO:79和80]。
图20显示包括KGF-2之氨基酸63至153的KGF-2缺失构建体的DNA和所编码的蛋白质序列[SEQ ID NO:81和82]。
图21显示KGF-2半胱氨酸37至丝氨酸的突变构建体的DNA序列[SEQ ID NO:83]。
图22显示KGF-2半胱氨酸37/半胱氨酸106至丝氨酸的突变构建体的DNA序列[SEQ ID NO:84]。
图23显示腹膜内或皮下注射KGF-2Δ33后膀胱上皮的增殖。
图24显示全身投用KGF-2Δ33后前列腺上皮细胞的增殖。
图25显示在环磷酰胺诱导的大鼠出血性膀胱炎模型中，KGF-2Δ33对膀胱壁溃疡的影响。
图26显示在环磷酰胺诱导的大鼠膀胱炎模型中，KGF-2Δ33对膀胱壁厚度的影响。
图27提供一个用来确定当以皮下和腹膜内途径全身性投用KGF-2Δ33时，其是否诱导大鼠正常上皮增殖的总体研究设计。
图28给正常Sprague Dawley大鼠每天注射KGF-2Δ33(5mg/kg；HG03411-E2)或缓冲液，并于末次注射后1天杀死动物。不明事实的观察者用10倍显微镜在十个随机选择的视野中计数每只动物的增殖细胞数。皮下投用KGF-2Δ33一天后引发明显的细胞增殖，第2天后转为正常。1-3天腹膜内注射KGF-2Δ33可见刺激增殖。但只有第1天和第3天的结果有统计学意义。
图29给正常Sprague Dawley大鼠每天注射KGF-2Δ33(5mg/kg；HG03411-E2)或缓冲液，并于末次注射后1天杀死动物。不明事实的观察者用10倍显微镜在十个随机选择的视野中计数每只动物的增殖细胞数。在整个研究期间腹膜内注射KGF-2Δ33刺激了细胞增殖，而皮下投用KGF-2Δ33则在任何时间点均未提高增殖数。
图30给正常Sprague Dawley大鼠每天注射KGF-2Δ33(5mg/kg；HG03411-E2)或缓冲液，并于末次注射后1天杀死动物。不明事实的观察者用10倍显微镜在一个横断切面计数每只动物的增殖细胞数。每天投药1,2和3天后，皮下给予的KGF-2Δ33引发了增殖的明显增加。当腹膜内给予KGF-2Δ33时，则只于2和3天后见到细胞增殖。
图31证明KGF-2Δ33诱导了正常大鼠肺中的细胞增殖。
图32显示在七天研究期间，对揭示显著增殖的腮腺BrdU阳性细胞数的形态估计。注意在7天休息期后BrdU掺入转为正常。检测以盲法进行。
图33显示每天用KGF-2或缓冲液处理之动物的腮腺的重量，结果用每克体重的腺体mg数表示。每天静脉内注射KGF-2仅七天后器官重量明显增加，并在七天休息期后转为正常。
图34显示注射1天后KGF-2对下颌下腺的增殖作用比较明显。三次用药中其仍有活性，但注射七天后便不再使增殖数明显增加。所有检测均以盲法进行。
图35显示从用KGF-2处理的大鼠得到的下颌下腺的重量，其中显示在两次注射后腺体大小明显增加。每天注射共七天后这种腺体增大达到峰值。恢复一周后，用KGF-2处理之大鼠的下颌下腺的重量又开始恢复正常，但仍大于缓冲液处理的对照大鼠的腺体组织。
图36显示每天静脉内注射KGF-2Δ33,1、2和3天泪腺的增殖。将动物分为每组6只，由盲目的观察者使用计算机化形状测量单位估测组织的增殖。增殖结果以具有增殖细胞的感兴趣区域的百分数(％ROI)表示。误差栏反映SEM。使用Statview进行统计分析。进行因子ANOVA分析，随后进行Scheffe＇post-hoc检验，并将统计学显著性定为P＜0.05。
图37显示静脉内注射KGF-2于第1、2、3和7天对角膜的影响。结果以每毫米组织中复制上皮细胞数表示。观察到KGF-2处理后于第1和2天增殖细胞数增加。但只有第2天得到的结果具有统计学意义。
图38显示静脉内注射KGF-2在第1、2和7天对结膜的影响。结果以每毫米组织的复制上皮细胞数表示。观察到KGF-2处理后第1、2和3天增殖细胞数增加。这些结果在统计学上是有意义的。
图39(A)和(B)显示每天静脉内注射KGF-2Δ33对毛果碱诱导的唾液分泌的影响。图39(A)显示KGF-2Δ33处理动物后诱导了唾液产生的大量增加。图39(B)显示每天注射KGF-2Δ33后唾液中的淀粉酶浓度。
图40显示静脉内注射KGF-2于第1、2、3、7和14天对正常大鼠上颌窦的影响结果。第1、2、3和7天用KGF-2处理后增殖细胞的总数增加。除第14天外，其他各天的结果均有统计学意义。到第14天，增殖细胞数回复正常。
图41显示第1、2、3、7和14天静脉内注射KGF-2Δ33对正常大鼠鼻中隔的影响。第1、2、3和7天用KGF-2处理后增殖细胞总数增加。除第14天外，其他各天的结果有统计学意义。到第14天，增殖细胞数回复正常。
图42显示于第1、2、3和7天，静脉内注射KGF-2Δ33或缓冲液的雄性大鼠中，KGF-2Δ33对结膜中杯形细胞数的影响。
图43显示静脉内投用KGF-2对肺增殖的影响。第一天雄性SD大鼠接受缓冲液或KGF-2Δ33静脉注射(1或5mg/kg)。动物注射BrdU(100mg/kg；i.p.)，2小时后麻醉动物。于第6、24或48小时杀死动物。以20倍显微镜计数5个随机视野中每视野的BrdU阳性细胞平均数。使用未配对T检验与缓冲液对照组比较时P＜0.05，则为有统计学差异。
图44显示雾化的KGF-2对正常大鼠肺细胞增殖的影响。雄性Lewis大鼠吸入雾化的缓冲液或KGF-2Δ33(56或12mg/大鼠)。雾化后24小时，动物接受BrdU(100mg/kg.i.p.)，2小时后行安死术。每肺叶5个随机视野(20x)中阳性染色细胞的平均数为BrdU细胞计数。
图45显示预防性KGF-2Δ33对博来霉素诱导的肺损伤大鼠模型动物体重的影响。雄性大鼠气管内投用KGF-2Δ33(0.5、1和5mg/kg)或缓冲溶液。于0天和第1天进行处理。第3天投用博来霉素。隔日称动物体重，直到第14天。使用不配对T检验进行统计学分析。*与未处理组比较；**与KGF-2缓冲液组比较。
图46显示预防量KGF-2Δ33对博来霉素诱导的大鼠肺损伤模型中纤维变性评分的影响。雄性Lewis大鼠(n=5)于麻醉下气管内投用KGF-2Δ33(0.5mg/ml,1mg/ml,5mg/ml)或缓冲液。于0天和第1天进行处理。第3天投用博来霉素。在实验的最后一天(第14天)，给动物注射BrdU(100mg/kg,i.p.),2小时后行安死术。评分为0=正常、1-3=轻度，4-6=中度，7-9=重度(10x)。用Student＇s配对T检验进行统计学分析。*与缓冲液处理组比较，**与未处理组比较。
图47显示预防量KGF-2Δ33对博来霉素诱导的肺损伤大鼠模型的影响。雄性Lewis大鼠(n=5)于麻醉下气管内投用KGF-2(0.5mg/ml,1mg/ml,5mg/ml)或缓冲液。于0天和第1天进行处理。第3天投用博来霉素。在实验的最后一天(第14天)，给动物注射BrdU(100mg/kg,i.p.),2小时后行安死术。以20倍放大计数10个随机视野中每个视野的BrdU阳性细胞数。用Student＇s配对T检验进行统计学分析。*与缓冲液处理组比较；**与未处理组比较。
图48显示KGF-2Δ33对环磷酰胺诱导的膀胱炎大鼠模型之膀胱容量的影响。雄性SD大鼠(200g)静脉内接受0.1mg、0.3mg、1.0mg或3.0mg/kg剂量的KGF-2Δ33。第1天，腹膜内注射(i.p.)200mg/kg环磷酰胺(CP)。第4天处死动物。从膀胱中除去尿后，充入福尔马林直到从尿道中漏出为止。记录注入膀胱中之福尔马林的体积并以其作为膀胱容积(*与只有CP的对照比较；+与缓冲液对照组比较)。
图49显示KGF-2Δ33对环磷酰胺诱发的膀胱炎大鼠模型之膀胱湿重的影响。雄性SD大鼠(200mg)以0.1、0.3、1.0和3.0mg/kg的剂量静脉内注射接受KGF-2Δ33。第1天，投用(i.p.)200mg/kg环磷酰胺(CP)。第4天杀死动物。将膀胱置于福尔马林中固定，收获标本、称重后放在组织暗盒中进行组织学分析(*与只有CP的对照组比较；+与缓冲液对照组比较)。
图50显示KGF-2Δ33和Mesna对环磷酰胺诱发膀胱炎动物之膀胱溃疡的影响。雄性SD.大鼠(200g)于第0天静脉内接受缓冲液或5.0mg/kg KGF-2Δ33。第1天，i.p.投入200mg/kg环磷酰胺(CP)和Mesna(20μg/g或40μg/g,i.v.)。第3天杀死动物并用福尔马林固定膀胱，然后收获组织。使用盐水作为正常对照。使用未配对T检验进行统计学分析，如p≤0.05即为差异显著。*与只有CP的对照比较；**与缓冲液比较。
图51显示KGF-2Δ33和Mesna对环磷酰胺诱发的膀胱炎动物之正常尿道上皮百分比的影响。雄性SD.大鼠(200g)于第0天静脉内接受缓冲液或5.0mg/kg KGF-2Δ33。第1天，i.p.投入200mg/kg环磷酰胺(CP)和Mesna(20μg/g或40μg/g,i.v.)。第3天杀死动物并用福尔马林固定膀胱，然后收获组织。使用盐水作为正常对照。使用未配对t检验进行统计学分析，如p≤0.05即为差异显著。*与只有CP的对照比较；**与缓冲液比较。
图52显示KGF-2Δ33和Mesna对环磷酰胺诱发膀胱炎的膀胱壁厚度的影响。雄性SD.大鼠(200g)于第0天静脉内接受缓冲液或5.0mg/kgKGF-2Δ33。第1天，i.p.投入200mg/kg环磷酰胺(CP)和Mesna(20μg/g或40μg/g,i.v.)。第3天杀死动物并用福尔马林固定膀胱，然后收获组织。使用盐水作为正常对照。使用未配对T检验进行统计学分析，如p≤0.05即为差异显著。*与只有CP的对照比较；**与缓冲液比较。
图53显示KGF-2Δ33和Mesna对环磷酰胺诱发膀胱炎的动物膀胱容积的协同作用。雄性SD大鼠(350-400g,n=7)于第0天静脉内接受缓冲液或5.0mg/kg KGF-2Δ33，并于第1天施用Mesna(40μg/g,i.v.)或在相应天数进行两种处理。除盐水对照组外，所有各组均在第1天投用环磷酰胺(300mg/kg,i.p.)。加入一个未治疗组作为CP对照组。第3天，动物于安死术前2小时接受BrdU(100mg/kg,i.p.)。去掉膀胱中的尿液之后，充入福尔马林直到尿道中流出为止。以注射到膀胱中的福尔马林体积作为膀胱容积。*与只有CP的对照组比较；+与缓冲液对照组比较。
图54显示KGF-2Δ33与mesna对环磷酰胺诱发之膀胱炎的动物膀胱湿重的协同影响。雄性SD大鼠(350-400g,n=7)于第0天静脉内接受缓冲液或5.0mg/kgKGF-2Δ33，并于第1天施用Mesna(40μ g/g,i.v.)或在相应天数进行两种处理。除盐水对照组外，所有各组均在第1天投用环磷酰胺(300mg/kg,i.p.)。加入一个未治疗组作为CP对照组。第3天，动物于安死术前2小时接受BrdU(100mg/kg,i.p.)。用10％中性缓冲福尔马林固定膀胱，称重并放在组织盒中进行组织学分析。*与只有CP的对照组比较；+与缓冲液组比较。
发明详述根据本发明的一个方面，提供了编码具有图1(SEQ ID NO:2)所示推测的氨基酸序列的多肽，或由1994年12月16日美国典型培养物保藏中心(Patent Depository,10801 University Blvd,Manassas,VA20110-2209)保藏的克隆(保藏号ATCC 75977)的cDNA编码之多肽的分离的核酸(多核苷酸)。
核酸分子除非另有说明，使用自动化DNA测序仪(如373型,可得自AppliedBiosystems公司)测定通过测定本文DNA分子的序列确定的所有核苷酸序列，通过翻译如上测定的DNA序列推测由本文测定的DNA分子编码的多肽的所有氨基酸序列。因此，正如本领域技术人员对由这种自动化方法测定的任何DNA序列已知的那样，本文测定的任何核苷酸序列都可能含有一些错误。由自动化方法测定的核苷酸序列与被测序DNA分子的实际核苷酸序列至少约90％相同，更通常为至少约95％至至少约99.9％相同。通过其它方法，包括本领域中众所周知的人工DNA测序法，可更准确地测定实际的序列。现有技术中已知与实际序列相比，被测定的核苷酸序列中的单个插入或缺失会导致该核苷酸序列翻译过程中的移码现象，从而使从所述插入或缺失点开始，由被测定的核苷酸序列编码的推测的氨基酸序列会与被测序的DNA分子实际编码的氨基酸序列完全不同。
除非另有说明，本文列出的每个“核苷酸序列”以脱氧核糖核苷酸(缩写为A,G,C和T)的序列表示。然而，核酸分子或多核苷酸的“核苷酸序列”对于DNA分子或多核苷酸而言为脱氧核糖核苷酸的序列，对于RNA分子或多核苷酸而言为相应的核糖核苷酸(A,G,C和U)序列，其中特定的脱氧核糖核苷酸序列中的每个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(T)被尿嘧啶核糖核苷酸(U)所代替。例如，关于具有使用脱氧核糖核苷酸缩写列出的SEQ ID NO:1之序列的RNA分子，想表示的是其序列中SEQ ID NO:1的每个脱氧核糖核苷酸A,G或C已被相应的核糖核苷酸A,G或C代替，而每个脱氧核糖核苷酸T已被核糖核苷酸U所代替的RNA分子。
“分离的”核酸分子指的是从其天然环境中得到的核酸分子，DNA或RNA。例如，为了本发明的目的，载体中所含的重组DNA分子被认为是分离的。分离的DNA分子的其它例子包括异源宿主细胞中所含的重组DNA分子或溶液中纯化的(部分纯化或基本上纯化)DNA分子。分离的RNA分子包括本发明DNA分子的体内或体外RNA转录本。本发明的分离的核酸分子另外还包括合成产生的这种分子。
本发明的分离的核酸分子包括含有具有图1所示核苷酸序列(SEQID NO:1)第1-3位起始密码子的开放阅读框(ORF)的DNA分子；含有图1所示的成熟KGF-2蛋白(最后的172或173个氨基酸)(SEQ ID NO:2)之编码序列的DNA分子；和含有实质上与上述不同的序列但因遗传密码的简并性仍编码KGF-2蛋白的DNA分子。当然，遗传密码是本领域中众所周知的，因此，本领域技术人员可常规制备上述简并变体。
编码本发明多肽的多核苷酸可以得自人前列腺和胎儿肺。编码多肽的cDNA片段最初分离自得自人正常前列腺的文库，随后，从随机引发的人胎儿肺cDNA文库中分离编码全长蛋白质的开放阅读框。所述阅读框在结构上与FGF家族相关，它含有编码208个氨基酸残基之蛋白质的开放阅读框，其中大约前35或36个氨基酸残基是推定的前导序列，从而成熟的蛋白质含有173或172个氨基酸。该蛋白质表现出与人角质细胞生长因子最高程度的同源性，在206个氨基酸的一段序列中具有45％的同一性和82％的相似性。已发现在FGF整个家族中保守的序列在本发明的蛋白质中也是保守的，这一点也很重要。
另外，得自文库的KGF-2cDNA的嵌套式PCR结果表明KGF-2也存在潜在的其它剪接形式。具体地说，使用侧翼于KGF-2开放阅读框之N末端的引物，由多个cDNA文库得到0.2kb和0.4kb的PCR产物。0.2kb大小是预期的KGF-2产物，而0.4kb大小可能是KGF-2的其它剪接形式。在得自胃癌，成人睾丸，十二指肠和胰腺的文库中观察到了这一0.4kb产物。
本发明的多核苷酸可以是RNA的形式，也可以是DNA的形式，所述DNA包括cDNA、基因组DNA和合成的DNA。该DNA可以是双链或单链，而若是单链，则可以是编码链，也可以是非编码(反义)链。编码成熟多肽的编码序列可以与图1所示的编码序列(SEQ ID NO:1)或经保藏的克隆中的编码序列相同；或者也可以是不同的编码序列，这一编码序列因遗传密码的丰余性或简并性而编码与图1之DNA(SEQID NO:1)或经保藏的cDNA所编码的相同的成熟多肽。
编码图1推测的成熟多肽(SEQ ID NO:2)或由经保藏的cDNA所编码的推测的成熟多肽的多核苷酸可包括仅有成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和其它编码序列如前导序列或分泌序列或原蛋白质序列；成熟多肽的编码序列(和任选的其它编码序列)和非编码序列如内含子或推测的成熟多肽之编码序列的5’和/或3’非编码序列。另外，已得到全长的mRNA，它含有该基因的5’和3’非翻译区(图3(SEQ IDNO:23))。
由于上文讨论的测序错误概率以及针对不同的已知蛋白质中前导序列的切割位点的可变异性，本领域技术人员会期望由经保藏的cDNA所编码的真正的KGF-2多肽含有约208个氨基酸，但可以是200-220个氨基酸范围内的任何一种情况；此蛋白质的实际前导序列约为35或36个氨基酸，但可以是30-40个氨基酸范围内的任何一种情况。
因此，术语“编码多肽的多核苷酸”包括仅包含多肽编码序列的多核苷酸以及包含另外的编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明另外涉及上文所述多核苷酸的变体，所述多核苷酸变体编码具有图1推定的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)之多肽或由经保藏克隆的cDNA编码的多肽的片段、类似物和衍生物。所述多核苷酸的变体可以是该多核苷酸天然产生的等位基因变体或该多核苷酸非天然产生的变体。
因此，本发明包括编码与图1(SEQ ID NO:2)所示相同的推测成熟多肽或与经保藏克隆的cDNA所编码的相同的推测成熟多肽的多核苷酸，以及这种多核苷酸的变体，所述变体编码图1(SEQ ID NO:2)所示多肽或由经保藏克隆的cDNA所编码多肽的片段、衍生物或类似物。这种核苷酸变体包括缺失变体、取代变体和添加或插入变体。
本发明包括编码可用作治疗肽的KGF-2模拟肽的多核苷酸。模拟的KGF-2肽是一些短肽，它们能够通过结合和激活KGF-2的相关受体来模拟KGF-2蛋白的生物活性。模拟的KGF-2肽也可以结合并抑制KGF-2的相关受体。KGF-2受体包括但不限于FGFR2ⅲb和FGFR1ⅲb。这种模拟肽可得自诸如，但不限于噬菌体展示或组合化学的方法。例如，Wrighton等，科学，273:458-463(1996)所述的产生模拟的KGF-2肽的方法。
如上所述，多核苷酸具有的编码序列可以是图1所示编码序列(SEQID NO:1)或经保藏克隆之编码序列的天然产生的等位基因变体。正如本领域中所熟知，等位基因变体是多核苷酸序列的一种可替换形式，它可具有一个或多个核苷酸的取代，缺失或添加，但基本上不会改变编码多肽的功能。
本发明也包括多核苷酸，其中成熟多肽的编码序列可以在相同的阅读框中与有助于宿主细胞表达和分泌多肽的多核苷酸序列(例如作为分泌序列行使功能以控制从细胞中转运出多肽的前导序列)融合。具有前导序列的多肽是前蛋白，它可能具有可被宿主细胞切割从而形成多肽的成熟形式的前导序列。该多核苷酸也可以编码蛋白原，所述蛋白原是成熟的蛋白质加上额外的5’氨基酸残基。具有原序列的成熟蛋白质是蛋白原，它是蛋白质的无活性形式。一旦原序列被切割掉，剩下的就是有活性的成熟蛋白质。
因此，例如，本发明的多核苷酸可以编码成熟的蛋白质，或具有原序列的蛋白质，或既具有原序列也具有前序列(前导序列)的蛋白质。
本发明的多核苷酸也可以具有在框内与一种标记序列融合的编码序列，所述标记序列可用于纯化本发明的多肽。在宿主为细菌的情况下，该标记序列可以是由pQE-9载体提供的六组氨酸标记物以纯化与标记序列融合的成熟多肽，或例如，当使用哺乳动物宿主，如COS-7细胞时，标记序列也可以是血凝素(HA)标记物。HA标记物相当于得自流感病毒血凝素蛋白的表位(Wilson,Ⅰ等，细胞，37:767(1984))。
术语“基因”指的是参与产生多肽链的DNA区段；它包括编码区之前和之后的区域(前导序列和尾随序列)以及各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
本发明全长基因的片段可被用作cDNA文库的杂交探针以分离全长的cDNA和分离与该基因具有高度序列相似性或相似的生物活性的其它cDNA。这种类型的探针优选具有至少30个碱基，并可含有例如50个或更多个碱基。所述探针可被用于鉴定对应于全长转录本的cDNA克隆和含有包括调节和启动子区域、外显子和内含子的完整基因的基因组克隆。筛选的例子包括通过使用已知的DNA序列合成寡核苷酸探针以分离该基因的编码区。使用具有与本发明基因互补的序列的经标记的寡核苷酸筛选人cDNA、基因组DNA或cDNA文库以确定该探针与文库的哪些成员杂交。
本发明的其它实施方案包括分离的核酸分子，所述核酸分子含有的多核苷酸具有与(a)编码具有图1(SEQ ID NO:2)完整的氨基酸序列(包括推测的前导序列)的全长KGF-2多肽的一个核苷酸序列；(b)编码具有图1(SEQ ID NO:2)中约第36或37至208位氨基酸序列的成熟KGF-2多肽(除去前导序列的全长多肽)的一个核苷酸序列；(c)编码具有由ATCC保藏号75977中所含cDNA克隆编码的完整氨基酸序列(包括前导序列)的全长KGF-2多肽的一个核苷酸序列；(d)编码具有由ATCC保藏号75977中所含cDNA克隆编码的氨基酸序列的成熟KGF-2多肽的一个核苷酸序列；(e)编码上述任一种KGF-2类似物或缺失突变体的一个核苷酸序列；或(f)与(a),(b),(c),(d)或(e)中任一个核苷酸序列互补的一个核苷酸序列至少90％相同，更优选至少95％,96％,97％,98％或99％相同的核苷酸序列。
具有与参照的编码KGF-2多肽的核苷酸序列至少，例如95％“相同”的核苷酸序列的多核苷酸指的是除了该多核苷酸序列在参照的编码KGF-2多肽的核苷酸序列的每100个核苷酸中可包括多至5个点突变外，多核苷酸的核苷酸序列与参照序列是相同的。换句话说，为了得到具有与参照的核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列的多核苷酸，参照序列中多至5％的核苷酸可缺失或被另一种核苷酸取代，或者多至参照序列之总核苷酸的5％的大量核苷酸可插入参照序列中。查询序列可以是SEQ ID NO:1所示的整个序列，ORF(开放阅读框)，或本文所述的任何片段。
在实际情况中，例如，任何特殊核酸分子是否与本发明核苷酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同可用已知的计算机软件常规地确定。确定查询序列(本发明序列)和指示序列间最佳总体匹配的优选方法，也称综合序列对比，可用基于Brutlag等,Comp.Appl.Biosci.6:237-245(1990)运算法则的FASTDB计算机软件确定。在序列对比中，查询和指示序列均为DNA序列。可通过将U转变为T来比较RNA序列。所说综合序列对比的结果以相同性百分比表示。在DNA序列的FASTDB对比中，用于计算相同性百分比的优选参数为矩阵(Matrix)=Unitary,k-tuple=4，错配罚分(Mismatch Penalty)=1，连接罚分(Joining Penalty)=30，随机化分组长度(Randomization Group Length)=0，截断分(Cutoffscore)=1，缺口罚分(Gap Penalty)=5，缺口大小罚分(Gap Size Penalty)=0.05，窗口大小(WindoW Size)=500或指示核苷酸序列长度(选择较短者)。若指示序列由于5’或3’缺失，不是由于内部缺失而比查询序列短，必须对结果进行人工矫正。这是因为在计算相同性百分比时，FASTDB软件不考虑指示序列的5’和3’截短。对于相对查询序列而言5’或3’端截短的指示序列，通过计算位于指示序列5’和3’的不相配/匹配的查询序列碱基数作为查询序列总碱基的百分比，矫正相同性百分比。核苷酸是否相配/匹配由FASTDB序列对比的结果决定。然后从用指定参数通过以上FASTDB软件计算的相同性百分比中减去此百分率，以得到最终的相同性百分比值。此修正值即本发明中涉及的值。正如FASTDB序列对比所展示的，人工调整相同性百分比值时，只计算与查询序列不相配/匹配的、位于指示序列5’和3’碱基外的碱基。
例如，一90个碱基长的指示序列与100个碱基长的查询序列排列以确定相同性百分比。缺失发生于指示序列5’端，因此FASTDB序列对比显示5’端头10个碱基不相配/匹配。这10个未配对碱基代表了序列的10％(不匹配的5’和3’端碱基数/查询序列的总碱基数)，因此从FASTDB软件计算的相同性百分比中减去10％。若余下90个碱基完全匹配，则最终的相同性百分比为90％。在另一例子中，90个碱基长的指示序列与100个碱基长的查询序列相比较。这次缺失在内部，以致在指示序列的5’和3’端无与查询序列不相配/匹配的碱基。这种情况下，对用FASTDB计算的相同性百分比不作人为的修正。再者，只对与查询序列不相配/匹配的指示序列的5’和3’碱基人为修正。为了本发明的目的，不进行其它的人工修正。
KGF-2变体可包含编码区、非编码区或两者的改变。特别优选的是包括发生沉默取代、加入或缺失，而又不改变所编码之多肽的性质或活性的多核苷酸变体。优选的是由于遗传密码的简并性所致的沉默取代而产生的核苷酸变体。此外，其中合并有5-10、1-5或1-2个氨基酸被取代、缺失或加入的变体也是可取的。可因各种原因，如为了使密码子表达在特定宿主中实现最佳化而产生KGF-2多核苷酸变体(将人mRNA中的密码子改变成细菌宿主如大肠杆菌优选的密码子)。
或者，也可使用已知的计算机程序，如Bestfit程序(威斯康星序列分析程序包，Unix第8版，Genetics Computer Group,UniversityResearch Park,575 Science Drive,Madison,WI53711)常规确定是否任何特定的核酸分子与例如图1(SEQ ID NO:2)所示的核苷酸序列或经保藏的cDNA克隆的核苷酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％或99％相同。Bestfit使用Smith和Waterson，应用数学进展(Advances in Applied Mathematics),2:482-489(1981)的局部同源性算法规则来找出两个序列之间同源性最好的区段。当使用Bestfit或任何其它序列排列程序来确定特定的序列是否与，例如根据本发明的参照序列95％相同时，参数的设置当然应使得是对参照核苷酸序列的全长计算同一性百分比，并且允许存在达参照序列总核苷酸数目5％的同源性缺口。
本申请涉及与图1[SEQ ID NO:1]所示核酸序列或经保藏cDNA的核酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％或99％相同的核酸分子，而不论它们是否编码具有KGF-2活性的多肽。这是因为甚至当一种特定的核酸分子不编码具有KGF-2活性的多肽时，本领域技术人员仍知道如何将该核酸分子用作例如杂交探针或聚合酶链反应(PCR)的引物。不编码具有KGF-2活性的多肽的本发明核酸分子的用途特别地包括(1)分离cDNA文库中的KGF-2基因或其等位基因变体；(2)与中期染色体的伸展物原位杂交(如“FISH”)以提供KGF-2基因精确的染色体定位，例见Verma等，人类染色体基础技术手册，Pergamon出版社，纽约(1988)；和Northern印迹分析以检测特定组织中的KGF-2mRNA表达。
然而，优选的是具有与图1[SEQ ID NO:1]所示核酸序列或经保藏cDNA的核酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％或99％相同的序列的核酸分子，所述核酸分子实际上可编码具有KGF-2蛋白活性的多肽。“具有KGF-2活性的多肽”指的是经特殊的生物学试验测定，表现出与本发明野生型KGF-2蛋白的活性相似，但不必相同的活性，或与野生型KGF-2蛋白(全长蛋白质或，优选为成熟的蛋白质)相比有所增强的活性的多肽。
例如，下文实施例中公开了KGF-2活性的检测方法。使用这些检测方法可测定部分纯化的或纯化的天然或重组蛋白质的KGF-2活性。
KGF-2可刺激表皮角质细胞而不是如成纤维细胞之类的间充质细胞的增殖。因此，“具有KGF-2蛋白活性的多肽”包括在下文实施例所述的角质细胞增殖试验中表现出KGF-2活性，并能与FGF受体同工型1-ⅲb和2-ⅲb结合的多肽。尽管活性水平不必与KGF-2蛋白的相同，但优选“具有KGF-2蛋白活性的多肽”表现出与KGF-2蛋白基本相似的活性(即候选多肽相对于参照的KGF-2蛋白而言表现出较高的活性，或活性更小不超过10倍，优选不高于2倍的活性)。
当然，由于遗传密码的简并性，本领域技术人员可立即认识到具有与经保藏的cDNA的核酸序列或图1[SEQ ID NO；1]所示核酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％或99％相同的序列的大量核酸分子可编码“具有KGF-2蛋白活性”的多肽。实际上，由于这些核苷酸序列的简并性变体都编码相同的多肽，因此本领域技术人员甚至无需进行上述的比较试验即可明了这一点。本领域技术人员还会意识到，对于这种不是简并变体的核酸分子而言，相当数目也编码具有KGF-2蛋白活性的多肽。这是因为熟练的技术人员完全能掌握不大可能或不可能显著影响蛋白质功能的氨基酸取代(如一个脂肪族氨基酸被另一个脂肪族氨基酸取代)。
例如，有关如何进行表型沉默的氨基酸取代的指导例见Bowie,J.U等，“译解蛋白质序列中的信息对氨基酸取代的耐受”，科学，247:1306-1310(1990)，其中作者指出了研究氨基酸序列对变化的耐受性有两种主要的方法。第一种方法依靠的是进化过程，其中突变被自然选择接受或排斥。第二种方法使用基因工程在克隆基因的特定位置导入氨基酸变化，并选择或筛选以鉴定出保持功能性的序列。如作者所指出的，这些研究已揭示蛋白质对氨基酸取代具有令人惊奇的耐受性。作者进一步指出在蛋白质的某些位置哪些氨基酸的变化可能是允许的。例如，大多数隐蔽的氨基酸残基需要非极性的侧链，而表面侧链的特征一般很少是保守的。其它这种表型沉默取代描述于Bowie,J.U等(文献同上)和本文提及的参考文献。
本发明另外涉及一类多核苷酸，当它们的序列与上文所述序列之间有至少70％，优选至少90％，更优选至少95％，还要更优选96％，97％,98％,99％同一性时，能够与上文所述序列杂交上。本发明具体地涉及在严紧条件下能够与上文所述多核苷酸杂交的多核苷酸。本文所用术语“严紧条件”是指仅当序列之间有至少95％、优选至少97％同一性时才会发生杂交。在一个优选实施方案中，能够与上文所述多核苷酸杂交上的多核苷酸所编码的多肽能基本上维持与由图1(SEQID NO:1)之cDNA或经保藏的cDNA编码的成熟多肽相同的生物学功能或活性。
“严紧杂交条件”的例子包括于42℃，在含有50％甲酰胺，5×SSC(150mM NaCl,15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH7.6),5×Denhardt’s溶液，10％硫酸葡聚糖和20μg/ml变性的经剪切的鲑精DNA的溶液中保温过夜，接着于65℃用0.1×SSC洗涤滤膜。
或者，多核苷酸可至少具有20个碱基，优选30个碱基，更优选至少具有50个碱基，如上所述它能与本发明的多核苷酸杂交并与本发明的多核苷酸具有同一性，它有可能维持或不能维持活性。例如，可将这种多核苷酸用作SEQ ID NO:1之多核苷酸的探针，例如用以回收多核苷酸或用作诊断探针或用作PCR引物。
当然，能够与参照多核苷酸(如经保藏的cDNA克隆)的较大部分，如长度为50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725或750nt的部分，或甚至与全长的参照多核苷酸杂交的多核苷酸也可用作本发明的探针，对应于经保藏的cDNA的核苷酸序列或图1[SEQ ID NO:1]所示的核苷酸序列的大部分(如果不是全部的话)的多核苷酸也一样能用作探针。例如，“长度至少为20nt”的多核苷酸部分是指参照多核苷酸的核苷酸序列(如经保藏的cDNA或图1[SEQ ID NO:1]所示的核苷酸序列)中的20个或更多个邻接的核苷酸。如上所述，所述部分在诊断上可用作根据常规DNA杂交技术的探针或用作引物从而通过聚合酶链反应(PCR)扩增靶序列，例见分子克隆，实验室手册，第2版，Sambrook,J.,Fritsch,E.F和Maniatis,T(1989)编，冷泉港实验室出版社，该文献全文列入本文作为参考。
由于KGF-2 cDNA克隆已被保藏，其确定的核苷酸序列示于图1[SEQ ID NO:1]，产生能与KGF-2 cDNA分子的一部分杂交的多核苷酸对于本领域技术人员而言应是常规技术。例如，可简单地使用限制性内切核酸酶切割或通过超声处理KGF-2 cDNA克隆进行剪切以产生不同大小的DNA部分，这些DNA部分就是能与KGF-2 cDNA分子的一部分杂交的多核苷酸。或者，可根据已知技术合成产生本发明的杂交多核苷酸。当然，仅能与polyA序列(如图1[SEQ ID NO:1]所示KGF-2 cDNA之3’末端poly(A)序列)，或T(或U)残基的互补序列杂交的多核苷酸不包括在用于与本发明的核酸部分杂交的本发明的多核苷酸中，因为这种多核苷酸可与含有poly(A)序列或其互补物的任何核酸分子(如实际上任何一种双链cDNA克隆)杂交上。
本发明另外还提供了含有编码KGF-2蛋白之携有表位的部分的多核苷酸的分离的核酸分子。具体地说，所提供的分离的核酸分子编码含有图1(SEQ ID NO:2)中的下列氨基酸残基的多肽，本发明人已测定出它们是KGF-2蛋白的抗原性区域1．Gly41-Asn71:GQDMVSPEATNSSSSSFSSPSSAGRHVRSYN[SEQID NO:25]；2．Lys91-Ser109:KIEKNGKVSGTKKENCPYS[SEQ ID NO:26]；3．Asn135-Tyr164:NKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTY[SEQ ID NO:27]；和4．Asn181-Ala199:NGKGAPRRGQKTRRKNTSA[SEQ ID NO:28]。还有另外两个较短的推测抗原性区域，图1(SEQ ID NO:2)的Gln74-Arg78和图1(SEQ ID NO:2)的Gln170-Gln175。下文将详细描述产生KGF-2之携有表位的部分的方法。
可根据有关用于专利方法的微生物保藏物国际认可的布达佩斯条约中的款项维持本文所述的保藏物。这些保藏物仅为方便本领域技术人员而提供，而不是认定根据35U.S.C.ξ112的规定需要保藏。经保藏材料中所含的多核苷酸序列及其所编码多肽的氨基酸序列均引入本文作为参考，当这些序列与本文所述序列有冲突时，以前者为准。制备，使用或销售经保藏的材料需经许可，本申请未授予这种许可。KGF-2多肽和片段本发明另外涉及具有图1(SEQ ID NO:2)的推定氨基酸序列或具有由经保藏的cDNA编码的氨基酸序列的多肽，以及这种多肽的片段，类似物和衍生物。
本领域技术人员能理解，由于上文讨论的测序错误概率以及针对不同的已知蛋白质中前导序列的裂解位点的可变异性，由经保藏的cDNA所编码的实际的KGF-2多肽含有约208个氨基酸，但可以是200-220个氨基酸范围内的任何数目；此蛋白质的实际前导序列约为35或36个氨基酸，但可以是30-40个氨基酸范围内的任何数目。
涉及图1(SEQ ID NO:2)的多肽或经保藏的cDNA所编码的多肽时，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”指的是保留了与这种多肽基本上相同的生物学功能或活性的多肽。因此，类似物包括可通过裂解蛋白质部分而产生有活性的成熟多肽的蛋白质。
本发明的多肽可以是重组的多肽，天然的多肽或合成的多肽，优选为重组的多肽。
图1(SEQ ID NO:2)的多肽或经保藏的cDNA所编码的多肽的片段，衍生物或类似物可以是下列各种多肽(ⅰ)其中一个或多个氨基酸残基被保守的或非保守的氨基酸残基(优选保守的氨基酸残基)取代，这种被取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的氨基酸残基，或(ⅱ)其中一个或多个氨基酸残基包括取代基，或(ⅲ)其中成熟的多肽与另一种化合物，如提高多肽半寿期的化合物(如聚乙二醇)融合，或(ⅳ)其中另外的氨基酸与成熟多肽融合，如前导序列或分泌序列或用于纯化成熟多肽的序列或蛋白原序列。鉴于本文的教导，本领域技术人员不难掌握这种片段，衍生物和类似物。
术语“肽”和“寡肽”被认为是同义词(人们普遍这么认为)，当上下文中需要指明由肽键偶联的至少2个氨基酸的链时，这两个术语可以互换使用。本文中对含有10个氨基酸残基以上的链使用“多肽”一词。本文所有寡肽和多肽式或序列从左至右为氨基末端至羧基末端。
本领域技术人员应当认识到，KGF-2多肽的一些氨基酸序列可以改变，而不会显著影响蛋白质的结构或功能。如果分析序列中的这种差异，应能记得蛋白质中存在决定活性的至关重要的区域。一般而言，可以取代形成三级结构的残基，只要使用行使类似功能的残基即可。在其它场合下，如果变化发生在蛋白质的非重要区域，那么残基的类型有可能完全不重要。
因此，本发明另外包括基本上表现出KGF-2多肽活性或包括诸如下文所讨论的蛋白质部分的KGF-2蛋白区域的KGF-2多肽的各种变异。这种突变体包括缺失，插入，倒位，重复和类型取代(如原则是用一种亲水的残基取代另一种亲水的残基，而不是用强亲水的残基取代强疏水的残基)。小的变化或这种“中性的”氨基酸取代一般对活性影响很小。
通常视为保守的取代是脂肪族氨基酸Ala,Val,Leu和Ile中相互之间的取代；羟基残基Ser和Thr的互换，酸性残基Asp和Glu的互换，酰胺残基Asn和Gln之间的取代，碱性残基Lys和Arg的互换以及芳香族残基Phe,Tyr的相互取代。
如上文详述，有关何种氨基酸变化很可能是表型沉默的(即不会对功能有显著不利的影响)的其它指南例见Bowie,J.U.等人的“译解蛋白质序列中的信息对氨基酸取代的耐受”，科学，247:1306-1310(1990)。
本发明包括编码可用作治疗肽的KGF-2模拟肽。模拟的KGF-2肽是一些短肽，它们通过结合和激活KGF-2的相关受体来模拟KGF-2蛋白的生物活性。模拟的KGF-2肽也可以结合并抑制KGF-2的相关受体。KGF-2受体包括但不限于FGFR2ⅲb和FGFR1ⅲb。这种模拟肽可得自例如，但不限于噬菌体展示或组合化学的方法。例如，Wrighton等，科学，273:458-463(1996)所述的方法可用于产生模拟的KGF-2肽。
优选以分离的形式提供本发明的多肽和多核苷酸，并优选已被纯化为均质。
本发明的多肽优选为分离的形式，“分离的多肽”是指从其天然环境中取出的多肽，因此，为了本发明的目的，重组宿主细胞产生和/或含有的多肽被认为是分离的，“分离的多肽”还指从重组宿主细胞中或天然来源部分或基本上纯化好的多肽。
本发明的多肽包括SEQ ID NO:2的多肽(尤其是成熟的多肽)以及与SEQ ID NO:2的多肽至少90％,95％,96％,97％,98％,99％相似(更优选至少90％,95％,96％,97％,98％,99％相同)的多肽，还包括这种多肽的部分，多肽的所述部分(如下文所述的缺失突变体)一般含有至少30个氨基酸，更优选至少50个氨基酸。
众所周知，通过将一种多肽的氨基酸序列及其保守的氨基酸取代与第二种多肽的序列比较即可确定两种多肽之间的“相似性”。
两个多肽的“相似性百分比”指的是通过使用Bestfit程序(威斯康星序列分析程序包，Unix第8版，Genetics Computer Group,UniversityResearch Park,575 Science Drive,Madison,WI53711)和用于确定相似性的系统设置比较两个多肽的氨基酸序列而产生的相似性评分。Bestfit使用Smith和Waterson(应用数学进展，2:482-489,1981)的局部同源性算法规则来找出两个序列之间相似性最好的区段。
具有与参照的KGF-2多肽的氨基酸序列至少，例如至少95％“相同”的氨基酸序列的多肽指的是除了该多肽序列在参照的KGF-2多肽的氨基酸序列的每100个氨基酸中可包括多至5个氨基酸的改变外，该多肽的氨基酸序列与参照序列是相同的。换句话说，为了得到具有与参照的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽，参照序列中多至5％的氨基酸残基可缺失或被另一种氨基酸取代，或者多至参照序列之总氨基酸残基的5％的大量氨基酸可插入参照序列中。参照序列的这些变化可在参照氨基酸序列的氨基或羧基末端位置发生，也可以在所述末端位置之间的任何位置发生，或者各自散布在参照序列的残基中，或者散布在参照序列内的一个或多个邻接的组中。
具有与本发明查询氨基酸序列有至少例如95％相同的氨基酸序列的多肽指该指示多肽的氨基酸序列除了与查询氨基酸序列相比每100个氨基酸可包括最多5个氨基酸改变之外，其余与查询序列相同。换而言之，为了获得具有与查询氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽，指示序列中最多5％的氨基酸可被插入、缺失或用另外的氨基酸取代。参照序列的这些改变可发生于参照氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或那些末端位置间的任何位置，它们或者各自散布于参照序列的残基中，或者以一个或多个连续组的形式存在于参照序列中。
事实上，例如，任何特殊多肽分子是否与SEQ ID NO:2或由保藏DNA克隆所编码的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同可用已知的计算机软件常规地确定。确定查询序列(query sequence)(本发明序列)和指示序列(subject sequence)间最佳完全匹配的优选方法，也称综合序列对比，可用基于Brutlag等，Comp.Appl.Biosci.6:237-245(1990)运算法则的FASTDB计算机软件确定。在序列对比中，查询序列和指示序列均为核苷酸序列或均为氨基酸序列。所说综合序列对比的结果表示为相同性百分比。在氨基酸序列的FASTDB对比中用于计算相同性百分比的优选参数为矩阵=PAM 0,k-tuple=2，错配罚分=1，连接罚分=20，随机化分组长度=0，截断分=1，缺口罚分=5，缺口大小罚分=0.05，窗口大小=500或指示氨基酸序列长度(取较短者)。若指示序列由于N-或C-端缺失，不是由于内部缺失而比查询序列短，必须对结果进行人工矫正。这是因为在计算相同性百分比时，FASTDB软件不考虑指示序列的N-和C-端截短。对于相对查询序列而言在N-和C-端截短的指示序列，通过计算查询序列中位于指示序列N-和C-端的不相配/匹配的残基数作为查询序列总残基的百分数，矫正相同性百分比。残基是否相配/匹配由FASTDB序列对比的结果决定。然后从用指定参数通过以上FASTDB软件计算的相同性百分比中减去此百分率，以得到最终的相同性百分比值。此最终的相同性百分比值是用于本发明目的的。人工调整相同性百分比值时，只计算与查询序列不相配/匹配的、在指示序列N-和C-端外的残基。即，只考虑指示序列N-和C-最末端残基外的查询残基位置。
例如，将90个氨基酸残基长的指示序列与100个残基长的查询序列排列以确定相同性百分比。缺失发生于指示序列N-端，FASTDB序列对比不显示N-端头10个碱基的相配/匹配。这10个未配对残基代表了序列的10％(不匹配的N-和C-端残基数/查询序列的总残基数)，因此从FASTDB软件计算的相同性百分比中减去10％。若余下90个残基完全匹配，则最终的相同性百分比为90％。在另一例子中，90个残基长的指示序列与100个残基长的查询序列相比较。这次缺失在内部，以致在指示序列的N-和C-端无与查询序列不相配/匹配的残基。这种情况下，用FASTDB计算的相同性百分比不用人为的修正。再者，正如在FASTDB序列对比中所展示的，只有与查询序列不相配/匹配的位于指示序列N-和C-末端的残基位置需人为修正。为了本发明的目的不进行其它的人工修正。
或者，也可使用已知的计算机程序，如Bestfit程序(威斯康星序列分析程序包，Unix第8版，Genetics Computer Group,UniversityResearch Park,575 Science Drive,Madison,WI53711)常规确定是否任何特定的多肽与例如，图1[SEQ ID NO:2]所示的氨基酸序列或经保藏的cDNA克隆所编码的氨基酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％或99％相同。当使用Bestfit或任何其它序列比对程序以确定特定的序列是否，例如与根据本发明的参照序列95％相同时，当然应设置参数以便是在参照氨基酸序列的全长基础上计算同一性百分比，并且达参照序列总氨基酸残基数目5％的同源性缺口是可以允许的。
如下文详述，本发明的多肽可被用于产生多克隆和单克隆抗体，所述抗体可用于下文所述的检测KGF-2蛋白表达的诊断试验中，或用作能增强或抑制KGF-2蛋白功能的激动剂和拮抗剂。另外，这种多肽可被用于酵母双杂交系统以“捕获”也是本发明的候选激动剂和拮抗剂的KGF-2蛋白结合蛋白。酵母双杂交系统描述于Fields和Song，自然，340:245-246(1989)。
另一方面，本发明提供了含有本发明多肽之携有表位的部分的肽或多肽。此多肽部分的所述表位是本发明多肽的免疫原性或抗原性表位。“免疫原性表位”被定义为当整个蛋白质为免疫原时蛋白质中能引发抗体应答的部分。据信这些免疫原性表位仅限于分子上的几个位置。另一方面，蛋白质分子中可与抗体结合的区域被定义为“抗原性表位”。蛋白质的免疫原性表位的数目一般少于抗原性表位的数目，例见Geysen等，美国国家科学院院报，81:3998-4002(1993)。
至于携有抗原性表位(即含有蛋白质分子中可与抗体结合的区域)的肽或多肽的选择，本领域技术人员熟知模拟蛋白质序列一部分的相对短的合成肽一般能刺激产生可与部分模拟的蛋白质发生反应的抗血清。例见Sutcliffe,J.G,Shinnick,T.M,Green,N和Learner,R.A(1983)，与蛋白质上预定位点反应的抗体，科学，219:660-666。经常蛋白质的一级序列代表了能引发产生蛋白质反应性血清的肽，通过一套简单的化学规则可鉴定这种肽，它们既不限于完整蛋白质的免疫决定簇区域(即免疫原性表位)，也不限于氨基或羧基末端。极端疏水的肽和含6个或更少残基的肽一般不能诱导可与模拟蛋白质结合的抗体；较长的、可溶性的肽，尤其是含有脯氨酸残基的肽通常是有效的。Sutcliffe等，文献同上，p661。例如，根据这些指南设计的，含有覆盖流感病毒血凝素HA1多肽链序列75％的8-39个残基的20个肽中有18个可诱导产生能与HA1蛋白或整个病毒反应的抗体；对于MulV聚合酶而言，12个肽中的12个，对于狂犬病糖蛋白而言，18个肽中的18个可诱导产生能沉淀各自蛋白质的抗体。
因此，本发明携有抗原性表位的肽和多肽可用于产生能特异性地与本发明多肽结合的抗体，包括单克隆抗体。因此，通过融合来自经携有抗原表位的肽免疫的供体的脾细胞而得到的大多数杂交瘤通常可分泌能与天然蛋白反应的抗体，Sutcliffe等，文献同上，p663。由携有抗原性表位的肽或多肽产生的抗体可用于检测模拟的蛋白质，针对不同肽的抗体可用于追踪进行翻译后加工的蛋白质前体多个区域的去向。在模拟蛋白质的多种定量或定性测定，如竞争测定中可使用肽和抗肽抗体，因为已经证明甚至短肽(如约9个氨基酸)都可在免疫沉淀试验中结合和替代较大的肽，例见Wilson等，细胞，37:767-778(1984),p777。本发明的抗肽抗体也可用于纯化模拟的蛋白质，例如通过使用本领域所熟知的方法进行吸附层析。
根据上述指南设计的本发明携有抗原性表位的肽和多肽优选含有本发明多肽的氨基酸序列中所含的至少7个，更优选至少9个，最优选约15-约30个氨基酸的序列。然而，包括本发明多肽氨基酸序列的较大部分，含有约30,40,50,60,70,80,90,100或150个，或直至和包括本发明多肽全部氨基酸序列的任何长度的氨基酸的肽或多肽也被认为是本发明携有表位的肽或多肽，也可用于诱导产生与模拟蛋白质反应的抗体。优选携有表位的肽的氨基酸序列被选择为在含水溶剂中具有良好的溶解性(即该序列包括相对亲水的残基，而优选避免高度疏水的残基)；特别优选含有脯氨酸残基的序列。
可用于产生KGF-2特异性抗体的抗原性多肽或肽的非限制性例子包括下列1.Gly41-Asn71:GQDMVSPEATNSSSSSFSSPSSAGRHVRSYN[SEQID NO:25]；2.Lys91-Ser109:KIEKNGKVSGTKKENCPYS[SEQ ID NO:26]；3.Asn135-Tyr164:NKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTY[SEQ ID NO:27]；和4.Asn181-Ala199:NGKGAPRRGQKTRRKNTSA[SEQ ID NO:28]。
还有另外两个较短的推测抗原性区域，图1(SEQ ID NO:2)的Gln74-Arg78和Gln170-Gln175。
通过制备肽或多肽的任何常规方法，包括使用本发明核酸分子的重组方法，可产生本发明携有表位的肽和多肽。例如，可将携有短的表位的氨基酸序列与较大的多肽融合，该多肽可在重组生产和纯化的过程中用作载体，在免疫过程中可用来产生抗肽抗体。也可以使用已知的化学合成方法合成携有表位的肽。例如，Houghten描述了合成大数目肽的一种简单方法，如在4周之内制备和鉴定(通过ELISA-型结合研究)代表HA1多肽一个区段的单个氨基酸变体的10-20mg 248个不同的13残基的肽，Houghten,R.A(1985)，快速固相合成大数目肽的一般方法各个氨基酸水平上的抗原-抗体相互作用的特异性，美国国家科学院院报，82:5131-5135。这种“同时合成多个肽(SMPS)”的方法进一步描述于Houghten等人的美国专利4,631,211(1986)中。在此方法中，将用于固相合成多个肽的各个树脂包含在各个单独的可渗透溶剂的袋中，以最佳利用固相方法中所包括的多个相同的重复步骤。完全人工的方法可同时进行500-1000或更多个肽的合成，Houghten等人，文献同上，p5134。
可根据本领域众所周知的方法，使用本发明携有表位的肽和多肽诱导抗体，例见Sutcliffe等人，文献同上；Wilson等人，文献同上；Chow,M等人，美国国家科学院院报，82:910-914；和Bittle,F.J等人，普通病毒学杂志，66:2347-2354(1985)。通常，可用游离的肽免疫动物；然而，通过将肽与大分子载体，如匙孔血蓝蛋白(KLH)或破伤风类毒素偶联，可提高抗肽抗体的滴度。例如，使用如间-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)的接头，可将含有半胱氨酸的肽与载体偶联，而使用更一般的连接剂如戊二醛可将其它肽与载体偶联。通过例如腹膜内和/或皮内注射含有约100微克肽或载体蛋白和弗氏佐剂的乳剂，可用游离的或与载体偶联的肽免疫动物，如兔，大鼠和小鼠。需要例如以约2周为间隔进行几次加强注射以提供有用的抗肽抗体滴度，通过例如使用吸附于固体表面的游离肽的ELISA试验可检测所述滴度。通过例如将肽吸附于固相支持物上并根据本领域技术人员熟知的方法洗脱选定的抗体，从而选择抗肽抗体，可提高得自经免疫动物的血清中的抗肽抗体滴度。
可根据本领域技术人员熟知的方法鉴定本发明携有免疫原性表位的肽，即当整个蛋白质是免疫原时可引发抗体应答的所述蛋白质的诸部分。例如，Geysen等人(文献同上)公开了在固相支持物上快速地同时合成纯度足以在酶联免疫吸附试验中反应的上百个肽的方法。然后，不用将它们与支持物分开即可轻易地检测合成的肽与抗体的相互作用。按此方法，本领域技术人员可常规地鉴定携有所需蛋白质的免疫原性表位的肽。例如，Geysen等人通过合成一套重叠的覆盖口蹄疫病毒外被蛋白全部213个氨基酸的序列的所有208种可能的六肽，以7个氨基酸的分辨率定位出该蛋白质内免疫学重要的表位。然后，合成完整一套取代肽，其中在表位内每一个位置依次用所有20个氨基酸取代，测定赋予与抗体反应的特异性的特殊氨基酸。因此，通过此方法可常规制备本发明携有表位的肽的肽类似物。Geysen(1987)的美国专利4,708,781中进一步描述了鉴定携有所需蛋白质的免疫原性表位的肽的方法。
Geysen(1990)的美国专利5,194,392中描述了检测或确定单体(氨基酸或其它化合物)序列的一般方法，所述单体是与所需抗体的特定互补位(抗原结合位点)互补之表位的拓扑等价物(即“mimotope”)。更一般地，Geysen(1989)的美国专利4,433,092中描述了检测或确定单体序列的方法，所述单体是与所需特定受体的配体结合位点互补之配体的拓扑等价物。类似地，Houghten,R.A等人(1996)的有关预先烷基化的寡肽混合物的美国专利5,480,971公开了线性的C1-C7-烷基预先烷基化的寡肽和这种肽的系列和文库，以及使用这种寡肽系列和文库测定优先与所需受体分子结合的预先烷基化寡肽之序列的方法。因此，通过这些方法可常规制备本发明携有表位的肽的非肽类似物。
正如本领域技术人员所期望的，本发明的KGF-2多肽及其上述携有表位的片段可与免疫球蛋白(IgG)的恒定区部分联合形成嵌合的多肽。这些融合蛋白便于纯化并显示出体内半寿期增加。例如，由人CD4多肽的前两个结构域和哺乳动物免疫球蛋白重链或轻链恒定区的各个区域组成的嵌合蛋白已显示出这一现象(EPA394,827；Traunecker等人，自然，331:84-86(1988))。因IgG部分而具有由二硫键连接的二聚体结构的融合蛋白在结合和中和其它分子方面比单体的KGF-2蛋白或单独的蛋白质片段更加有效(Fountoulakis等人，生物化学杂志，270:3958-3964(1995))。
根据本发明，也描述了KGF-2新的变体。通过缺失或取代KGF-2的一个或多个氨基酸可产生这些变体。天然的突变被称为等位基因变异，等位基因变异可以是沉默的(所编码的多肽没有变化)，也可以具有改变了的氨基酸序列。
为了尝试改善或改变天然KGF-2的特征，可利用蛋白质工程。也可使用本领域技术人员已知的重组DNA技术产生新的多肽。突变蛋白和缺失可显示出例如增强的活性或增加的稳定性。另外，它们可以较高的得率被纯化，并至少在某些纯化和储存条件下显示出较好的溶解性。下文所示的是所构建的突变的例子。氨基末端和羧基末端缺失使用重组DNA技术已修饰了FGF家族的多个成员。在aFGF和bFGF中，对肝素结合至关重要的带正电的分子已被取代或缺失。经修饰的分子导致肝素结合活性的降低，因此，患者体内被肝素结合的经修饰分子的量会有所降低，由于更多的FGF会到达适当的受体，从而增加了效力(EP0298723)。
含水状态的天然KGF-2相对不稳定，它会遭遇化学和物理降解，从而导致加工和储存过程中生物活性的损失。天然KGF-2在水溶液中，由于温度升高会倾向于聚集，在酸性条件下会失活。
为了改善或改变天然KGF-2的一个或更多个特性，可使用蛋白质工程。Ron等人，生物化学杂志，268(4):2984-2988(1993)报道了即使丧失氨基末端3、8或27个氨基酸残基仍具有肝素结合活性的经修饰KGF蛋白。缺失3和8个氨基酸具有全部的活性。KGF更多个氨基酸的缺失描述于PCT/IB95/00971。羧基末端氨基酸的缺失可增强蛋白质的活性。一个例子是γ干扰素，通过缺失该蛋白质羧基末端的10个氨基酸残基可使活性提高达10倍(Dobeli等人，生物技术杂志，7:199-216(1988))。因此，本发明的一方面是提供KGF-2的多肽类似物和编码这种类似物的核苷酸序列，所述类似物相对于天然KGF-2多肽而言，表现出增强的稳定性(如当暴露于典型的pH，热条件或其它储存条件下)。
下文所示的是特别优选的KGF-2多肽(编号始于蛋白质中的第一个氨基酸(Met)(图1(SEQ ID NO:2))):Thr(残基36)-Ser(残基208)Asn(51)-Ser(208)Cys(37)-Ser(208)Ser(52)-Ser(208)Gln(38)-Ser(208)Ser(53)-Ser(208)Ala(39)-Ser(208)Ser(54)-Ser(208)Leu(40)-Ser(208)Ser(55)-Ser(208)Gly(41)-Ser(208)Ser(56)-Ser(208)Gln(42)-Ser(208)Phe(57)-Ser(208)Asp(43)-Ser(208)Ser(59)-Ser(208)Met(44)-Ser(208)Ser(62)-Ser(208)Val(45)-Ser(208)Ala(63)-Ser(208)Ser(46)-Ser(208)Gly(64)-Ser(208)Pro(47)-Ser(208)Arg(65)-Ser(208)Glu(48)-Ser(208)Val(67)-Ser(208)Ala(49)-(Ser(208) Ser(69)-Ser(208)Thr(50)-Ser(208)Val(77)-Ser(208)Arg(80)-Ser(208)Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-His(207)Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-Val(206)Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-Val(205)Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-Met(204)Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-Pro(203)Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-Leu(202)Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-Phe(201)Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-His(200)Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-Ala(199)Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-Ser(198)Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-Thr(197)Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-Asn(196)Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-Lys(195)Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-Ary(194)Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-Arg(193)Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-Thr(192)Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-Lys(191)Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-Arg(188)Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-Arg(187)Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-Lys(183)优选的实施方案包括N-末端缺失Ala(63)-Ser(208)(KGF-2Δ28)(SEQ ID NO:68)和Ser(69)-Ser(208)(KGF-2Δ33)(SEQ ID NO:96)。其它优选的N-末端和C-末端缺失突变体描述于说明书实施例13和16(c)，并包括图1(SEQ ID NO:2)的Ala(39)-Ser(208)(SEQ IDNO:116)；Pro(47)-Ser(208)；Val(77)-Ser(208)(SEQ ID NO:70)；Glu(93)-Ser(208)(SEQ ID NO:72)；Glu(104)-Ser(208)(SEQ IDNO:74)；Val(123)-Ser(208)(SEQ ID NO:76)；和Gly(138)-Ser(208)(SEQ ID NO:78)。其它优选的C-末端缺失突变体包括图1(SEQ IDNO:2)的Met(1),Thr(36)，或Cys(37)-Lys(153)。
本发明中也包括N-末端和C-末端氨基酸都有缺失的缺失突变体。这种突变体包括上述N-末端缺失突变体和C-末端缺失突变体的所有联合，例如图1(SEQ ID NO:2)的Ala(39)-His(200),Met(44)-Arg(193)，Ala(63)-Lys(153),Ser(69)-Lys(153)等等。使用本领域技术人员熟知的重组技术可进行这种联合。
因此，一方面，本发明提供了N-末端的缺失突变体，这种突变体包括那些除图1(SEQ ID NO:2)中至少前38个N-末端氨基酸残基(即至少Met(1)-Gln(38))但不超过前147个N-末端氨基酸残基缺失外，含有图1(SEQ ID NO:2)所示其余氨基酸序列的突变体。或者，缺失包括图1(SEQ ID NO:2)中至少前38个N-末端氨基酸残基(即至少缺失Met(1)-Gln(38))但不超过前137个N-末端氨基酸残基。或者，缺失包括图1(SEQ ID NO:2)中至少前46个N-末端氨基酸残基但不超过前137个N-末端氨基酸残基。或者，缺失包括图1(SEQ ID NO:2)中至少前62个N-末端氨基酸残基但不超过前137个N-末端氨基酸残基。或者，缺失包括图1(SEQ ID NO:2)中至少前68个N-末端氨基酸残基但不超过前137个N-末端氨基酸残基。或者，缺失包括图1(SEQ ID NO:2)中至少前76个N-末端氨基酸残基但不超过前137个N-末端氨基酸残基。或者，缺失包括图1(SEQ ID NO:2)中至少前92个N-末端氨基酸残基但不超过前137个N-末端氨基酸残基。或者，缺失包括图1(SEQ IDNO:2)中至少前103个N-末端氨基酸残基但不超过前137个N-末端氨基酸残基。或者，缺失包括图1(SEQ ID NO:2)中至少前122个N-末端氨基酸残基但不超过前137个N-末端氨基酸残基。
除了上述N-末端缺失突变体的范围以外，本发明也涉及上述范围的所有联合，如图1(SEQ ID NO:2)中至少前62个N-末端氨基酸残基但不超过前68个N-末端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO:2)中至少前62个N-末端氨基酸残基但不超过前76个N-末端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO:2)中至少前62个N-末端氨基酸残基但不超过前92个N-末端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO:2)中至少前62个N-末端氨基酸残基但不超过前103个N-末端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ[D NO:2)中至少前68个N-末端氨基酸残基但不超过前76个N-末端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO:2)中至少前68个N-末端氨基酸残基但不超过前92个N-末端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO:2)中至少前68个N-末端氨基酸残基但不超过前103个N-末端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO:2)中至少前46个N-末端氨基酸残基但不超过前62个N-末端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO:2)中至少前46个N-末端氨基酸残基但不超过前68个N-末端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO:2)中至少前46个N-末端氨基酸残基但不超过前76个N-末端氨基酸残基的缺失；等等。
另一方面，本发明提供了C-末端缺失突变体。优选所述C-末端缺失突变体的N-末端氨基酸残基是图1(SEQ ID NO:2)的氨基酸残基1(Met),36(Thr)或37(Cys)。这种突变体包括那些除图1(SEQ ID NO:2)中至少最后一个C-末端氨基酸残基(Ser(208))但不超过最后55个C-末端氨基酸残基缺失(即缺失图1(SEQ ID NO:2)的氨基酸残基Glu(154)-Ser(208))外，含有图1(SEQ ID NO:2)所示其余氨基酸序列的突变体。或者，缺失包括图1(SEQ ID NO:2)中至少最后一个C-末端氨基酸残基但不超过最后65个C-末端氨基酸残基。或者，缺失包括图1(SEQ ID NO:2)中至少最后10个C-末端氨基酸残基但不超过最后55个C-末端氨基酸残基。或者，缺失包括图1(SEQ ID NO:2)中至少最后20个C-末端氨基酸残基但不超过最后55个C-末端氨基酸残基。或者，缺失包括图1(SEQ ID NO:2)中至少最后30个C-末端氨基酸残基但不超过最后55个C-末端氨基酸残基。或者，缺失包括图1(SEQID NO:2)中至少最后40个C-末端氨基酸残基但不超过最后55个C-末端氨基酸残基。或者，缺失包括图1(SEQ ID NO:2)中至少最后50个C-末端氨基酸残基但不超过最后55个C-末端氨基酸残基。
除了上述C-末端缺失突变体的范围以外，本发明也涉及上述范围的所有联合，如图1(SEQ ID NO:2)中至少最后一个C-末端氨基酸残基但不超过最后10个C-末端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO:2)中至少最后一个C-末端氨基酸残基但不超过最后20个C-末端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO:2)中至少最后一个C-末端氨基酸残基但不超过最后30个C-末端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO:2)中至少最后一个C-末端氨基酸残基但不超过最后40个C-末端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO:2)中至少最后10个C-末端氨基酸残基但不超过最后20个C-末端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO:2)中至少最后10个C-末端氨基酸残基但不超过最后30个C-末端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO:2)中至少最后10个C-末端氨基酸残基但不超过最后40个C-末端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO:2)中至少最后20个C-末端氨基酸残基但不超过最后30个C-末端氨基酸残基的缺失；等等。
另一方面，本发明也包括N-末端和C-末端残基都缺失了氨基酸的缺失突变体。这种突变体包括上述N-末端缺失突变体和C-末端缺失突变体的所有联合。这种突变体包括除图1(SEQ ID NO:2)中至少前46个N-末端氨基酸残基但不超过前137个N-末端氨基酸残基缺失，图1(SEQ ID NO:2)中至少最后一个C-末端氨基酸残基但不超过最后55个C-末端氨基酸残基缺失外，含有图1(SEQ ID NO:2)所示其余氨基酸序列的突变体。或者，缺失可包括图1(SEQ ID NO:2)中至少前62,68,76,92,103或122个N-末端氨基酸残基但不超过前137个N-末端氨基酸残基的缺失，和图1中至少最后10,20,30,40或50个C-末端氨基酸残基但不超过最后55个C-末端氨基酸残基的缺失。另外还包括上述范围的所有联合。氨基酸取代本发明的另一方面也包括氨基酸的取代。天然的成熟KGF-2含有44个带电的残基，其中的32个带正电。根据这种残基在蛋白质三维结构中的位置，用带负电或不带电的氨基酸取代一个或多个这些成簇的残基可改变相邻残基的静电相互作用，对于增加蛋白质稳定性和减少蛋白质聚集是有用的。蛋白质的聚集不仅会导致活性的丧失，也会给药物制剂的制备带来问题，因为它们可能会是免疫原性的(Pinckard等人，临床实验免疫学，2:331-340(1967),Robbins等人，糖尿病，36:838-845(1987),Cleland等人，Crit.Rev.Therapeutic Drug CarrierSystems,10:307-377(1993))。任何修饰都应考虑到使蛋白质分子三级结构中的电荷排斥最小化。因此，特别令人感兴趣的是用另一种带电的氨基酸和用中性的或带负电的氨基酸取代带电的氨基酸，后者会导致蛋白质所带的正电荷减少，从而改善KGF-2的特性。这种改善包括与天然的KGF-2蛋白相比，类似物的稳定性有所增加和聚集作用有所降低。
氨基酸的取代也可以改变与细胞表面受体结合的选择性，Ostade等人，自然，361:266-268(1993)中描述了某些TNFα突变导致TNFα仅选择性地与两种已知TNF受体之一结合。
KGF-2分子可包括因自然突变或因人为操作所致的一个或多个氨基酸取代，缺失或添加。一些优选突变的例子是Ala(49)Gln,Asn(51)Ala,Ser(54)Val,Ala(63)Pro,Gly(64)Glu,Val(67)Thr,Trp(79)Val,Arg(80)Lys,Lys(87)Arg,Tyr(88)Trp,Phe(89)Tyr,Lys(91) Arg,Ser(99)Lys,Lys(102)Gln,Lys103(Glu),Glu(104)Met,Asn(105)Lys,Pro(107)Asn,Ser(109)Asn,Leu(111)Met,Thr(114)Arg,Glu(117)Ala,Val(120)Ile,Val(123)lle,Ala(125)Gly,Ile(126)Val,Asn(127)Glu,Asn 127)Gln,Tyr(130)Phe,Met(134)Thr,Lys(136)Glu,Lys(137)Glu,Gly(142)Ala,Ser(143)Lys,Phe(146)Ser,Asn(148)Glu,Lys(151)Asn,Leu(152)Phe,Glu(154)Gly,Glu(154)Asp,Arg(155)Leu,Glu(157)Leu,Gly(160)His,Phe(167)Ala,Asn(168)Lys,Gln(170)Thr,Arg(174)Gly,Tyr(177)Phe,Gly(182)Gln,Ala(185)Val,Ala(185)Leu,Ala(185)Ile,Arg(187)Gln(190)Lys,Lys(195)Glu,Thr(197)Lys,Ser(198)Thr,Arg(194)Glu,Arg(194)Gln,Lys(191)Glu,Lys(191)Gln,Arg(188)Glu,Arg(188)Gln,Lys(183)Glu,至于符号说明，例如Ala(49)Gln指的是图1(SEQ ID NO:2)第49位的Ala被Gln取代。
优选变化为微不足道的，如不会显著影响蛋白质的折叠或活性的保守氨基酸取代。下文所示的是本领域技术人员熟知的保守氨基酸取代的例子芳香族苯丙氨酸，色氨酸，酪氨酸疏水的亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸极性的谷氨酰胺，天冬酰胺碱性的精氨酸，赖氨酸，组氨酸酸性的天冬氨酸，谷氨酸小的丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸，甲硫氨酸，甘氨酸当然，熟练的技术人员可根据包括上述那些在内的很多因素决定氨基酸取代的数目。一般而言，根据目的，任何给定KGF-2多肽的取代数目不超过50,40,30,20,10,5或3个。例如，在KGF-2C-末端一些可改善稳定性的取代描述于上文和实施例22中。
通过本领域技术人员熟知的方法，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，科学，244:1081-1085(1989))可鉴定KGF-2中对功能至关重要的氨基酸。后一种方法在分子中的每个残基处导入单个丙氨酸突变，然后检测所得突变体分子的生物活性，如受体结合或体外和体内增殖活性(例见实施例10和11)。通过结构分析，如结晶作用，核磁共振或光亲和标记也可确定对配体-受体结合至关重要的位点(例见Smith等人，分子生物学杂志，224:899-904(1992)；和de Vos等人，科学，255:306-312(1992))。
本发明的另一方面是用丝氨酸取代氨基酸第37和106和150位的半胱氨酸。半胱氨酸的奇数数目意味着至少一个半胱氨酸残基可用于分子间交联或成键，所述交联或成键可导致蛋白质采取不符合需要的四级结构。一个或多个半胱氨酸被丝氨酸或例如丙氨酸所取代的新的KGF-2蛋白一般以较高得率的可溶的、正确折叠的蛋白质形式被纯化。尽管未被证实，但据信第106位的半胱氨酸残基对于功能是至关重要的，此半胱氨酸在所有其它FGF家族成员中是高度保守的。
本发明的另一方面是KGF-2与其它蛋白质或其片段的融合蛋白，如与其它FGF蛋白，如KGF(FGF-7),bFGF,aFGF,FGF-5,FGF-6等的融合蛋白或杂合体。已报道了KGF(FGF-7)的这种杂合体。在公开的PCT申请号90/08771中，产生了由KGF的前40个氨基酸残基和aFGF的C-末端部分组成的嵌合蛋白。据报道该嵌合体象KGF一样靶向角质细胞，但缺乏对肝素的敏感性，后者是aFGF而不是KGF的特征。与免疫球蛋白(IgG)恒定区的部分融合而成的融合蛋白经常显示出增加的体内半寿期。由人CD4多肽前2个结构域和哺乳动物免疫球蛋白重链或轻链恒定区的各个区域组成的嵌合蛋白已显示出这一点(欧洲专利申请，公开号为394827,Traunecker等人，自然，331，84-86(1988))。具有二硫键连接的二聚体结构的融合蛋白也能更有效地结合单独的单体分子(Fountoulakis等人，生物化学杂志，270:3958-3964(1995))。KGF-2的抗原性/亲水部分如图4A-4E所述，KGF-2蛋白中有4个主要的高度亲水性区域。即氨基酸残基Gly41-Asn71,Lys91-Ser109,Asn135-Tyr164和Asn181-Ala199[SEQ ID NO:25-28]。还有另外两个较短的推测抗原性区域，即图1(SEQ ID NO:2)的Gln74-Arg78和Gln170-Gln175。已知亲水性部分主要位于蛋白质的外部(表面)，因此，便于抗体识别这些区域。所述区域似乎也与KGF-2和其受体的结合相关。得自这些区域的合成肽可干扰KGF-2与其受体的结合，因此阻断了蛋白质的功能。得自该蛋白质亲水性部分的合成肽也可以是激动剂，即模拟KGF-2的功能。
因此，本发明进一步涉及含有KGF-2亲水性区域的分离的多肽，其中所述多肽的长度不超过150个氨基酸，优选不超过100,75或50个氨基酸，该多肽含有一个或多个上述KGF-2亲水性区域。化学修饰可进一步修饰KGF野生型和类似物以使其含有不是蛋白质正常部分的其它化学组成成分。那些衍生化的组成成分可改善该蛋白质的溶解性、生物半寿期或吸附作用。所述组成成分也可以减少或消除该蛋白质任何不必要的副作用等等。有关这些组成成分的综述例见REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版，Mack出版公司，Easton,PA(1990)。聚乙二醇(PEG)是一种已用于制备治疗用蛋白质的这类化学组成成分。PEG与蛋白质的结合已显示出可保护蛋白质使之免受蛋白酶水解，Sada等人，发酵生物工程杂志，71:137-139(1991)。可使用多种方法来结合某些PEG组成成分，例见Abuchowski等人，《用作药物的酶》(Holcerberg和Roberts编)，p367-383(1981)。很多公开的专利描述了PEG衍生物和如何制备它们的方法，例见Ono等人，美国专利5,342,940；Nitecki等人，美国专利5,089,261；Delgado等人，美国专利5,349,052。通常，PEG分子通过蛋白质上的反应性基团与该蛋白质连接。相对而言，氨基基团，如赖氨酸上的氨基基团或蛋白质的氨基末端便于这种结合。
有关“多肽和肽”这一章中提及的每篇文献，其全文列入本文作为参考。载体和宿主细胞本发明也涉及包括本发明分离的DNA分子的载体，用重组载体进行基因工程改造的宿主细胞，和通过重组技术生产KGF-2多肽或其片段的方法。
可使用本发明多肽的片段或部分通过肽合成来生产相应的全长多肽；因此，这些片段可用作生产全长多肽的中间体。可使用本发明多核苷酸的片段或部分来合成本发明全长的多核苷酸。本发明也涉及包括本发明多核苷酸的载体，用本发明的载体进行基因工程改造的宿主细胞，和通过重组技术生产本发明多肽的方法。
用本发明的载体对宿主细胞进行基因工程改造(转导或转化或转染)，所述载体可以是例如克隆载体或表达载体。载体的形式可以是例如质粒，病毒颗粒，噬菌体等等。可在适当加以改进以激活启动子，选择转化子或扩增KGF-2基因的常规营养培养基中培养经改造的宿主细胞。如温度，pH等的培养条件是选用来表达的宿主细胞以前所用的那些条件，这对于本领域技术人员而言应是显而易见的。
通过重组技术可将本发明的多核苷酸用于生产多肽，因此，例如，所述多核苷酸可包含在多种表达载体中的任一种中以表达多肽。这种载体包括染色体的、非染色体的和合成的DNA序列，如SV40的衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；杆状病毒；酵母质粒；衍生自质粒和噬菌体DNA、病毒DNA(如痘苗病毒，腺病毒，禽痘病毒和假狂犬病病毒)之联合的载体。然而，只要能在宿主中复制和存活，任何其它的载体都可使用。
可通过多种方法将适当的DNA序列插入载体。通常，通过本领域已知的方法将DNA序列插入适当的限制性内切核酸酶位点。这种方法和其它方法应是本领域技术人员所熟知的。
表达载体中的DNA序列与适当的表达控制序列(启动子)有效地相连以介导cDNA合成。至于这种启动子的代表性例子，应提及的有LTR或SV40启动子，大肠杆菌lac或trp，噬菌体λPL启动子和已知能控制原核细胞或真核细胞或它们的病毒中的基因表达的其它启动子。表达载体也含有用于起始翻译的核糖体结合位点和转录终止子。载体也包括用于增强表达的适当序列。
另外，表达载体优选含有一个或多个选择性标记基因以提供可用于选择已转化的宿主细胞的表型性状，如用于真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或大肠杆菌中的四环素和氨苄青霉素抗性。
可使用含有上文所述适当的DNA序列以及适当的启动子或控制序列的载体来转化适当的宿主以使宿主表达蛋白质。
至于适当宿主的代表性例子，应提及的有细菌细胞，如大肠杆菌，链霉菌，鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞，如果蝇S2和Spodoptera Sf9；动物细胞，如CHO，COS或Bowes黑素瘤细胞；腺病毒；植物细胞等。根据本文的教导，本领域技术人员应能掌握如何选择适当的宿主。
更具体地，本发明也包括含有一个或多个上文广泛描述的序列的重组构建体。这些构建体含有载体，如质粒或病毒载体，其中以正向或反向插入了本发明的序列。在此实施方案优选的方面，该构建体进一步包含与该序列有效相连的调控序列，如启动子。大量的适当的载体和启动子是本领域技术人员熟知的，并可商购。列出下列载体是为了举例细菌pQE70,pQE60,pQE-9(Qiagen),pBS,pDIO,phagescript,psiX174,pBluescript SK,pbsks,pNH8A,pNH16a,pNH18A,pNH46A(Stratagene)；ptrc99a,pKK223-3,pKK233-3,pDR540,pRIT5(Pharmacia)；真核细胞pWLNEO,pSV2CAT,pOG44,pXT1,pSG(Stratagene),pSVK3,pBPV,pMSG，pSVL(Pharmacia)。然而，只要能在宿主中复制和存活，任何其它的质粒或载体都可使用。
本发明进一步包括含有与编码目的蛋白质的核苷酸序列连接的操纵子和启动子元件的新表达载体。这种载体的一个实例是下文详述的pHE4-5。
如图8和9中所示，pHE4-5载体(SEQ ID NO:147)的成分包括1)作为选择标志的新霉素磷酸转移酶基因，2)大肠杆菌复制起点，3)T5噬菌体启动子序列，4)两个lac操纵基因序列，5)Shine-Delgarno序列，6)乳糖操纵子阻抑蛋白基因(lacIq)。复制起点(oriC)衍生于pUC19(LTI,Gaithersburg,MD)。启动子序列和操纵子序列是合成的。合成生产核酸序列的方法是本领域已知的(Clontech 95/96 Catalog,pp.215-216,Clontech,1020 East Meadow Circle,Palo Alto,CA 94303)。将核苷酸序列插入pHE4-5载体的NdeI和Asp718位点之间，以使编码KGF-2多肽的核苷酸序列可操作地连接上启动子和操纵子。
如上所述，pHE4-5载体含有lac Iq基因。lac Iq是lacI基因的等位基因，其提供对lac操纵子的紧密调节(Amann,E.et al.,Gene 69:301-315(1988)；Stark,M.,Gene 51:255-267(1987))。lac Iq基因编码可与lac操纵子序列结合并阻断下游(3＇)序列转录的阻抑蛋白。然而，在乳糖或某些乳糖类似物如异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)的存在下，lacIq基因产物从lac操纵子上解离。因此在含有pHE4-5载体的未诱导宿主细胞中不能以适当量产生KGF-2。但加入例如IPTG这样的试剂诱导这些宿主细胞后，可导致KGF-2编码序列的表达。
pHE4-5载体的启动子/操纵基因序列(SEQ ID NO:148)包括T5噬菌体启动子和两个lac操纵基因序列。一个操纵基因定位在转录起始位点的5＇，另一个定位在同一位点的3＇。这些操纵基因当与lacⅠq基因产物结合存在时，在没有lac操纵子诱导物如IPTG的情况下可使下游序列不能表达。加入lac操纵子诱导物如IPTG，可诱导lac操纵基因下游的可操作连接的序列表达。lac诱导物与lacⅠq蛋白的结合导致它们从lac操纵基因上释放，并起始可操作地连接之序列的转录。Devlin,T.(Textbook ofBiochemistry with Clinical Correlations,4th Edition,PP.802-807(1997))介绍了基因表达的lac操纵子调节作用。
pHE4载体系列含有除KGF-2编码序列外的pHE4-5载体的所有成分。pHE4载体的特征包括优化的合成T5噬菌体启动子、lac操纵基因和Shine-Delagarno序列。此外，这些序列都占有最适空间位置，从而使被插入基因的表达得以紧密调节，并在诱导后发生高水平表达。
在已知的细菌启动子中，适用于生产本发明蛋白质的启动子包括大肠杆菌lacⅠ和lacZ启动子、T3和T7启动子、gpt启动子、λPR和PL启动子及trD启动子。适用的真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒LTR的启动子，例如Rous肉瘤病毒(RSV)的启动子，和金属硫蛋白启动子如小鼠金属硫蛋白Ⅰ启动子。
pHE4-5启动子还含有位于AUG起始密码子5＇的Shine-Delgarno序列。Shine-Delgarno序列是一般位于AUG起始密码子上游(5＇)约10个核苷酸处的短序列。这些序列主要是指导原核细胞核糖体到AUG起始密码子处。
因此，本发明还涉及可用于生产本发明的蛋白质的表达载体。本发明的这个方面是以pHE4-5载体(SEQ ID NO:147)为例说明的。
插入到pHE4-5表达载体中的编码KGF-2Δ33的cDNA于1998年1月9日保藏在ATCC，登记号为ATCC No.209575。
可使用具有选择性标记的CAT(氯霉素转移酶)载体或其它载体从任何合乎需要的基因中选择启动子区域。两个适当的载体是pKK232-8和pCM7。特别命名的细菌启动子包括lacI启动子，lacZ启动子，T3启动子，T7启动子，gpt启动子，λPR、PL启动子和trp启动子。真核启动子包括CMV即早期启动子，HSV胸苷激酶启动子，早期和晚期SV40启动子，逆转录病毒的LTR启动子和小鼠金属硫蛋白-I启动子。适当载体和启动子的选择是本领域技术人员熟知的。
在另一个实施方案中，本发明涉及含有上述构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是高等真核细胞如哺乳动物细胞，或低等真核细胞如酵母细胞；或者宿主细胞也可以是原核细胞如细菌细胞。可通过磷酸钙转染，DEAE-葡聚糖介导的转染，或电穿孔(Davis,L等人，分子生物学基础方法(1986))将构建体导入宿主细胞中。
可以常规方式使用宿主细胞中的构建体以产生由重组序列编码的基因产物。或者，也可通过常规的肽合成仪合成生产本发明的多肽。
在适当启动子的控制下，成熟的蛋白质可在哺乳动物细胞、酵母、细菌或其它细胞中表达。使用衍生自本发明DNA构建体的RNA，也可利用无细胞的翻译系统来产生这种蛋白质。可在原核和真核宿主中使用的适当的克隆和表达载体描述于Sambrook等人，分子克隆实验室手册，第2版，冷泉港，纽约(1989)，该文献已列入本文作为参考。
通过在载体中插入增强子序列可增加高等真核细胞对编码本发明多肽的DNA的转录。增强子是对启动子起作用以增加其转录的顺式作用的DNA元件，通常约为10至300bp。例子包括复制起点晚期侧的第100-270bp的SV40增强子，巨细胞病毒早期启动子增强子，复制起点晚期侧的多瘤病毒增强子和腺病毒增强子。
为了将翻译的蛋白质分泌到内质网腔、外周质空间或胞外环境中，可将适当的分泌信号掺入被表达的多肽中。所述信号对于该多肽而言可以是内源的，也可以是外源的。
多肽可以经修饰的形式，如融合蛋白的形式被表达，多肽不仅可包括分泌信号，也可包括其它的异源功能区域。例如，可在多肽的N-末端加上另外的氨基酸区域，尤其是带电的氨基酸以改善多肽在宿主细胞中、纯化过程中或随后的处理和储存过程中的稳定性和持久性。也可以在多肽中加入肽组成成分以便于纯化，最终制备多肽之前可除去这类区域。本领域技术人员熟知在多肽中加入肽组成成分以引发分泌或外泌，改善稳定性和便于纯化等等，这是本领域内的常规技术。优选的融合蛋白含有得自免疫球蛋白的异源区域，该区域可用于使受体溶解。例如，EP-A-0464533(加拿大同族2045869)中公开了含有免疫球蛋白分子恒定区各个部分和另一种人蛋白质或其部分的融合蛋白。在很多情况下，融合蛋白中的Fc部分对于治疗和诊断用途十分有利，因此，导致例如药物动力学特性有所改善(EP-A0232262)。另一方面，对于一些应用而言，需要在融合蛋白以所述有利的方式被表达、检测和纯化之后缺失掉Fc部分。如当Fc部分成为治疗和诊断用途的障碍时，如当融合蛋白被用作免疫接种用的免疫原时即是如此。例如在筛选药物时，将如shIL-5之类的人蛋白质与Fc部分融合以进行高生产率筛选试验来鉴定hIL-5的拮抗剂，例见D.Bennett等人，分子识别杂志，第8卷，52-58(1995)和K.Johanson等人，生物化学杂志，Vol.270,No.16,p9459-9471(1995)。
通常，重组的表达载体包括复制起点和允许转化宿主细胞的抗性标记，如大肠杆菌的氨苄青霉素抗性基因和酿酒酵母的TRP1基因，和得自高表达基因的启动子以介导下游结构序列的转录。这种启动子可得自编码如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)之类的糖酵解酶，α-因子，酸性磷酸酶或热休克蛋白等的操纵子。异源结构序列与翻译起始和终止序列，优选与能介导被翻译的蛋白质分泌至外周间隙或胞外基质中的前导序列以适当的方式装配在一起。任选异源序列可编码包括赋予所需特征的N-末端鉴定肽的融合蛋白，所述特征如所表达重组蛋白的稳定化或纯化过程的简化。
通过将与功能性的启动子处于有效的阅读相中的编码所需蛋白质的结构DNA序列以及适当的翻译起始和终止信号一起插入可构建用于细菌的有用的表达载体。载体可含有一个或多个表型选择性标记和一个复制起点以确保载体的维持并在必要时提供宿主内的扩增。尽管也可利用其它的选择，但用于转化的合适的原核宿主包括大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，鼠伤寒沙门氏菌，以及假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属的多个种。
作为代表性的而非局限性的例子，用于细菌的有用的表达载体可含有选择性标记和得自含有已知克隆载体pBR322(ATCC37017)之遗传元件的商购质粒的细菌复制起点。这种可商购载体包括例如pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals,Uppsala,Sweden)和GEM1(Promega Biotec,Madison,WI,USA)。这些pBR322“骨架”部分与适当的启动子和欲表达的结构序列联合在一起。
转化合适的宿主菌株并将宿主菌株培养至适当的细胞密度之后，通过适当的方式(如温度变化或化学诱导)诱导选定的启动子，并将细胞再培养一段时间。
一般通过离心收获细胞，通过物理或化学方法破碎细胞，保留所得的粗提取物以进一步纯化。
通过包括冷冻-融化循环，超声处理，机械破碎，或使用细胞裂解剂等在内的任何便利方法可破碎用于表达蛋白质的微生物细胞，这些方法是本领域技术人员所熟知的。
可使用多种哺乳动物细胞培养系统来表达重组蛋白，哺乳动物表达系统的例子包括Gluzman，细胞，23:175(1981)所述的猴肾成纤维细胞COS-7系，以及能表达可容性载体的其它细胞系，如C127,3T3,CHO,HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体可含有复制起点，合适的启动子和增强子，和任何必需的核糖体结合位点，聚腺苷酸化位点，剪接供体和受体位点，转录终止序列，和5’侧翼的非转录序列。可使用得自SV40剪接和聚腺苷酸化位点的DNA序列提供所需的非转录的遗传元件。
通过包括硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阳离子或阴离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水作用层析，亲和层析，羟基磷灰石层析和凝集素层析等的方法，可以从重组细胞培养物中回收和纯化KGF-2多肽。必要时，可进行蛋白质的重折叠步骤来完成成熟蛋白质的构型。最后，可使用高效液相层析(HPLC)完成最终的纯化步骤。
本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或化学合成方法的产物，或由原核或真核宿主(如培养中的细菌，酵母，高等植物，昆虫和哺乳动物细胞)通过重组技术产生。取决于重组生产方法中所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，也可以是非糖基化的。本发明的多肽也可以包括起始甲硫氨酸残基。KGF-2的治疗应用在下文中，“KGF-2”是指本文所述的全长度和成熟形式的KGF-2，以及本文所述的KGF-2类似物、衍生物和突变体。
提高血小板水平一个方面，本发明涉及为缓解血小板减少之目的而增加血液中的血小板水平或数目。确定血小板减少的真实原因是很困难的，并且是一个有挑战性的临床问题。血小板减少可因多种原因引起；但只有当血小板在体内被破坏、被掩敝，或不能产生时才最后发生。血小板减少的鉴别诊断是很广泛而且复杂的，并且有各种疾病的明显交迭(Doyle B.andPorter D.L.,A.A.C.N.Clin.Issues 8(3):469-480,1997)。血小板减少可因各种机制引起，这些发病机制包括但不只限于药物诱导的超敏反应、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、输血后紫癜、新生儿血小板减少、与骨内转移瘤有关的骨髓缺乏、再生障碍性贫血、骨髓纤维变性、急性和单核细胞白血病、包括弥散性血管内凝血(DIC)的微血管病溶血性贫血、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、溶血性尿毒综合症、人工瓣膜性溶血综合症、肿瘤化疗、Zieve氏综合症、脓毒症、HELLP子痫前期综合症、由于B21和叶酸缺乏引起的巨成红细胞贫血、腹膜炎之类感染(没有败血症)、先天性风疹综合症、HIV-1病毒感染、EB病毒感染性单核细胞增多症、系统性狼疮等类风湿性胶原病、子痫前期相关性妊娠高血压、甲状腺毒症和尿毒症(Clinical guide to Laboratory tests(3rd ed.).Philadelphia,W.B.Saunders Company,1995；Clinical LaboratoryMedicine.Clinical application of laboratory data.(6th ed.)St.Louis,Mosby,1995)。
因此，本发明提供一种给病人投用KGF-2多肽以缓解血小板减少的方法。下文将描述适用的剂量、配方及给药途径。
提高纤维蛋白原、白蛋白和血浆蛋白质的水平纤维蛋白原是一种肝脏中合成的糖蛋白。纤维蛋白原可按下述方式产生血纤蛋白断裂产物(FDP)。正常情况下，凝血酶从纤维蛋白原中心部分裂解出称为血纤肽A和B的两个血纤肽分子，催化纤维蛋白原转化成血纤蛋白。此作用暴露出纤维蛋白原分子其余部分的聚合位点，称血维蛋白单体。血纤蛋白单体以端-端和侧-侧方式自动聚集，形成血纤蛋白凝胶。凝血酶还激活因子ⅩⅢ，以在血纤蛋白单体之间引入交联异肽键，形成稳定化的不溶性血纤蛋白多聚体。血纤蛋白多聚体形成血凝块的支架。纤维蛋白溶酶是天然存在或后天获得的酶，其可攻击血纤维蛋白原或血纤蛋白或两者，切断FDP，从而断裂成较小的碎片。这些裂解产物可与血纤蛋白单体形成复合物并干扰聚合作用。可通过初生纤维蛋白溶酶对纤维蛋白原的作用，或通过纤溶酶对纤维蛋白原或血纤蛋白单体或正常和异常条件下形成的血纤蛋白凝块的作用，产生纤维蛋白原降解产物。纤溶酶攻击正常止血过程(如创伤或外科手术)中或引起疾病的过程(如血栓或栓塞形成)中形成的血凝块。
因急性肝炎或肝硬化时肝中纤维蛋白原产生量减少，纤维蛋白溶酶破坏血纤蛋白并可破坏纤维蛋白原或由于纤维蛋白原向血纤蛋白的转化而不足以置换纤维蛋白原，均可导致血浆纤维蛋白原水平降低。在异常肝脏合成如急性肝炎或肝硬化相关的病理状况下，可见血浆纤维蛋白原水平降低。除严重肝病外，低纤维蛋白原血症的主要病因是由于弥漫性血管内凝血(DIC)引起的纤维蛋白原耗竭(Clinical guide to laboratorytests(3rd.ed.),Philadelphia,W.B.Saunders Company,1995；ClinicalLaboratory Medicine,Clinical application oflaboratory data(6th ed.),St.Louis,Mosby,1995)。
因此，本发明的再一个方面提供了利用KGF-2多肽提高或增加血浆中纤维蛋白原水平或总数的方法。最好是为缓解血纤维蛋白原过少而给个体投用KGF-2多肽。下文描述适用剂量、配方及给药途径。
白蛋白是由肝脏产生的在维持血清膨胀压中最具活性的血清蛋白质。血清白蛋白还作为某些药物和少数其他物质的运输蛋白质。血内白蛋白减少的各种病因可包括但不只限于出血、烧伤、渗出、风湿性疾病、肉芽肿、大多数细菌感染、合并有组织破坏的病毒感染、组织坏死、血管炎、溃疡性肠道疾病、浆膜炎、亚急性细菌性心内膜炎、寄生虫侵染、急性和慢性肝病、淀粉样变、营养不良、癌、充血性心力衰竭、狭窄性心包炎、心脏瓣膜病、肾病综合症、创伤和粉碎性损伤、胃肠和淋巴瘘，以及蛋白质丢失性胃肠病(Clinical guide to Laboratory tests.(3rd ed.).Philadelphia,W.B.Saunders Company,1995；Clinical LaboratoryMedicine,Clinical application of laboratory data.(6th ed.)St.Louis,Mosby,1995)。
因此，本发明的再一个方面是提供一种利用KGF-2多肽提高或增加血清白蛋白水平或总数的方法。最好为缓解血内白蛋白过少的目的而给个体投用KGF-2多肽。适宜的用药剂量、配方及给药途径将在下文中述及。
血清球蛋白是指异源组群的蛋白质，如糖蛋白、脂蛋白和免疫球蛋白。球蛋白形成各种物质的主要运输系统，并构成抗体系统、凝血蛋白、补体和某些特殊的功用物质，如“急性反应”蛋白。造成血内球蛋白过少的各种病理状况包括但不只限于α-1抗胰蛋白酶缺乏、严重肝病、雌激素治疗、巨成红细胞性贫血、血内丙球蛋白过少及丙球蛋白缺乏血症等(Clinical guide to laboratory tests.(3rd ed.).Philadelphia,W.B.Saunders Company,1995；Clinical Laboratory Medicine,Clinicalapplication of laboratory data.(6th ed.)St.Louis,Mosby,1995)。
因此，本发明还提供了利用KGF-2多肽以提高或增加血清球蛋白水平或总数的方法。最好为缓解血内球蛋白过低的目的而给病人投用KGF-2多肽。适宜的用药剂量、配方及给药途径将在下文中述及。
KGF-2也可用于增加蛋白质丢失和/或蛋白质合成减少之病人的总血清蛋白质水平。人血清中含有许多蛋白质，包括白蛋白、球蛋白、凝血酶原、纤维蛋白原，以及完全由肝细胞合成的其他蛋白质。广泛肝损伤可导致这些蛋白质水平降低(Clinical guide to laboratory tests.(3rd ed.).Philadelphia,W.B.Saunders Company,1995；Clinical LaboratoryMedicine,Clinical application of laboratory data.(6th ed.)St.Louis,Mosby,1995)。血清白蛋白水平受各种非肝脏因素，特别是营养状况、激素因子及血浆膨胀压的影响。肾病综合症或蛋白质丢失性肠道病可导致血清白蛋白水平降低。低血清白蛋白水平也可因家族性特发性血内蛋白异常、罕见的遗传状况(其中白蛋白水平大大降低，而球蛋白则增加)等引起(Clinical guide to laboratory tests.(3rd ed.).Philadelphia,W.B.Saunders Company,1995；Clinical Laboratory Medicine,Clinicalapplication oflaboratory data.(6th ed.)St.Louis,Mosby,1995)。血清球蛋白包括α和β球蛋白及血清免疫球蛋白。α-1球蛋白包括α-1抗胰蛋白酶、α-1酸性糖蛋白、α-1胎球蛋白和皮质醇结合蛋白(运皮质素蛋白)和甲状腺素结合球蛋白等某些载体蛋白。在α-1抗胰蛋白酶缺乏症中α-1球蛋白缺乏或几近没有(Clinical guide to laboratory tests.(3rded.).Philadelphia,W.B.Saunders Company,1995；Clinical LaboratoryMedicine,Clinical application of laboratory data.(6th ed.)St.Louis,Mosby,1995)。α-2球蛋白包括亲血球蛋白(haptoglobulin)、α-2巨球蛋白和血浆铜兰蛋白。严重肝病、雌激素治疗、巨成红细胞贫血和血液中出现游离血红蛋白的状况(RBC溶血)的病人中亲血球蛋白减少(Clinical guide to laboratory tests.(3rd ed.).Philadelphia,W.B.SaundersCompany,1995；Clinical Laboratory Medicine,Clinical application oflaboratory data.(6th ed.)St.Louis,Mosby,1995)。Wilson氏病、营养不良、肾病综合症、蛋白质丢失性肠道病时血浆铜兰蛋白水平降低。β球蛋白包括转铁蛋白、β-脂蛋白和几种补体成分。在蛋白质营养不良时常常出现转铁蛋白降低。γ球蛋白包括免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。血丙球蛋白过少或丙球蛋白缺乏血症中丙球蛋白降低(Clinicalguide to laboratory tests.(3rd ed.).Philadelphia,W.B.SaundersCompany,1995；Clinical Laboratory Medicine,Clinical application oflaboratory data.(6th ed.)St.Louis,Mosby,1995)。最后，血清还含有许多已用于区别和估测肝细胞损伤、胆道功能异常或阻塞的酶。例如，天冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)分别催化天冬氨酸和丙氨酸的γ氨基基团转移到酮戊二酸的γ-酮基上，导致草酰乙酸和丙酮酸的形成。尿毒症可导致氨基转移酶水平伪性降低(Harrison＇sPrinciples of Internal Medicine 11th edition,Eugene Braunwald et al.,Editors(1987))。
因此，总蛋白质丢失可因蛋白质丢失性肾肠病变、急性烧伤及肾病综合症等各种原因引起。引起蛋白质合成降低的各种机制包括但不只限于慢性肝病、吸收不良综合症、营养不良和丙球蛋白缺乏血症等。因此，本发明再一个方面是提供一种利用KGF-2多肽提高或增加总血清蛋白质水平或总数的方法。最好为减轻与蛋白质丢失有关之疾病或状况的目的，给个体投用KGF-2多肽。下文将描述适用剂量、配方和给药途径。
治疗膀胱炎出血性膀胱炎是与某些疾病状态以及接触毒品、病毒和毒素有关的综合症。其表现为膀胱内皮衬的弥散性出血。已知治疗包括使用血管内、全身用药及非药物疗法(West,N.J.,Pharmacotherapy 17:696-706(1997))。临床上使用的某些细胞毒性剂具有副作用，包括导致膀胱正常上皮增殖的抑制、潜在的上皮层致命性溃疡和破坏。例如，环磷酰胺是一种主要在肝脏中发生生物转化，受混合的功能性微粒体氧化酶系统的作用产生活性烷基化代谢产物的细胞毒性剂。这些代谢产物干扰敏感的快速增殖恶性细胞的生长。据信作用机制涉及与肿瘤细胞DNA的交联(Physcian＇s Desk reference,1997)。
环磷酰胺作为一种细胞毒性剂，其引起某些病人的出血性膀胱炎-一种严重的并且有时是致命性的并发症。有或没有膀胱炎时也可发生膀胱的纤维变性。这种损伤被认为是由于尿中排出的环磷酰胺代谢产物引起的。环磷酰胺引起的血尿一般可持续几天，也可能长期存在。有些严重病例需要进行药物或外科手术治疗。严重的出血性膀胱炎需中断环磷酰胺治疗。另外，在环磷酰胺治疗的两年内和以前已有过出血性膀胱炎的病人可发生膀胱癌(CYTOXAN(环磷酰胺)包装内插页)。环磷酰胺对前列腺和雄性生殖系统有毒性作用。环磷酰胺治疗可导致不孕的发展，并导致一定程度的睾丸萎缩。
如图23和24中所示，给病人全身使用KGF-2可刺激膀胱和前列腺上皮细胞增殖。因此，本发明一个方面是提供一种给病人投用有效量的KGF-2多肽，以刺激膀胱和前列腺上皮细胞增殖的方法。更重要的是，如图25和26所示，可使用KGF-2降低由具有副作用的细胞毒性剂引起的，导致膀胱和前列腺上皮细胞增殖抑制的损伤。为了减少这样的损伤，可在用细胞毒性剂治疗之前、之后或治疗期间投用KGF-2。因此，本发明的再一个方面是提供一种给个体投用有效量的KGF-2，以减少由于抑制膀胱或前列腺上皮细胞的正常增殖所导致的损伤的方法。正如已指出的，膀胱或前列腺上皮正常增殖的抑制剂包括放射治疗(引起急性或慢性放射损伤)，和环磷酰胺、白消安及ifosfamide等包括化疗或抗肿瘤药物在内的细胞毒性剂。在另一个方面，本发明涉及投用KGF-2以减少或阻止膀胱纤维变性和溃疡的方法。最好投用KGF-2以防止或缓解出血性膀胱炎。下文将描述适用剂量、配方及给药途径。
刺激鼻粘膜增殖鼻窦感染通常发生在上呼吸道感染加重、变态反应或解剖缺陷(鼻窦或鼻中隔内)等情况下，并且可导致头痛、面部疼痛、发烧及化脓性鼻溢等症状(Evans KL.,Drugs 56(1):59-71(1998))。鼻过敏反应的症状与慢性筛窦炎有迭加，并且变应性病人治疗失败可能提示存在有慢性鼻窦炎。慢性筛窦炎可能是患有长期过敏反应的病人鼻溢和鼻阻塞的主要原因(Bertrand et al.,Acta Otorhinolaryngol Bel.51(4):227-237(1997))。当出现鼻塞、鼻出血、后鼻滴注、间断性面部疼痛(Evans KL.Drugs 56(1):59-71(1998))和嗅觉障碍(Jones et al.,Int.J.Pediater.Otorhinolaryngol.28(1):25-32(1993)等症状持续3个月以上时即判定为慢性鼻窦炎。除粘膜纤毛运输能力差和窦口阻塞外，慢性鼻窦炎还与粘膜水肿、粘液分泌过多及持续性或复发性感染有关。
急性窦炎多发生于有鼻炎史的病人，其来源上可以是变应性或非变应性的。患有解剖变异(Evans KL.Drugs 56(1):59-71(1998))和囊性纤维样变性(Brihaye et al.，Acta Otorhinolaryngol Belg 51(4):323-337(1997)；Ramsey et al.,J.Allergy Clin.Immiunol.90(3Pt2):547-552(1992)；Davidson et al.,Laryngoscope 105(4Pt1):354-358(1995)；Jones et al.,Int.J.Pediatr.Otorhinolaryngol.28(1):25-32(1993))的病人也有发展成鼻窦炎的高度危险。急性炎症和感染与分泌物经粘膜的细胞运输能力降低及窦口阻塞有关。急性鼻窦炎的最初药物治疗是使用止痛剂控制疼痛、局部和全身治疗鼻炎，包括使用抗组织胺剂、肥大细胞稳定剂和类固醇；清除分泌物，包括气流吸入和鼻内盐水冲洗；有感染时则使用抗生素(Evans KL.,Drugs 56(1):59-71,1998)。
现已对鼻窦炎的病理生理有了一般性了解。特别是已知窦口阻塞启动可导致持续性鼻窦炎的一系列循环事件(Reilly,J.S.,OtolaryngologyHead and Neck Surgery 103(5):856-862(1990))。治疗急性和慢性鼻窦炎的目的是控制鼻炎，改善窦的通气，并改善鼻窦清除分泌物的功能(EvansKL.,Drugs 56(1):59-71(1998))。只有出现药物治疗不能控制长期慢性鼻窦炎的征兆时才进行鼻窦外科手术。
一般认为只有当药物手段不能控制鼻窦炎时才对鼻窦进行外科治疗。治疗的目的是同样的改善通气以有利于或恢复鼻窦导流。另一个目的是外科治疗有时可改善局部用药向窦内穿透。在美国，每年要进行多达250,000个手术。手术治疗方法主要是在CT或X射线层析摄机仪帮助确定特定损伤部位的情况下使用内窥镜方法完成(Stammberger,H.,Otolaryngology Head and Neck Surgery 94(2):143-147(1986)；Stammberger,H.,Otolaryngology Head and Neck Surgery 94(2):147-156(1986))。手术范围要尽可能小，而且只去除使慢性鼻窦炎持续存在的源发解剖部位。
在进行鼻窦手术治疗过程中，会撕脱或损伤粘膜表面。在进行广泛外科治疗的情况下，鼻窦内下层骨组织可暴露达6个月，然后才能重新长满粘膜，而纤毛密度恢复则要长达2年之久。尽管尚未证实，据信手术后鼻窦的延迟上皮重新发生与增加感染的危险、导致疾病复发的瘢痕形成(上皮下的纤维变性)、以及囊肿生成有关。随访两年后，约有2-5％的病人有复发，并且有多达15％的病人要进行再次手术(Evans KL.,Drugs56(1):59-71(1998))。可能受到加速的重新上皮化影响的其他合并症包括感染合并症(Evans KL.,Drugs 56(1):59-71(1989))、不能恢复嗅觉(Klossek et al.,Otolaryngology Head and Neck Surgery 117(4):355-361(1997))、息肉复发(Klossek et al.，文献同上)及需要进行另外的手术后药物治疗(Smith et al.,OtolaryngologyHead and neck Surgery 108(6):688-696(1993))。已报导多达8％的病例发生较小的并发症，约40％的病人需要继续对鼻塞和手术后不适进行药物治疗(Smith et al.，文献出处同上)。
内窥镜鼻手术后，病人每周进行重复内窥镜检查和清创术。每次都要作局部麻醉并清洁窦腔，包括去除粘着物(发生于10-15％的病例)和粘液痂。术后护理的时间与手术范围及窦上皮损失量以正比。例如有的病例可能需要进行6至8周护理。对于复杂的或更广泛的病例，可能需要12至18周。加速窦上皮愈合可减小手术后不适时间并减少护理费用。
给病人投用KGF-2可刺激窦上皮和鼻粘膜增殖。投用KGF-2也可使鼻空气通道的呼吸道上皮中的杯形细胞增生。因此，在一个方面，本发明提供一种投用KGF-2以刺激手术或其他病理状况所致损伤的窦粘膜愈合的方法。此外，本发明还涉及投用KGF-2以刺激鼻和窦粘膜内伤口愈合的方法。本发明还提供一种给病人投用KGF-2，以提高和/或保持纤毛密度和粘膜完整性，从而改善鼻窦功能的方法。本发明的另一个方面是提供一种投用KGF-2以减少鼻窦感染、瘢痕、息肉、囊肿形成和复发以及改善嗅觉的方法。下文将描述适用剂量、配方和给药途径。
增加唾液腺和泪腺的增殖唾液是从三大唾液腺分泌的腮腺、舌下腺和下颌下唾液腺。泪是从泪腺分泌的。丧失产生足够量唾液和泪的能力是影响到数百万人的一大临床问题，而且目前对这些患者也没有多少治疗办法。口腔干燥的病人不能产生适当量的唾液、吞咽困难、口腔干裂疼痛，而且味觉降低。这种病理状况可因Sjogren氏综合症引起，为头颈部肿痛病人放疗和药物治疗的继发症状。Sjogren氏综合症病人有时有干燥性角结膜炎或眼睛干燥。这种状况可以是因Sjogren氏综合症、结节病、衰老、HIV感染、烧伤等所致的泪腺损伤引起的(Lemp,M.A.,Adv.Exp.Med.Biol.438:791-803(1998))。病人表现有急燥、视觉模糊、烧灼感、疼痛及增加的感染危险。有数百万病人患有Sjogren氏综合症，而且治疗上没有太好的方法。重点放在减少龋齿危险和使用润湿剂上。如剩余有唾液腺组织，可用毛果芸香碱治疗病人，以诱导唾液产生(Guchelaar,H.J.and Meerwaldt,V.A.,Support Care Cancer 5:281-288(1997)；Garg,A.C.and Malo,M.,J.Am.Dent.Assoc,128:1128-1133(1997)；Wiseman,L.R.and Faulds,D.,Drugs 49:143-155(1995)；Leveque,F.G.,et al.,J.Clin.Oncol. 11:1124-1131(1993))。目前的研究显示，用IFN-α治疗可减少Sjogren氏综合症病人唾液腺中的淋巴细胞浸润并改善功能(Shiozawa,S.et al.,J.Interferon Cytokine Res.18:255-262(1998))。但某些疗法(如果被批准的话)，只能影响那些因这种自身免疫病所致唾液腺功能不全的病人。
与口腔干燥的病例一样，对干燥性角结膜炎患者也没有好的治疗办法。当前，美国约有一千万病人需要使用人工泪制剂(Lemp,M.A.,Adv.Exp.Med.Biol.438:791-803(1998))。现时也没有取代唾液和泪腺细胞的治疗方法。
对“干眼”病人常使用两种分类(Pflugfelder,S.C.,Adv.Dent.Res.10(1):9-12(1996))。一类是有足够泪水的干眼。这种临床疾病与泪膜表面脂质层缺陷所致的睑板腺功能障碍有关。眼睑的透射活组织镜检可看到睑板腺下落。第二类是泪水不足性干眼。这种临床病症可能是免疫性的(Sjogren氏综合症)和非免疫性的(非Sjoren氏综合症)。泪水不足导致称为干燥性角结膜炎的眼球表面病，其因泪腺或粘液生成上皮细胞中病理改变所致。已有人报导干眼综合症病人的结膜上皮中杯状细胞密度降低(Ralph,R.A.,Investigative Ophthalmology 14(4):299-302(1975))。
虽然干眼综合症与特殊生长因子缺乏无关，但泪腺可产生表皮生长因子，后者可在眼表面伤口愈合中起作用(Wilson,S.E.,American J.ofOphthalmology 111(6):763-765(1991))。泪分泌物中内源性生长因子的存在为局部使用角质细胞生长因子以支持结膜上皮生长和分化提供了合理根据。此外，泪腺中分泌腺泡萎缩或丧失也是泪产生缺陷的原因之一。
实施例24中研究了KGF-2对正常大鼠唾液和泪腺细胞之增殖速率的影响。哺乳动物存在三大唾液腺腮腺、舌下腺和下颌下唾液腺。一次静脉内注射KGF-2诱导腮腺浆液细胞增殖增加约40倍，下颌下腺浆液和粘液细胞增殖增加18倍，泪腺浆液细胞增殖增加10倍。KGF-2诱导唾液腺和泪腺细胞增殖增加是可逆的。
KGF-2使正常大鼠唾液腺和泪腺中正常浆液和粘液分泌细胞增殖显著增加，但似乎并不引起导管细胞的增殖反应(见实施例24)。在去除治疗后，对唾液腺和泪腺的这种作用逆转，提示KGF-2在促进这些腺体细胞的再生中是安全有效的。
除刺激唾液腺增殖外，每天静脉注射KGF-2Δ33导致猕猴口和食道粘膜发生肉眼可见的增厚(见实施例36)。口和食道粘膜的这种肉眼可见的增厚与口和食道粘膜过度角质化有关。
因为已显示了KGF-2Δ33对分泌组织如唾液腺和胰腺的增殖作用，所以实施例25中还研究了全身投用KGF-2Δ33对泪腺的作用。结果证明每天静脉内注射KGF-2Δ33,1,2和3天后泪腺增殖。但在许多器官和组织中已观察一种状况，即每天投用这种生长因子共7天后，未能证明腺体加速了增殖(见实施例25)。这些结果表明，预计局部或全身投用KGF-2Δ33，可因其对泪腺上皮细胞的增殖作用，刺激腺体分泌能力的治疗性提高。
因此，本发明提供一种给有此需要的病人投用KGF-2以刺激腮腺、舌下腺和下颌下腺(或颌下腺)唾液腺细胞生长的方法。本发明还提供一种给有此需要的病人投用KGF-2以刺激泪腺细胞生长的方法。具体地说，可投用KGF-2以治疗或预防因放射治疗、自身免疫病、结节病、衰老、HIV感染、烧伤等原因引起的干燥性角结膜炎、口腔干燥或其他病理状况，及对泪腺、唾液腺或粘膜的损伤。下文将描述适当的给药剂量、配方及给药途径。
刺激杯形细胞增殖如上所示，给个体投用KGF-2也刺激鼻气道中呼吸道上皮杯形细胞的增殖(实施例37)。如在实施例29中证明的，投用KGF-2也导致结膜中杯形细胞的增殖。本发明人已进一步证明，投用KGF-2可刺激大肠和小肠中杯形细胞的增殖。因此，本发明进一步提供一种给有此需要的病人投用KGF-2以刺激杯形细胞增殖的方法。刺激杯形细胞增殖的目的包括治疗或预防干眼及辐射诱发的损伤(如在肿瘤治疗期间)。下文将描述有关适用剂量、配方及给药途径。
肺上皮细胞增殖KGF-2刺激肺上皮细胞的增殖。因此，可预防性投用KGF-2以减少或阻止各种病理学状态引起的肺损伤。也可在损伤过程发生期间或之后投用KGF-2以促进损伤愈合。例如，KGF-2可刺激肺泡和细支气管上皮的增殖和分化，并促进其损伤的修复，以防止、减轻或治疗急或慢性肺损伤。导致进行性肺泡损失的肺气肿和例如因烟雾吸入和烧伤引起的吸入损伤，可引起细支气管上皮和肺泡的坏死，这些病症如化学治疗、放射治疗、肺癌、哮喘、阻塞和其他肺损伤状况所致的肺损伤一样，可用KGF-2得到有效的治疗。另外，KGF-2可用于刺激Ⅱ型肺细胞的增殖和分化，其可帮助治疗或预防如透明膜病，例如早产儿中的婴儿呼吸窘迫综合症及支气管肺发育异常等疾病。
KGF-2经直接气管内给药后，可刺激肺上皮细胞的增殖。此外，投用雾化的KGF-2与静脉内给药一样也可刺激细胞增殖。再者，如在实施例32中证明的，KGF-2可用于预防肺纤维样变性。
文中使用的术语“个体”是指动物，特别是哺乳动物(如猿、牛、马、猪、野猪(boar)、绵羊、啮齿动物、山羊、狗、猫、鸡、猴、兔、雪貂、鲸和海豚)，且最好是人。药物组合物可将本发明的多肽，激动剂和拮抗剂与适当的药用载体联合使用以制成药物组合物。这种组合物含有治疗有效量的多肽，激动剂或拮抗剂和药学可接受的载体或赋形剂。所述载体包括但不限于盐水，缓冲盐溶液，葡萄糖，水，甘油，乙醇及其联合。制剂应适合施用的模式。
本发明也提供了含有一个或多个被本发明药物组合物的一种或多种成分充满的容器的药物包装或试剂盒。随容器所附的是管理药品或生物制品的制备，应用或销售的政府机构建议形式的注意事项，该注意事项反映有关人用药的制备，应用或销售得到了该机构的许可。另外，也可将本发明的多肽，激动剂和拮抗剂与其它治疗性的化合物一起使用。
具有KGF-2活性的多肽可在药物组合物中与一种或多种药学可接受的赋形剂联合施用。应理解当施用于人患者时，护理医生在正确的医学判断范围内可决定本发明药物组合物每天的总用量。任何具体患者的特定治疗有效剂量水平取决于多种因素，包括欲达到的反应的类型和程度，所用其它药剂的特殊组合(如果有的话)；患者的年龄，体重，健康状况，性别和饮食；施用的时间，施用的途径和组合物外泌的速率；治疗的期限；与特定组合物联合或同时使用的药物(如化学治疗剂)；和医学领域众所周知的其它因素。本领域已知的适当制剂见于Remington’s Pharmaceutical Sciences(最新版)，Mack出版公司，Easton,PA。
考虑到各个患者的临床条件(尤其是仅用KGF-2治疗时的副作用)，KGF-2组合物释放的位点，施用的方法，施用的计划和实际操作人员已知的其它因素，以与良好的医学实践一致的方式配制和服用治疗所用的KGF-2组合物。因此，通过上述考虑可确定用于本文目的的“有效量”的KGF-2(包括KGF-2有效量)。
可以按方便的方式，例如以口服、局部、静膜内、腹膜内、肌肉内、动脉内、皮下、鼻内、气管内、眼内、吸入或皮内等途径给药。以治疗和成预防特殊指征有效的量投用药物组合物。在大多数情况下，KGF-2的剂量为每天大约1μg/kg至30mg/kg体重，并考虑到给药途径、病情等。但剂量可低至0.001μg/kg。例如在特殊局部给药的病例中，给药量约为0.01μg-9mg/cm2。在鼻内和眼内给药的病例中，给药剂量约为0.001μg/ml至10mg/ml，最好是约0.05mg/ml至4mg/ml。
作为一个总体建议，胃肠道外投用之KGF-2的总药学有效剂量一般约为1μg/kg/天至100mg/kg/天，但实践中还要自行决定。如连续给药，KGF-2的给药速率约为1μg～50μg/kg/小时，每天注射1-4次或使用小型泵连续皮下输注。也可利用静脉内袋装溶液或瓶装溶液。
当用于治疗膀胱炎、血内白蛋白过少、血内纤维蛋白原过少、血内丙球蛋白过少、出血性膀胱炎、刺激唾液腺上皮、肺损伤、刺激鼻窦和鼻粘膜时，KGF-2的静脉内给药剂量范围约为0.5mg-30mg/kg。为治疗肺疾病和状况及刺激鼻和窦上皮，最好以大约6mg-20mg的剂量范围将KGF-2雾化并吸入给药。
如果连续给药超过某最少天数(小鼠为7天)，则这样的KGF-2疗程用于影响纤维蛋白水解系统可能是适宜的。观察变化需要的疗程以及治疗后再发生治疗反应的间隔取决于所需的效果。下列实施例中指出了疗程。KGF-2多肽也适合于以缓释系统给药。缓释组合物的适当例子包括呈成型物体如薄膜或微胶囊形式的半透性多聚物基质。缓释基质包括聚交酯(US专利3,773,919,EP-058481)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(U.Sidman et al.,Biopolymers 22:547-556(1983))、聚(2-羟乙基异丙烯酸酯)(R.Langer et al.,J.Biomed,Mater.Res.15:167-277(1991)；R.Langer,Chem.Tech.12:98-105(1992))、乙烯乙酸乙烯酯(R.Langer et al.)或聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133988)。缓释的KGF-2组合物还包括脂质体包裹的KGF-2。可用已知方法制备含有KGF-2的脂质体(参见DE3,218,121；Epstein,et al.,PNAS USA 82:3688-3692(1985)；Hwang et al.,PNAS USA 77:4030-4034(1980)；EP052322；EP036676；EP 088 046；EP143 949；EP142 641；JP-A83-118008；US专利4,485,045和4,544,545及EP102324)。脂质体一般是小的(约200-800)单层型结构，其中脂质含量大于30％(mol)胆固醇，所选择的比例调到最适于KGF-2治疗应用。
在一个实施方案中，用于肾肠道外给药的KGF-2一般是将其以所需纯度，按可注射单位剂型与医药可接受的(即在所用剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且是与配方的其他成分相容的)载体相混合而配制的。例如，配方中最好不合有氧化剂及已知对多肽有害的其他化合物。
也可作为滴剂，或在油膏、凝胶、脂质体或生物相容性多聚物园盘、片中或携带于隐形眼镜内，将KGF-2给药，以治疗人和动物的泪腺损伤、疾病及病理状况。眼内组合物也可含有本领域已知的并且可按常标准选用的生理相容性眼用载体。载体可选自已知的眼用载体，其中包括但不只限于水、聚醚如聚乙二醇400，聚乙烯如聚乙烯醇、povidone，纤维素衍生物如羧甲基纤维素、甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素，石油衍生物如矿物油和白凡士林，动物脂如羊毛脂，植物油如花生油，丙烯酸的聚合物如羧基聚亚甲基凝胶，多糖如葡聚糖，和糖胺聚糖，氯化钠、氯化钾、氯化锌之类盐及缓冲液如碳酸氢钠或乳酸钠。也可使用高分子量分子。不能失活组合物中存在之KGF-2的生理相容性防腐剂包括醇如氯丁醇、氯化苄烷和EDTA，或本领域已知的其他适用的防腐剂。
可以作为滴剂或以喷雾剂形式将KGF-2对鼻粘膜进行鼻内给药，以治疗动物和人的鼻粘膜和鼻窦上皮疾病、损伤及病理改变。各种类型的鼻内给药装置是本领域已知的。一般说来，常常借助带刻度的喷雾泵投用水溶液形式的肽。为了鼻内给药，可使用含有生理相容性载体的水悬液，并可按常规标准选择适当的已知载体。例如，可以单用水(如盐或无热源水)、水和生理可接受的非水载体(如乙醇、聚乙二醇如PEG400和丙二醇等)制备悬液。这样的悬液可另外含有其他辅助成分，例如防腐剂(如氯化苄烷、苯基乙醇及其他已知的季胺等)、润湿剂/表面活性剂(如Tween80等多乙氧基醚；Span80等山梨聚糖、缓冲剂(如乙酸/乙酸钠、柠檬酸/柠檬酸钠、柠檬酸/磷酸氢二钠、磷酸二氢钠/磷酸氢二钠等)、渗透压调节剂(如氯化钠)、粘膜吸收增强剂(如胆盐、大颗粒凝胶的单月桂酯、磷脂及梭链孢酸盐或酯衍生物)，以及粘度增强剂(如金合欢胶、皂土、羧甲基纤维素、明胶、羟甲基纤维素、甲基纤维素等)。
也可借助气雾剂配方鼻内投用KGF-2，其中用含氯氟烃(CFC)、含氢氟烃(HFC)、二氧化碳或其他合适气体作为推进剂，将肽组合物制成压缩包装。气雾剂还可含有表面活性剂如卵磷酯。可用已知的带刻度活阀装置控制药物剂量。
通常通过将KGF-2均匀和密切地与液体载体或精细分开的固体载体或这两者接触而制备制剂。然后，如有必要，将产物制成所需的制剂形状。优选载体是胃肠外载体，更优选为与受体血液等渗的溶液。这种载体的例子包括水，盐水，Ringer’s溶液和葡萄糖溶液。如固定油和油酸乙酯之类的不含水的载体以及脂质体在本文中也是有用的。本领域中已知的适当的制剂见于Remington’s PharmaceuticalSciences(最新版)，Mack出版公司，Easton,PA。
载体可适当地含有极少量的添加剂，如增强等渗性和化学稳定性的物质。这种物质在所用剂量和浓度下对受体是无毒性的，包括如磷酸盐，柠檬酸盐，琥珀酸，乙酸，和其它有机酸或其盐的缓冲液；如抗坏血酸之类的抗氧化剂；低分子量(少于约10个残基)的多肽，如多精氨酸或三肽；蛋白质，如血清白蛋白，明胶，或免疫球蛋白；亲水性的聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，或精氨酸；单糖，二糖和包括纤维素或其衍生物，葡萄糖，甘露糖或糊精等的其它碳水化合物；如EDTA之类的螯合剂；如甘露醇或山梨醇之类的糖醇；如钠之类的抗衡离子；和/或非离子型表面活性剂，如聚山梨酯，聚羟亚烃或PEG。
一般在pH约为3至8的条件下，以约为0.01微克/毫升至100毫克/毫升，优选为0.01微克/毫升至10毫克/毫升的浓度在所述载体中配制KGF-2。应理解使用上述某些赋形剂，载体或稳定剂会导致KGF-2盐的形成。
用于治疗应用的KGF-2应是无菌的。通过穿过无菌的滤膜(如0.2微米的膜)进行过滤可容易地完成除菌。治疗用的KGF-2组合物一般被置于具有无菌出入口的容器中，例如，静脉内溶液袋，或具有可被皮下注射针头穿透的塞子的小瓶。
通常，KGF-2可作为含水溶液或用于恢复的冻于制剂形式储存在单位剂量或多剂量的容器中，例如，密闭的安瓿瓶或小瓶中。冻干制剂的一个例子是将5ml经除菌过滤的1％(w/v)含水KGF-2溶液灌入10ml的小瓶，将所得混合物冻干。通过使用抑菌的注射用水恢复冻干的KGF-2可制备灌注溶液。
也可以以患者特异性的方式安排服药以便为血液提供经诸如RIA技术测定为预定浓度的KGF-2活性。因此，可调节患者的剂量安排以达到经RIA测定为以约50-1000ng/ml，优选为150-500ng/ml的浓度规则地不断流过血液的水平。
本发明药物组合物的施用方式有口服，直肠，胃肠外，脑池内，真皮内，阴道内，腹膜内，局部(通过粉末，软膏，凝胶，乳油，滴剂或经皮的补片)，颊，或口或鼻喷雾给药。“药学可接受的载体”是指无毒性的固体，半固体或液体填充剂，稀释剂，包裹材料或任何形式的制剂辅助物。本文所用的术语“胃肠外”指的是包括静脉内，肌内，腹膜内，胸骨内，皮下和动脉内注射和灌注等的施用模式。
1997年12月22日提交的美国专利临时申请No.60/068,493和1998年12月22日提交的美国专利临时申请(律师存档号1488,1030001)中描述了优选的KGF-2配方，这两篇申请均引入本文作为参考。
基因治疗可以体内表达多肽，以所谓“基因治疗”方式利用本发明的KGF-2多肽。基因治疗方法涉及将编码KGF-2多肽的核酸(DNA、RNA或反义DNA或RNA)序列导入动物体内，以实现KGF-2多肽的表达。这样的基因治疗和输送技术是已知的(如参见WO90/11092，将其引入本文作为参考)。
如下文更详细讨论的，最好KGF-2多核苷酸序列在被细胞摄取后即具有治疗作用。本身即为治疗剂的多核苷酸包括反义DNA和RNA；编码反义RNA的DNA；或编码tRNA或rRNA以取代缺陷或缺乏的内源性分子的DNA。例如，可将启动子可操作地连接到编码反义RNA的DNA序列上。反义RNA寡核苷酸在体内与mRNA杂交，并阻止mRNA分子翻译成多肽(Okano,J.Neurochem.56:560(1991))。反义RNA必须有足够长度并且是互补的，以阻止其靶mRNA的翻译。
异源多核苷酸也可编码治疗性多肽。治疗性多肽包括可补偿动物体内有缺陷的或缺乏的多肽，或通过其毒性作用限制或去除体内之有害细胞的多肽。在本发明中，治疗性多肽包括KGF-2多肽。
因此，例如可在体外用包括可操作连接了启动子之KGF-2多核苷酸的多核苷酸(DNA或RNA)工程化改造来自体内的病人细胞，然后为需要用KGF-2多肽治疗的病人提供此工程化细胞。这样的方法是本领域已知的(例如参见Belldegrun,A.et al.,J.Natl.Cancer Inst.85:207-216(1993)；Ferrantini,M.et al.,Cancer Research 53:1107-1112(1993)；Ferrantini,M.et al.,J.Immunology 153:4604-4615(1994)；Kaido,T.etal.,Int.J.Cancer 60:221-229(1995)；Ogura,H.et al.,Cancer Research50:5102-5106(1990)；Santodonato L.等，Human Cancer Therapy 7:1-10(1996)；Sanbodonato,L.et al.,Gene Therapy 4:1246-1255(1997)；Zhang,J.-F.et al.,Cancer Gene Therapy 3:31-38(1996))。被工程化改造的细胞可以是KGF-2在其中可能有治疗作用的任何类型的细胞。这样的细胞包括但不只限于肌肉细胞、上皮细胞、膀胱、前列腺、睾丸、泪腺、唾液腺、鼻窦上皮、结膜、骨髓干细胞和始姐细胞、肺、肝、胰、食道等组织来源的细胞。可通过向最初来源的组织内、最初来源的组织周围组织、静脉或动脉内直接注射，或通过导管注射，将这些工程化细胞重新导入病人体内。
同样，可按已知方法体内工程化改造细胞，以使体内表达治疗性多肽。可用任何一种能将构建体之类物质送递到动物细胞内的方法送递构建体，例如注射到组织的胞间隙中。可将构建体加在已知的药用液体或含水载体中送递。
在某些实施方案中，KGF-2多核苷酸可作为裸多核苷酸被送递。“裸”多核苷酸是指不含可帮助、促进或有利于进入细胞的任何送递载体的多核苷酸；包括病毒序列、病毒颗粒、脂质体配方、细胞转染剂、沉淀剂等。这些方法是本领域已知的(如参见美国专利5,593,972、5,589,466和5,580,859)。
用于本发明的裸多核苷酸可以是不整合到宿主细胞的基因组中的多核苷酸。其可以是非复制序列，或工程化改造后失去基因组整合能力的特殊复制序列。或者，用于本发明的裸多核苷酸可以通过同源重组整合到宿主细胞的基因组中(详见下文)。裸KGF-2多核苷酸构建体最好包含在质粒中。适用的表达载体包括但不只限于pRSVcat(ATCC 37152)、pSVL和MSG(Pharmacia,Uppsala,Sweden)、pSV2dhfr(ATCC 37146)和pBC12MI(ATCC67109)。其他适用的质粒如上文所述。
如上所述，裸多核苷酸可投用于任何组织(如肌肉组织)或器官。在另一个实施方案中，将裸多核苷酸投用于来源组织的组织周围。在另一个实施方案中，通过静脉内注射将裸多核苷酸全身投用。
可用已知方法送递裸多核苷酸，这些方法包括但不只限于直接在送递位点用针注射、静脉内注射(特别是门静脉注射)、局部投用、导管输注及使用所谓“基因枪”。这些送递方法是本领域已知的并在下文中详细讨论。
用于注射的裸多核苷酸的有效剂量范围约为0.05μg至50mg/kg体重，较好是大约0.005mg至20mg/kg体重，最好是约0.05mg至5mg/kg体重。本领域普通技术人员可根据待治疗的状况和给药途径很容易地确定多核苷酸构建体的适当和有效剂量。
也可使用病毒序列、病毒颗粒、脂质体配方、脂转染体、沉淀剂等送递载体投用构建体。这此送递方法是本领域已知的。例如，可通过Wu etal.,J.Biol.Chem.264:6985-16987(1989)中所述的方法向肝细胞送递多核苷酸构建体。
在某些实施方案中，将KGF-2多核苷酸构建体复合成脂质体制剂。用于本发明的脂质体制剂包括阳离子(带正电荷的)、阴离子(带负电荷的)和中性制剂。因为阳离子脂质体和多阴离子核酸之间可形成紧密带电复合物，所以特别优选阳离子脂质体。已显示阳离子脂质体可介导质粒DNA(Felgner et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1987)84:7413-7416)、mRNA(Malone et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1989)86:6077-6081)和纯化的转录因子(Debs et al.,J.Biol.Chem.(1990)265:10189-10192)以功能形成向细胞内送递。
很容易得到阳离子脂质体。例如，可很容易从GIBCO BRL,GrandIsland,N.Y.购得商标名为Lipofectin的N[1-2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三乙铵(DOTMA)脂质体(参见Felgner et al.,Proc,Natl.Acad.Sci.USA(1987)84:7413-7416)。其他商品脂质体包括transfectace(DDAB/DOPE)和DOTAP/DOPE(Boehringer)。
可使用本领域已知的技术从很容易得到的材料制得其他阳离子脂质体。例如有关合成DOTAP(1,2-双(油酰氧基)-3-(三甲基铵基)丙烷)脂质体的方法可参见PCT No.WO90/11092。又如P.Felgner等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413-7417)阐述了DOTMA脂质体的制备。可使用相似方法从其他阳离子脂质材料制备脂质体。
同样，例如可从Avanti Polar Lipids(Birningham,Ala)很容易地得到阴离子和中性脂质体，或者也可使用易于获得的材料制备之。这类材料包括磷脂酰胆碱、胆固醇、磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)等。可按适当比例将这些材料与DOTMA和DOTAP起始材料混合。使用这些材料制备脂质体的方法是已知的。
例如，可在加或不加入胆固醇的情况下，以各种组合使用商品二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)制造常用脂质体。因此，如可在氮气流下将各50mg DOPE和DOPC加在超声发生容器中干燥以制备DOPG/DOPC小泡。在真空泵下将样品放置过夜，并在第二天用去离子水水合。然后使用装有最大设置值的倒转帽(浴器型)探头的350型Heat Systems超声发生器，在加盖容器中将样品超声处理2小时，同时于15℃进行浴循环。或者，也可以不经超声处理制备带负电荷的小泡以产生多层脂质体，或通过核孔膜挤出以产生离散大小的单层脂质体。其他方法是本领域技术人员已知的和可以利用的。
脂质体可包括多层脂质体(MLV)、小的单层脂质体(SUV)或大的单层脂质体(LUV)，其中优选的是SUV。使用本领域已知的方法(如参见Straubinger et al.,Methods of Immunology 101:512-527,1983)制备各种脂质体-核酸复合物。例如，将磷脂的薄膜浇涂在玻璃管壁上，然后用待包裹材料的溶液水合即可制得含有核酸的MLV。延长对MUV的超声处理以产生单层脂质体的均质群体即制得SUV。将待包裹的材料加到预先形成之MLV的悬液中，然后进行超声处理。当使用含有阳离子脂质的脂质体时，将干燥的脂质膜重新悬浮在适当的溶液如无菌水或等渗缓冲液如10mM Tris/NCl中，超声处理，然后使预先生成的脂质体与DNA直接混合。由于带正电荷的脂质体与阳离子DNA结合，所以脂质体和DNA形成很稳定的复合物。SUV可与小的核酸片段合用。可用许多已知的方法制备LUV。常用的方法包括Ca2+-EDTA螯合(Papahadjopoulos et al.,Biochim.Biophys.Acta 394:483,1975；Wilson et al.,Cell 17:77,1979)、醚注射(Deamer,D.and Bangham,A.,Biochim.Biophys.Acta443:629,1976；Ostro etal.,Biochem.Biophys.Res.Commun.76:836,1977；Fraley et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:3348,1979)，去污剂透析(Enoch,H.and Strittmatter,P.,Proc,Natl.Acad.Sci.USA76:145,1979)和反相蒸发(REV)(Fraley et al.,J.Biol.Chem.255:10431,1980；Szoka,F.and Papahadjopoulos,D.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:145,1978；Schaefer-Ridder et al.,Science 215:166,1982)。
有用的阳离子脂质的其他例子包括二棕榈酰磷脂酰乙醇胺5-羧基鲸蜡酰胺(dipalmitoyl-phosphatidylethanolamine 5-carboxyspen-nylamide,DPPES)，5-羧基鲸蜡基甘氨酸双十八酰胺(DOGS)、二甲基双十八烷基铵溴化物(DDAB)和(±)-N,N-二甲基-N-[2-(精胺羧酰胺)乙基]-2,3-双(二油基氧基)-1-丙亚铵五盐酸盐(DOSPA)。非二醚阳离子脂质如DL-1,2-二油酰-3-二甲基氨丙基-β-羟乙基铵(DORI二酯)、1,2-O-二油基-3-二甲基氨丙基-β-羟乙基铵(DORIE二醚)、1-O油基-2-油酰基-3-二甲基氨丙基-β-羟乙基铵(DORI酯/醚)及其盐促进体内基因送递。阳离子型胆固醇衍生物如{3β[N-N＇,N＇-二甲氨基)乙烷]-氨基甲酰基}-胆固醇(DC-Chol)也是有用的。
优选的阳离子脂质包括(±)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)-1-丙亚铵溴化物、3,5-(N,N-二赖氨酰)二氨基苯甲酰甘氨酰-3-(DL-1,2-二油酰-二甲基氨丙基-β-羟乙胺)(DLYS-DABA-GLY-DORI二酯)、3,5-(N,N-二赖氨酰)-二氨基苯甲酰-3-(DL-1,2-二油酰-二甲基氨基丙基-β-羟乙胺)(DLYS-DABA-DORI二酯)、和1,2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺。另外优选的是下列脂质的组合1∶1的(±)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)-1-丙亚铵溴化物和1,2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺，以及(±)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)-1-丙亚铵溴化物和1,2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺。
脂质配方可以只包括阳离子脂质，或者还包括中性脂质如心磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、1,2-二油酰-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、鞘磷酯和一、二或三酰甘油。
脂质配方也可具有与溶血磷脂(lysophosphatide)合在一起的阳离子脂质。溶血磷脂可以有中性或阴性头部基因。有用的溶血磷脂包括溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺和1-油酰基溶血磷脂酰胆碱。可使用其他添加剂，如胆固醇、脂肪酸、神经节苷脂、糖脂、neobee、niosome、前列腺素、鞘脂及其他天然或合成的两亲物。这些脂质配方中阳离子脂质与中性脂质的优选摩尔比例约为9∶1至1∶9，在溶血脂质与阳离子脂质1∶2的含脂质配方中，优选等摩尔比例。
一般说来，DNA对脂质体的比例约为10∶1至1∶10，优选的比例约为5∶1至1∶5，更优选的比例约为3∶1至1∶3，特别优选的比例为大约1∶1。
美国专利No.5,676,954报导了向小鼠体内注射与阳离子脂质体复合的遗传物质。美国专利4,897,355、4,946,787、5,049,386、5,459,127、5,589,466、5,693,622、5,580,859、5,703,055和国际申请WO94/9469报导了用于向细胞和哺乳动物体内转染DNA的阳离子脂质。美国专利5,589,466、5,693,622、5,580,859、5,703,055和国际申请WO94/9469提供了向哺乳动物体内送递DNA-阳离子脂质复合物的方法。
在某些实施方案中，于体内或离体方式使用含有RNA的反转录病毒颗粒工程化改造细胞，所说的RNA含有与启动子可操作连接的编码KGF-2的多核苷酸。可由之衍生反转录病毒质粒载体的反转录病毒包括但不只限于Moloney鼠白血病病毒、脾坏死病毒、Rous肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽白血病病毒、长臂猿白血病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增殖性肉瘤病毒和乳癌病毒。
用反转录病毒质粒载体转导包装细胞系以形成生产细胞系。可被转染的包装细胞包括但不只限于PE501、PA317、φ-2、φ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、φ CRE、φCRIP、GP+E-86、GP+envAm12和Miller(Haman Gene Therapy 1:5-14,1990)所述的DNA细胞系。载体可通过任何已知方法来转导包装细胞。这些方法包括但不只限于电穿孔、使用脂质体和CaPO4沉淀。另外，亦可将反转录病毒质粒载体包裹到脂质体中，或偶联到脂质上，然后投用于宿主。
生产细胞系产生其中包括对可操作连接了启动子之KGF-2多核苷酸的反转录病毒载体颗粒。然后可利用这样的反转录病毒载体颗粒于体外或体内转导真核细胞。被转导的真核细胞将表达所需的多肽。
在某些其他实施方案中，使用包含在腺病毒载体中的与启动子可操作地连接的KGF-2多核苷酸于体内或离体工程化改造细胞。可加工腺病毒使之编码并表达所需的基因产物，同时它被失活以失去其在正常裂解的病毒生命周期中复制的能力。在病毒DNA没有整合到宿主细胞染色体内的情况下实现腺病毒表达，从而减少插入突变的机会。此外，多年来已使用腺病毒作为极及安全的活肠道疫苗(Schwartz,A.R.et al.,Am.Rev.Respir.Dis.109:233-238,1974)。最后，已在许多情况中证明了腺病毒介导的基因转移，包括将α-1-抗胰蛋白酶和CFTR转移到棉鼠的肺中(Rosenfeld,M.A.et al.,Science 252:431-434,1991；Rosenfeld et al.,Cell 68:143-155,1992)。再者，试图确定腺病毒为人类肿瘤致病因子的广泛研究均为阴性结果(Green,M.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA76:6606,1979)。
例如，Kozarsky和Wilson(curr.Opin.Genet.Devel.3:499-503,1993)、Kosenfeld等人(Cell 68:143-155,1992)、Engelhardt等人(HumanGenet.Ther.4:759-769,1993)、Yang等人(Nature Genet.7:362-369,1994)、Wilson等人(Nature 365:691-692,1993)及美国专利No.5,652,224(均引入本文作为参考)中都描述了适用于本发明的腺病毒载体。例如腺病毒载体Ad2即是适用的并可在人293细胞中生长。这些细胞含有腺病毒的E1区域并组成型表达Ela和Elb，其通过提供该载体中缺失基因的产物来弥补有缺陷的腺病毒。除Ad2外，其他病毒变异体(如Ad3、Ad5和Ad7)也适用于本发明。
用于本发明的腺病毒最好是复制缺陷型的。复制缺陷型腺病毒需要借助于辅助病毒和/或包装细胞以形成感染性颗粒。所得到的病毒能够感染细胞并可表达可操作地连接到启动子上的有用多核苷酸(例如本发明的KGF-2多核苷酸)，但不能在大多数细胞中复制。复制缺陷型腺病毒可以缺失一个或多个下列基因的全部或部分Ela、Elb、E3、E4、E2a或L1至L5。
在某些其他实施方案中，使用腺伴随病毒(AAV)在体内或离体工程化改造细胞。AAV是天然存在的有缺陷病毒，其需要辅助病毒帮助产生感染性颗粒(Muzyczka,N.,Curr.Topics in Microbiol.Immunol.158:87,1992)。该病毒还是少数几种可将其DNA整合到非分裂细胞中的病毒之一。可以包装并可整合含有少至AAV的300个碱基对的载体，但容纳外源DNA的空间限于约4.5Kb。生产和使用这种AAV的方法是本领域已知的(如参见美国专利5,139,941、5,173,414、5,354,678、5,436,146、5,474,935、5,478,745和5,589,377。
例如，用于本发明的适当的AAV载体将包括DNA复制、包壳和宿主细胞整合所必须的所有序列。使用标准克隆方法(如参见Sambrooket al.,Molecular Cloring:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,1989)将KGF-2多核苷酸构建体插入到AAV载体中。然后使用脂转染、电穿孔、磷酸钙沉淀等标准技术，将重组AAV载体转染到被辅助病毒感染的包装细胞中。适用的辅助病毒包括腺病毒、巨细胞病毒、痘苗病毒或疱疹病毒。一旦包装细胞被转染和感染，它们将产生含有KGF-2多核苷酸构建体的感染性AAV病毒颗粒。然后用这些病毒颗粒以离体方式或于体内转导真核细胞。被转导的细胞将含有整合到其基因组中的KGF-2多核苷酸构建体，并将表达有用的分子。
基因治疗的另一种方法包括通过同源重组(如参见美国专利No.5,641,670(1997年6月24日)、国际公开WO96/29411(1996年9月26日公开)、国际公开WO94/12650(1994年8月4日公开)、Koller et al.,PNASUSA 86:8932-8935(1989)和Zijlstra et al.,Nature 342:435-438(1989))可操作地连接异源性控制区(如启动子)和内源性多核苷酸序列(如KGF-2)。该方法包括激活存在于靶细胞中但不能在其中正常表达或以较预期更低的水平表达的基因。
使用本领域已知的标准方法制备多核苷酸构建体，其含有有用的启动子并且启动子的侧翼接有导向序列。导向序列与内源序列互补程度足以使启动子-导向序列与内源序列进行同源重组。导向序列距所需的内源性核苷酸序列的5＇足够地近，以致在同源重组后该启动子能与内源序列可操作连接。可使用PCR扩增启动子和导向序列。经扩增的启动子最好在5＇和3＇末端含有不同的限制性酶切位点。最好是第-个导向序列的3＇末端和扩增的启动子的5＇末端含有同样的限制性酶切位点，并且第二个导向序列的5＇末端和扩增的启动子的3＇末端含有同样的限制性酶切位点。消化扩增的启动子和导向序列并将它们连接在一起。
作为裸多核苷酸，或与转染促进剂如上文详述的脂质体、病毒序列、病毒颗粒、完整病毒、脂转染体、沉淀剂联合，将启动子-导向序列构建体送递到细胞内。可用于送递启动子-导向序列的方法包括直接针头注射、静脉内注射、局部投用、导管输注、使用颗粒加速器等。下文详细描述这些方法。
启动子-导向序列构建体被细胞摄入。发生构建体和内源序列之间的同源重组，以使内源序列(如KGF-2)处于该启动子的控制之下。然后启动子驱动内源序列(如KGF-2)的表达。
可将本发明的KGF-2多核苷酸用于基因治疗，以治疗本文所述的代谢性、感染性疾病或其他疾病。最好本发明的KGF-2多核苷酸可操作地连接到启动子上，以便缓解本文所述待治疗疾病的症状或治愈疾病。
只要使上述多核苷酸构建体的一个或多个分子以足可提供治疗效果的量表达，其任何给药方式均可使用。所说的给药方式包括直接针头注射、全身注射、导管输注、biolistic喷射器、颗粒加速器(即“基因枪”)、凝胶泡沫海绵存储物、其他市售存储材料、渗透泵(如Alza小型泵)、口服或栓剂固体(片剂或丸剂)药物配方，以及手术期间使用的移注或局部应用法。例如，将磷酸钙沉淀的裸质粒直接注射到大鼠肝脏和大鼠脾脏中，或将蛋白质包被的质粒注射入门静脉，导致外来基因在大鼠肝脏中表达(Kaneda等，Science 243:375(1989)。
优选的局部给药方法是直接注射。最好通过直接注射将与送递载体复合的本发明的重组分子送入肝脏或其局部区域。在肝脏局部区域内投用组合物是指将组合物注入肝脏的厘米，特别是毫米范围内。
局部投用的另一种方法是使本发明的KGF-2多核苷酸-启动子构建体接触外科伤口或其周围。例如，病人可经受外科手术并使多核苷酸构建体涂敷在伤口内组织的表面上，或可将构建体注入伤口内的组织区域中。
可用于全身给药的治疗组合物包括与本发明的导向送递载体复合的本发明的重组分子。全身给药时可使用的适用送递载体包括脂质体，其中含有将载体导向特定部位的配体，例如将载体导向感兴趣组织的配体。用于其他组织和器官的导向载体是本领域技术人员已知的。
优选的全身给药方法包括静脉内注射、气雾剂、口服和经皮(局部)释放。可用标准方法进行静脉内注射。也可使用标准方法进行气雾剂送递(如参见Stribling et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 189:11277-11281,1992，将其引入本文作为参考)。可以将本发明的多核苷酸构建体与能够耐受动物肠道内消化酶降解的载体复合，以完成口服送递。这样的载体包括本领域已知的塑料胶囊或片等。可以将本发明的多核苷酸构建体与能够通过皮肤的亲水试剂(如DMSO)混合，以完成局部送递。
可依据许多因素来确定待送递之物质的有效量，这些因素包括物质的化学结构和生物学活性、动物的年龄和体重、需要治疗的确切状况和其严重程度，以及给药途径。治疗的用药频率取决于每剂投用的多核苷酸构建体的量及个体的健康状况及病史等许多因素。由临床医生或兽医来确定精确用量、给药次数及疗程。
本发明的治疗组合物可投用于任何动物，特别是哺乳动物和鸟类。优选的哺乳动物包括人、狗、猫、小鼠、大鼠、兔、绵羊、牛、马和猪，特别是人。
实施例1KGF-2的细菌表达和纯化将编码KGF-2的DNA序列ATCC#75977首先用PCR寡核苷酸引物扩增，所述引物对应于加工过的KGF-2 cDNA(包括信号肽序列)的5’和3’序列。5’寡核苷酸引物含有序列5’CCCCACATGTGGAAATGGATACTGACACATTGTGCC3’(SEQ ID NO.3)，该序列含有AflⅢ限制酶位点，该位点包括并随后是从推测的起始密码子开始的KGF-2编码序列的30个核苷酸。3’序列5’CCCAAGCTTCCACAAACGTTGCCTTCCTCTATGAG3’(SEQ ID NO.4)含有HindⅢ位点的互补序列，随后是KGF-2的26个核苷酸。这些限制酶位点与细菌表达载体pQE-60(Qiagen,Inc.Chatsworth,CA)上的限制酶位点相容。pQE-60编码抗生素抗性(AMpr)，一个细菌复制起点(ori)，IPTG调节型启动子操纵子(P/O)，核糖体结合位点(RBS),6-His标记和限制酶位点。然后将pQE-60用NcoⅠ和HindⅢ消化。将扩增的序列连接到pQE-60中，并符合读框地插入。然后按照Sambrook,J.等在分子克隆实验室操作手册(MolecularCloning:A Laboratory Manual)(冷泉港实验室出版社(1989))中描述的方法，用连接混合物转化大肠杆菌菌株M15/rep4(Qiagen,Inc.)。M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，该质粒表达lacI阻遏物并赋予卡那霉素抗性(Kanr)。根据其在LB平板上的生长能力来鉴定转化体，并筛选出氨苄青霉素/卡那霉素抗性菌落。分离质粒DNA并通过限制分析进行鉴定。使含所期望的构建体的克隆在补加了Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中生长过夜(O/N)。以1∶100至1∶250的比例，用O/N培养物接种大体积培养基。使细胞生长至光密度600(O.D.600)为0.4-0.6。然后加入IPTG(异丙基-B-D-硫代半乳糖苷)达到1mM的终浓度。通过使lacⅠ阻遏物失活，IPTG诱导清理所述P/O，从而导致基因表达的增加。使细胞再生长3至4小时。然后通过离心收集细胞。将细胞沉淀溶解于离液剂6 M盐酸胍中。澄清后，在可以紧密结合蛋白质的条件下，在肝素亲和柱上通过色谱从该溶液中纯化溶解的KGF-2(Hochuli,E.等，色谱学杂志，411:177-184(1984))。用高盐缓冲液从该柱上将KGF-2(75％纯)洗脱下来。实施例2KGF-2截短变体的细菌表达和纯化将编码KGF-2的DNA序列，ATCC#75977首先用PCR寡核苷酸引物扩增，所述引物对应于KGF-2多肽之截短变体的5’和3’序列。所述截短变体含所述多肽但无所述36个氨基酸的信号序列，在全长蛋白质氨基酸37的半胱氨酸残基前加入一个甲硫氨酸和丙氨酸残基。所述5’寡核苷酸引物含有序列5’CATGCCATGGCGTGCCAAGCCCTTGGTCAGGACATG3’(SEQ ID NO:5)，该序列含有NcoⅠ限制酶位点，该位点接着KGF-2编码序列的24个核苷酸。3’序列5’CCCAAGCTTCCACAAACGTTGCCTTCCTCTATGAG3’(SEQ ID NO:6)含有与HindⅢ位点互补的序列，随后是KGF-2基因的26个核苷酸。所述限制酶位点与细菌表达载体pQE-60(Qiagen,Inc.Chatsworth,CA)上的限制酶位点相容。pQE-60编码抗生素抗性(Ampr)，一个细菌复制起点(ori),IPTG调节型启动子操纵子(P/O)，核糖体结合位点(RBS),6-His标记和限制酶位点。然后将pQE-60用NcoⅠ和HindⅢ消化。将扩增的序列连接到pQE-60中，并符合读框地插入。然后按照Sambrook,J.等在分子克隆实验室操作手册(冷泉港实验室出版社(1989))中描述的方法，用连接混合物转化大肠杆菌菌株M15/rep4(Qiagen,Inc.)。M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，该质粒表达lacI阻遏物并赋予卡那霉素抗性(Kanr)。根据其在LB平板上的生长能力来鉴定转化体，并筛选出氨苄青霉素/卡那霉素抗性菌落。分离质粒DNA并通过限制分析进行鉴定。使含所需要的构建体的克隆在补加了Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中生长过夜(O/N)。以1∶100至1∶250的比例，用O/N培养物接种大体积培养基。使细胞生长至光密度600(O.D.600)为0.4-0.6。然后加入IPTG(异丙基-B-D硫代半乳糖苷)达到1 mM的终浓度。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导清理所述P/O，从而导致基因表达的增加。使细胞再生长3至4小时。然后通过离心收集细胞。将细胞沉淀溶解于离液剂6M盐酸胍中。澄清后，在可以紧密结合蛋白质的条件下，在肝素亲和柱上通过色谱从该溶液中纯化溶解的KGF-2(Hochuli,E.等，色谱学杂志，411:177-184(1984))。用高盐缓冲液从该柱上将KGF-2洗脱下来。实施例3用杆状病毒表达系统克隆并表达KGF-2将编码全长KGF-2蛋白质的DNA序列ATCC#75977用PCR寡核苷酸引物扩增，所述引物对应于该基因的5’和3’序列5’引物含有序列5’GCGGGATCCGCCATCATGTGGAAATGGATACTCAC3’(SEQ ID NO:7)并含有BamHⅠ限制酶位点(斜体字)，该位点后接有6个核苷酸，代表真核细胞中的一个有效翻译起始信号(Kozak,M.，分子生物学杂志，196:947-950(1987))并正好在KGF-2基因的前17个核苷酸后(划线部分为翻译起始密码子“ATG”)。
3’引物含有序列5’GCGCGGTACCACAAACGTTGCCTTCCT3’(SEQ ID NO:8)并含有限制内切酶Asp718的切割位点和与KGF-2基因之3’非翻译序列互补的19个核苷酸。用市售试剂盒(Qiagen,Inc.,Chatsworth,CA)从1％琼脂糖凝胶上分离扩增的序列。然后将该片段用内切酶BamHⅠ和Asp718消化，再在1％琼脂糖凝胶上纯化。将该片段命名为F2。
用杆状病毒表达系统(有关综述参见Summers,M.D.&Smith,G.E.,杆状病毒载体和昆虫细胞培养方法手册(A manual of methods forbaculovirus vectors and insect cell culture procedures),TexasAgricultural Experimental Station Bulletin No.1555(1987))，将载体pA2(修饰的pVL941载体，下文讨论)用于表达KGF-2蛋白质。该表达载体含有苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)的强多角体蛋白启动子，该启动子后接有限制内切酶BamHⅠ和Asp718的识别位点。将猿猴病毒(SV)40的聚腺苷酸化位点用于有效的聚腺苷酸化。为了易于筛选重组体病毒，将大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因以与多角体蛋白启动子相同的方向插入，所述启动子后接有多角体蛋白基因的聚腺苷酸化信号。多角体蛋白序列的两侧均有病毒序列，所述病毒序列用于细胞介导的共转染的野生型病毒DNA之同源重组。可以用许多其它杆状病毒载体，例如pAc373,pVL941和pAcⅠM1(Luckow,V.A.&Summers,M.D.，病毒学170:31-39)。
将该质粒用限制酶BamHⅠ和Asp718消化。然后用市售试剂盒(Qiagen,Inc.,Chatsworth,CA)从1％琼脂糖凝胶上分离该DNA。将该载体DNA命名为V2。
将片段F2和质粒V2用T4 DNA连接酶连接。然后转化大肠杆菌HB101，通过使用两个克隆寡核苷酸的PCR,鉴定含带KGF-2基因之质粒(pBackGF-2)的细菌。用DNA测序确定该克隆片段的序列。
用脂转染法(Felgner等，美国国家科学院院报，84:7413-7417(1987))将5μg质粒pBacKGF-2与1.0μg市售线性化杆状病毒(“BaculoGoldTM杆状病毒DNA”,Pharmingen,San Diego,CA)共转染。
在含50μl无血清Grace’s培养基(Life Technologies Inc.,Gaithersburg,MD)之微滴定板的无菌孔中，将1μg BaculoGoldTM杆状病毒DNA与5μg质粒pBacKGF-2混合。此后，加入10μlLipofectin加90μl Grace’s培养基，混合并在室温培养15分钟。然后将转染混合物滴加至Sf9昆虫细胞(ATCC CRL 1711)中，所述Sf9昆虫细胞接种于含1毫升无血清的Grace’s培养基的35毫米组织培养平板中。将该平板前后摇动以混合新加入的溶液。然后将平板在27℃保温5小时。5小时后，从平板中除去转染溶液，并加入1毫升补加了10％胎牛血清的Grace’s昆虫培养基。将平板放回至培养箱中，在27℃继续培养4天。
4天后，收集上清液，然后按照与Snmmers和Smith(出处同前)所述相似的方法完成噬斑试验。作为一种改进，使用含“Blue Gal”(LifeTechnologies Inc.,Gaithersburg)的琼脂糖凝胶，这样可以容易分离出蓝色噬斑。(“噬斑试验”的详细描述可参见Life Technologies Inc.提供的有关昆虫细胞培养和杆状病毒学的用户指南，9-10页)。
系列稀释后4天，将病毒加到细胞中，用Eppendorf取液器的吸头挑出染成蓝色的噬斑。然后将含重组病毒的琼脂重悬在含200μl Grace’s培养基的Eppendorf管中。通过简单离心除去琼脂，利用含重组杆状病毒的上清液来感染接种于35毫米平皿中的Sf9细胞。4天后，收集这些培养平皿的上清液，然后贮存于4℃。
使Sf9细胞在补加了10％热失活的FBS的Grace’s培养基中生长。以感染复数(MOI)2用重组杆状病毒V-KGF-2感染所述细胞。6小时后，除去培养基，并换成SF900Ⅱ培养基减甲硫氨酸和半胱氨酸(LifeTechnologies Inc.,Gaithersburg)。42小时后，加入5μCi35S甲硫氨酸和5μCi35S半胱氨酸(Amersham)。再培养细胞16小时，然后离心收集细胞并通过SDS-PAGE和放射自显影肉眼观察被标记上的蛋白质。实施例4大部分用于在哺乳动物细胞中瞬时表达KGF-2蛋白质基因序列的载体都应携有SV40复制原点。这样在表达T抗原的细胞(例如COS细胞)中可以复制很多拷贝的载体，所述T抗原是启动病毒DNA合成所需的。也可将任何其它哺乳动物细胞系用于该目的。
典型的哺乳动物表达载体含有介导mRNA转录起始的启动子，蛋白质编码序列和终止转录所需的信号，以及转录本聚腺苷酸化所需的信号。其它元件包括增强子，Kozak序列，和侧翼是用于RNA剪接的供体和受体位点的间插序列。用SV40的早期和晚期启动子，逆转录病毒(例如RSV,HTLVI,HIVI)的长末端重复序列(LTR)和巨细胞病毒(CMV)的早期启动子可达到高效转录。然而，也可以使用细胞信号(例如人肌动蛋白启动子)。用于实施本发明的适宜的表达载体包括例如pSVL和pMSG(Pharmacia,Uppsala,Sweden),pRSVcat(ATCC 37152),pSV2dhfr(ATCC 37146)和pBC12MI(ATCC 67109)。可以使用的哺乳动物宿主细胞包括人Hela细胞，283细胞，H9细胞和Jurkart细胞，小鼠NIH3T3细胞和C127细胞，Cos1细胞，Cos7细胞和CV1细胞，非洲绿猴细胞，鹌鹑QC1-3细胞，小鼠L细胞和中国仓鼠卵巢细胞。
或者，可在稳定的细胞系中表达该基因，所述细胞系含有整合到染色体中的该基因。与选择性标记如dhfr、gpt、新霉素、潮霉素基因共转染可鉴定并分离出被转染的细胞。
还可扩增被转染的基因以表达大量的编码蛋白。DHFR(二氢叶酸还原酶)是一种有用的标记，可用来培育携带数百甚至数千拷贝之所需基因的细胞系。另一个有用的选择性标记是谷氨酰胺合成酶(GS)(Murphy等，生物化学杂志，227:277-279(1991)；Bebbington等，生物/技术，10:169-175(1992))。利用这些标记，可以使哺乳动物细胞在选择性培养基中生长并筛选出有最大抗性的细胞。这些细胞系含有整合至染色体中的扩增的基因。经常利用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞来生产蛋白质。
表达载体pC1和pC4含有劳氏肉瘤病毒的强启动子(LTR)(Cullen等，分子和细胞生物学，438-447(1985年3月))和CMV增强子片段(Boshart等，细胞，41:521-530(1985))。多克隆位点，例如限制酶切割位点BamHⅠXbaⅠ和Asp718有利于所需基因的克隆。所述载体还含有大鼠前胰岛素原基因的3’内含子及聚腺苷酸化和终止信号。A．在COS细胞中表达重组KGF-2表达质粒KGF-2 HA衍生于载体pcDNAＩ/Amp(Invitrogen)，该载体中含有1)SV40复制起点，2)氨苄青霉素抗性基因，3)大肠杆菌复制起点，4)接有多接头区的CMV启动子，SV40内含子和聚腺苷酸化位点。HA标记对应于前述衍生于流感病毒血凝素蛋白的一个表位(Wilson,I.等，细胞，37:767(1984))。HA标记融合于靶蛋白上，使得用识别HA表位的抗体很容易检测该重组蛋白。编码整个KGF-2前体HA标记的DNA片段与HA标记读框一致地融合，因此该重组蛋白质的表达是在CMV启动子的指导下。
将质粒构建策略描述于下用下列两个引物通过PCR构建编码KGF-2的DNA序列ATCC#75977:5’引物5’TAACGAGGATCCGCCATCATGTGGAAATGGATACTGACAC3’(SEQ ID NO:9)含有BamHⅠ位点，后接有从起始密码子开始的KGF-2编码序列的22个核苷酸；3’序列5’TAAGCACTCGAGTGAGTGTACCACCATTGGAAGAAATG3’(SEQ ID NO:10)含有与XhoⅠ位点互补的序列，HA标记和KGF-2编码序列的最后26个核苷酸(不包括终止密码子)。因此，该PCR产物含有BamHⅠ位点，KGF-2编码序列并接有一个XhoⅠ位点，一个符合读框地融合的HA标记，与HA标记相接的翻译终止密码子。将PCR扩增的DNA片段和载体pcDNA-3’HA用BamHⅠ和XhoⅠ限制酶消化并连接，得到pcDNA-3’HA-KGF-2。将连接混合物转化到大肠杆菌菌株XL1 Blue(Stratagene Cloning Systems,La Jolla,CA)中，将转化培养物铺在氨苄青霉素培养基平板上并筛选抗性菌落。从转化体中分离出质粒DNA，通过PCR和限制分析以检测是否存在正确的片段。为了表达重组KGF-2，通过DEAE-DEXTRAN方法(Sambrook,J.，等，分子克隆实验室手册，冷泉港实验室出版社(1989))，用所述表达载体转染COS细胞。通过放射性标记和免疫沉淀法(Harlow,E.&Lane,D.，抗体实验室手册，冷泉港实验室出版社(1988))检测KGF-2HA蛋白质的表达。转染2天后，将细胞用35S-半胱氨酸标记8小时。然后收集培养基，并用去污剂(RIPA缓冲液(150mM NaCl,1％NP-40,0.1％SDS,1％NP-40,0.5％DOC,50mM Tris,pH7.5))(Wilson,Ⅰ.等，出处同前，37:767(1984))裂解细胞。细胞裂解产物和培养基均用HA特异性单克隆抗体进行沉淀。将沉淀的蛋白质在15％SDS-PAGE凝胶上分析。B.利用CHO表达系统表达并纯化人KGF-2蛋白质将载体pC1用于KGF-2蛋白质的表达。质粒pC1是质粒pSV2-dhfr[ATcc登记号37146]的衍生物。这两个质粒均含有在SV40早期启动子控制下的小鼠DHFR基因。用这些质粒转染的不具有二氢叶酸活性的中国仓鼠卵巢细胞或其它细胞可通过使细胞在补加了化疗剂氨甲喋呤的选择性培养基(α-MEM,Life Technologies)上生长来进行筛选。对在氨甲喋呤(MTX)抗性细胞中扩增DHFR基因已经有许多记载(参见例如Alt,F.W.,Kellems,R.M.,Bertino,J.R.，和Schimke,R.T.,1978,生物化学杂志，253:1357-1379,Hamlin,J.L.和Ma,C.1990,生物化学和生物物理学通报，1097:107-143,Page,M.J.和Sydenham,M.A.1991，生物技术，9:64-68)。通过目标酶DHFR的过生产，在浓度不断增加的MTX中生长的细胞发展了对该药物的抗性，所述DHFR的过生产是DHFR基因扩增的结果。如果将第二种基因与DHFR基因相连，则该基因通常也会被共扩增和过表达。这是本领域用来培育含1000拷贝以上目标基因之细胞系的方式。随后，当除去氨甲喋呤后，细胞系含有整合至染色体中的扩增的基因。
为了表达所需基因，质粒pC1含有劳氏肉瘤病毒之长末端重复序列(LTR)的强启动子(Cullen,等，分子和细胞生物学(Molecular and CellularBiology),1985年3月号:438-4470)加上从人巨细胞病毒(CMV)之即早期基因的增强子中分离出的一个片段(Boshart等，细胞，41:521-530,1985)。所述启动子下游是下列可使基因进行整合的单一限制酶切割位点BamHⅠ,PvulⅠ和Nrul。在这些克隆位点后，该质粒在所有三种阅读框架中含有翻译终止密码子，其后接有大鼠前胰岛素原基因的3’内含子和聚腺苷酸化位点。也可将其它高效启动子用于该表达，例如人β肌动蛋白启动子，SV40早期或晚期启动子或其它逆转录病毒例如HIV和HTLVI的长末端重复序列。对于mRNA的聚腺苷酸化，也可以使用例如来自人生长激素或珠蛋白基因的其它信号。
在与选择性标记例如gpt,G418或潮霉素基因共转染后，也可以筛选携带整合至染色体中之基因的稳定细胞系。开始时最好使用一种以上的选择性标记，例如G418加氨甲喋呤。
将质粒pC1用限制酶BamHⅠ消化，然后通过本领域已知的方法，用牛肠磷酸酶去磷酸化。再从1％琼脂糖凝胶中分离所述载体。
用下列PCR寡核苷酸引物扩增编码KGF-2的DNA序列ATCCNo.75977，所述寡核苷酸引物对应于该基因的5’和3’序列。5’引物含有序列5’TAACGAGGATCCGCCATCATGTGGAAATGGATACTGACAC3’(SEQ ID NO:9)，其中含有BamHⅠ位点(下划线)，后接有图1(SEQ ID NO:1)的KGF-2编码序列的21个碱基。如下所述，插入到一表达载体后，编码人KGF-2的扩增片段的5’末端提供了一有效的信号肽。如Kozak,M.(分子生物学杂志，196:947-950(1987))所述，用于真核细胞翻译起始的有效信号适当地插在所述构建体的载体部分。
3’引物含有序列5’TAAGCAGGATCCTGAGTGTACCACCATTGGAAGAAATG 3’(SEQ ID NO:10)，该序列含有BamHI限制位点，后接有与图1(SEQ ID NO:1)所列KGF-2编码序列的最后26个核苷酸(不包括终止密码子)互补的核苷酸。
按上述从1％琼脂糖凝胶中分离扩增的片段，用内切核酸酶BamHⅠ消化，然后再在1％琼脂糖凝胶上纯化。
将分离的片段和去磷酸化的载体用T4 DNA连接酶连接。然后转化大肠杆菌HB101细胞，鉴定含质粒pC1的细菌。通过DNA测序确定插入基因的序列和方向。CHO-DHFR细胞的转染将缺乏活性DHFR酶的中国仓鼠卵巢细胞用于转染。用脂转染法(Felgher等，出处同前)将5μg质粒C1与0.5μg质粒pSV-neo共转染。质粒pSV2-neo含有显性选择性标记neo基因，该基因来自Tn5，它编码一种酶，该酶可赋予对一组抗生素包括G418的抗性。将细胞接种在添加了1mg/ml G418的αminus MEM中。2天后，将细胞用胰蛋白酶消化并接种于杂交瘤克隆平板(Greiner,Germany)，然后培养10-14天。该期间后，将单个克隆用胰蛋白酶消化，然后接种于含不同浓度氨甲喋呤(25nM,50nM,100nM,200nM,400nM)的6孔培养皿中。将在最高浓度的氨甲喋呤中生长的克隆转移到含更高浓度氨甲喋呤(500nM,1μM,2μM,5μM)的新的6孔平板中。重复相同的过程，直到克隆在100μM的浓度中生长。
用Western印迹分析和SDS-PAGE分析所需基因产物的表达。实施例5重组KGF-2的体外转录和翻译PCR产物衍生于pA2载体中克隆的cDNA，该载体用于KGF-2的昆虫细胞表达。用于该PCR的引物是5’ATTAACCCTCACTAAAGGGAGGCCATGTGGAAATGGATACTGACACATTGTGCC3’(SEQID NO:11)和5’CCCAAGCTTCCACAAACGTTGCCTTCCTCTATGAG3’(SEQ ID NO:12)。
第一个引物含有ATG起始密码子5’侧的T3启动子的序列。第二个引物与KGF-2开放阅读框架的3’末端互补，并编码终止密码子的反向互补序列。
用市售的Qiagen试剂盒纯化所得PCR产物。将0.5μg的该DNA作为模板用于体外转录-翻译反应。用品名为TNT的Promega试剂盒完成该反应。利用放射性标记的甲硫氨酸为底物，按有关试剂盒的说明完成试验，不同的是，只按说明体积的1/2使用试剂，使反应在33℃进行1.5小时。
在10-15％变性聚丙烯酰胺凝胶上，电泳分离5μl反应物。将凝胶用比例为6∶3∶1的水∶甲醇∶乙酸混合物固定30分钟。然后在加热和真空下干燥凝胶，随后将凝胶对X射线胶片曝光16小时。该胶片显影结果表明存在与理论上翻译的KGF-2大小一致的放射性蛋白质带，这有力地说明克隆的KGF-2 cDNA含有编码具有预期大小之蛋白质的开放阅读框架。实施例6经基因治疗进行表达通过皮肤活组织解剖从一个受试者中得到成纤维细胞。将所得的组织放在组织培养基中并将其分成小片。将所述组织块放在组织培养瓶的湿表面，每个瓶中大约放10块。将瓶底部朝上，拧紧并在室温下放置过夜。在室温下24小时后，将培养瓶倒过来，组织块仍固定于烧瓶底部，加入新鲜培养基(例如Ham’s F12培养基，含10％FBS，青霉素和链霉素)。然后将其在37℃培养约1周。此时，加入新鲜培养基，然后每隔数天换液一次。再培养2周后，就出现成纤维细胞单层。将所述单层用胰蛋白酶消化并刮出放入较大的培养瓶中。
将两侧为莫洛尼鼠肉瘤病毒之长重复序列的pMV-7(Kirschmeier,P.T.等，DNA,7:219-25(1988))用EcoRⅠ和HindⅢ消化，随后用牛肠磷酸酶处理。将线性载体在琼脂糖凝胶上进行分离并用玻璃珠纯化。
用分别对应于5’和3’末端序列的PCR引物扩增编码本发明多肽的cDNA。5’引物含有EcoRⅠ位点，3’引物还含有HindⅢ位点。存在T4 DNA连接酶的条件下，将等量莫洛尼鼠肉瘤病毒线性骨架和该扩增的EcoRⅠ和HindⅢ片段加到一起。将所得混合物保持于可使所述两片段进行连接的条件下。用连接混合物转化细菌HB101，然后将转化的HB101铺在含卡那霉素的琼脂上，以确定载体含有正确插入的所需基因。
在含10％牛血清(CS)、青霉素和链霉素的Dulbecco Modified EaglesMedium(DMEM)中，使兼性pA317或GP+aml2包装细胞在组织培养基中生长至铺满密度。然后将含所述基因的MSV载体加到该培养基中，用所述载体转导所述包装细胞。现在，包装细胞会产生含所述基因的感染性病毒颗粒(此时将所述包装细胞称为生产者细胞)。
将新鲜培养基加到转导的生产者细胞中，然后从铺满生产者细胞的10cm平板中收集培养基。将含感染性病毒颗粒的已消耗的培养基通过millopore滤纸过滤以除去脱附的生产者细胞，然后用该培养基感染成纤维细胞。从成纤维细胞的次铺满平板中除去培养基，迅速地换入来自生产者细胞的培养基。除去该培养基，换入新鲜培养基。如果病毒效价高，将会感染所有成纤维细胞，而且无需进行筛选。如果效价很低，则需使用具有选择性标记如neo和his的逆转录病毒载体。
然后，将加工过的成纤维细胞单独或已在cytodex3微载体玻珠生长至铺满后，注射到宿主中。现得到的成纤维细胞生产蛋白质产物。实施例7KGF-2 mRNA表达的组织分布用Sambrook等所述的方法(上文所述)，完成Northern印迹分析以检测人组织中编码KGF-2蛋白质之基因的表达水平。通过PCR得到对应于本发明KGF-2完整开放阅读框架(SEQ ID NO:1)的探针，将所述探针用rediprimeTMDNA标记系统A(mersham Life Science)按照生产商的说明用32P标记。标记后，按照生产商方法号PT1200-1，用CHROMASPIN-100TM柱(Clontech Laboratories Inc.)纯化探针。然后用纯化过的标记探针检测各种人组织，分析编码KGF-2的基因的表达情况。
从Clontech得到多组织Northern(MTN)印迹，所述诸印迹含有来自各种人组织(H)的polyA RNA或人免疫系统组织(IM)的polyA RNA，按照生产商方法号PT1190-1，用ExpressHybTM杂交溶液(Clontech)通过标记的探针检测诸印迹。杂交并洗涤后，将印迹固定并在-70℃对胶片曝光过夜，按照标准方法对胶片显影。
在大部分人组织中，均可观察到一种约4.2kb的主要mRNA类型。该KGF-2 mRNA在心、胰、胎盘和卵巢中相对丰富。约5.2kb的少量mRNA类型也普遍存在。此5.2kb mRNA的“身分”不清楚。有可能5.2kb转录本编码KGF-2的另一种剪接形式或KGF家族的第三个成员。KGF-2 cDNA是4.1kb，与4.2kb mRNA的大小一致。实施例8角质细胞增殖试验真皮角质细胞是皮肤表皮中的细胞。皮肤中角质细胞的生长和扩展是伤口愈合中的一个重要过程。因此，角质细胞增殖试验是刺激角质细胞生长以及伤口愈合的蛋白质活性的一项重要指标。
但是，角质细胞很难在体外生长。仅有极少量的角质细胞系。这些细胞系有不同的细胞和遗传缺陷。为了避免因细胞缺陷如关键生长因子受体的丢失或生长依赖于关键生长因子而给该试验带来的复杂化，因而选择初级真皮角质细胞完成该试验。这些初级角质细胞是从Clonetics,Inc.(San Diego,CA)得到的。使用alamarBlue的角质细胞增殖试验alamarBlue是一种活性蓝色染料，当加到培养基中时，由线粒体代谢。然后该染料在组织培养上清液中变成红色。通过570nm与600nm之间的光密度读数差就可直接定量确定红色染料的量。该读数反应了细胞活性和细胞数量。
从Clonetics,Inc.购买正常的初级真皮角质细胞(CC-0255,NHEK-Neo群的)。这些细胞是第2代细胞。角质细胞在完全的角质细胞生长培养基(CC-3001,KGM；Clonetics,Inc.)中生长至达到80％铺满。按照生产商的说明，用胰蛋白酶消化细胞。简而言之，将细胞用Hank’s平衡的盐溶液洗涤两次。将2-3ml胰蛋白酶加至细胞中，在室温消化约3-5分钟。加入胰蛋白酶中和溶液并收集细胞。在室温将细胞以600×g离心5分钟，然后使用预热的培养基，以3000个细胞/cm2的密度将其铺在新培养瓶中。
为了进行增殖分析，除最外行外，以1000-2000个角质细胞/孔将细胞铺在Corning平底96孔平板的完全培养基中。向外侧孔中加入200μl无菌水。这样有助于使孔的温度湿度的波动达到最小。在37℃，在5％CO2中使细胞生长过夜。用角质细胞基础培养基(CC-3101,KBM,Clonetics,Inc.)将细胞洗涤两次，然后向各孔中加入100μl KBM。培养24小时。用KBM连续稀释生长因子并向各孔加入100μl。用KGM作为阳性对照，用KBM作为阴性对照。每个浓度点使用6个孔。培养2-3天。在培养结束时，用KBM将细胞洗涤一次，加入100μl在培养基中预先混有10％v/valamarBlue的KBM。培养6-16小时直到KGM阳性对照的培养基颜色开始变红。将平板直接放在平板读数仪下，测量O.D.570nm减去O.D.600nm的值。结果KGF-2对角质细胞增殖的刺激作用为了证实KGF-2(具有6x His标记的Cys 37-Ser 208(SEQ IDNO:29-30)；图5)和N-末端缺失突变体KGF-2Δ33和KGF-2Δ28对于刺激表皮角质细胞生长是有活性的，将正常的人初级表皮角质细胞与大肠杆菌中表达并纯化的KGF-2蛋白质(批号E3)，KGF-2Δ33(批号E1)和KGF-2Δ28(批号E2)一起保温。KGF-2蛋白刺激表皮角质细胞的生长，EC50为约5ng/ml，与FGF7/KGF-1的相同(图6A)。相比之下，其它FGF,如FGF-1和FGF-2不能刺激初级角质细胞的生长。KGF-2Δ33的EC50为0.2ng/ml,KGF-2Δ28的EC50为2ng/ml(见图6B和C)。因此，在刺激初级表皮角质细胞的增殖方面，KGF-2似乎与FGF7/KGF一样有效。但是，在刺激角质细胞增殖方面，KGF-2Δ33比上文所述的“Cys(37)”KGF-2和KGF-2Δ28更有效。
伤口组织的结疤涉及真皮成纤维细胞的过度增殖。为确定KGF-2的刺激作用是否对角质细胞而不是成纤维细胞特异，对小鼠Balb.c.3T3成纤维细胞和人肺成纤维细胞进行检测。在增殖试验中，这两种成纤维细胞对KGF-2都没有反应。因此，KGF-2看起来是表皮角质细胞特异性的促有丝分裂素，而不是间充质细胞如成纤维细胞的促有丝分裂素。这表明KGF-2引起伤口组织结疤的可能性很小。实施例9A．KGF-2对用特异性FGF受体转染之细胞的促有丝分裂作用为了确定哪种FGF受体同工型介导KGF-2的增殖作用，按照Santos-Ocampo等，生物化学杂志，271:1726-1731(1996))中所述的方法，检测KGF-2对表达特异性FGF受体同工型之细胞的影响。已知FGF7/KGF通过与FGFR2ⅲb形式结合并特异性地激活FGFR2ⅲb形式而诱导上皮细胞的有丝分裂(Miki等，科学，251:72-75(1991))。因此，用表达下列FGF受体同工型之一的细胞检测KGF-2在促有丝分裂试验中的增殖作用FGFR1ⅲb、FGFR2ⅲb、FGFR3ⅲb和FGFR4。表达FGF受体之细胞的促有丝分裂试验按Santos-Ocampo等，生物化学杂志，271:1726-1731(1996))中所述的方法，将胸苷掺入表达特异性FGF受体的BaF3细胞中。简而言之，洗涤表达特异性FGF受体的BaF3细胞并重悬在DMEM,10％新生牛血清，L-谷胺酰胺中。在96孔试验平板的培养基中，每孔铺约22500个细胞，所述培养基含有2μg/ml肝素。将检测试剂加到各孔中，使每孔的体积达到200μl。在37℃将细胞培养2天。向各孔中加入50μl体积中的1μCi3H-胸苷。4-5小时后，通过玻璃纤维滤纸过滤收集细胞。用Wallacβ平板闪烁计数器对掺入的3H-胸苷计数。结果如通过3H-胸苷掺入所说明的(图7A)，这些结果表明KGF-2蛋白质(添加了N末端Met的图1所示Thr(36)-Ser(208)(SEQ ID NO:2))可强烈刺激表达KGF受体FGFR2ⅲb同工型之Baf3细胞的增殖。令人感兴趣的是，KGF-2对表达FGFR1ⅲb同工型之Baf3细胞的增殖只有轻微的刺激作用。KGF-2对表达FGFR3ⅲb或FGFR4受体形式的细胞没有任何作用。
FGF7/KGF刺激表达KGF受体FGFR2ⅲb同工型之细胞的增殖，但不刺激表达FGFR1ⅲb同工型的细胞的增殖。KGF-2与FGF7/KGF之间的差异是非常有趣的。在对照试验中，aFGF刺激其受体FGFR1ⅲb和ⅲc，而bFGF刺激其受体FGFR2ⅲc。因此，这些结果表明KGF-2与FGFR2ⅲb同工型结合并刺激有丝分裂。与FGF7/KGF相比，KGF-2也与FGFR1ⅲb同工型结合并刺激有丝分裂。B．KGF-2Δ33对用特异性FGF受体转染之细胞的促有丝分裂作用如上所证实，FGF或KGF-1和-2均与FGF2ⅲb受体(FGFR2 ⅲb)结合并将其激活。用表达下列FGF受体同工型之一的细胞检测KGF-2Δ33在有丝分裂试验中的增殖作用FGFR2ⅲb或FGFR2ⅲc(2ⅲc受体转染的细胞作为阴性对照)。
按照本实施例上述部分A完成试验。简而言之，在RPMI中培养BaF3细胞，该RPMI含有10％牛血清(BCS-不是胎牛血清)，10％来自WEHI3细胞(在含5％BCS的RPMI中生长)培养物的条件培养基，50nMβ-巯基乙醇，L-Glu(100X储备液的2％)和青霉素/链霉素(100X储备液的1％)。
为了进行试验，用含10％BCS和1μg/ml肝素的RPMI培养基将BaF3细胞润洗两次。将BaF3细胞(22000个细胞/孔)铺在96孔平板的150μlRPMI培养基中，该RPMI培养基含有10％BCS和1μg/ml肝素。以从约0至10nM的浓度，加入酸性FGF、碱性FGF、KGF-1(HG15400)或KGF-2蛋白质(HG03400,03401,03410或03411)。在37℃，将细胞在200μl的终体积中培养48小时。所有试验均以一式三份完成。将氚标记的胸苷(0.5μCi)加至各孔中，并在37℃保温4小时，然后通过玻璃纤维滤纸过滤收集细胞。用液体闪烁计数确定掺入的放射性总量。使用下列阳性对照对于FGFR2ⅲc细胞使用碱性FGF和酸性FGF；对于FGFR2ⅲb细胞使用酸性FGF和KGF-1。使用下列阴性对照基础培养基(含有10％BCS和1μg/ml肝素的RPMI)。结果如用3H-胸苷掺入所说明的(图7A-C)，这些结果表明KGF-2(N末端加有Met的Thr(36)-Ser(208)),KGF-2Δ33和KGF-2Δ28蛋白质可强烈刺激表达KGF-2受体FGFR2ⅲb同工型的BaF3细胞的增殖。KGF-2蛋白质对表达该受体的FGFR2ⅲc形式的细胞没有任何作用。这些结果表明KGF-2蛋白质与FGFR2ⅲb同工型结合并刺激有丝分裂。另外，似乎KGF-2Δ33也能够比KGF-2(Thr(36)-Ser(208))更好地刺激BaF3细胞的增殖。实施例10A．构建大肠杆菌优化的全长KGF-2为了提高全长KGF-2在大肠杆菌表达系统中的表达水平，将该基因的氨基末端部分的密码子优化成最常用的大肠杆菌密码子。为了合成最佳的KGF-2区，合成6种寡核苷酸1-6号(序列如下所示)。在下列条件下，将这些重叠寡核苷酸用于7轮PCR反应变性95℃20秒退火58℃20秒延伸72℃60秒用与上述相同的条件，用第一个PCR反应物1μl,KGF-2的合成引物6作为3’引物，KGF-2合成的5’BamHⅠ作为5’引物，经25个循环完成第二个PCR反应。将由最终反应产生的产物用AVaⅡ和BamHⅠ消化。将实施例1的KGF-2构建体用AvaⅡ和HindⅢ消化，并分离片段。将这两个片段在一个三片段连接中克隆至已用BamHⅠ和HindⅢ消化的pQE-9中。
用于构建优化的合成KGF-2 1/208的引物如下KGF-2的合成引物1:ATGTGGAAATGGATACTGACCCACTGCGCTTCTGCTTTCCCGCACCTGCCGGGTTGCTGCTGCTGCTGCTTCCTGCTGCTGTTC(SEQ ID NO:31)KGF-2的合成引物2CCGGAGAAACCATGTCCTGACCCAGAGCCTGGCAGGTAACCGGAACAGAAGAAACCAGGAACAGCAGCAGGAAGCAGCAGCA(SEQID NO:32)KGF-2的合成引物3:GGGTCAGGACATGGTTTCTCCGGAAGCTACCAACTCTTCTTCTTCTTCTTTCTCTTCTCCGTCTTCTGCTGGTCGTCACG(SEQ ID NO:33)KGF-2的合成引物4GGTGAAAGAGAACAGTTTACGCCAACGAACGTCACCCTGCAGGTGGTTGTAAGAACGAACGTGACGACCAGCAGAAGACGG(SEQ IDNO:34)KGF-2的合成引物5:CGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAA(SEQ ID NO:35)KGF-2的合成引物6:TTTGGTCCCAGAAACTTTACCGTTTTTTTCGATTTTCAG(SEQ IDNO:36)KGF-2的合成5’BamHⅠ:AAAGGATCCATGTGGAAATGGATACTGACCCACTGC(SEQ ID NO:37)在图10中列出了所得的克隆(SEQ ID NO:38和39)。B．构建大肠杆菌优化的成熟KGF-2为了进一步提高KGF-2成熟形式在大肠杆菌表达系统中的表达水平，将该基因氨基末端部分的密码子优化成最常用的大肠杆菌密码子。与KGF-2的成熟形式相对应，构建从苏氨酸36开始的KGF-2的截短形式。将实施例10A的大肠杆菌合成KGF-2作为PCR反应的模板，所述PCR反应用BspHⅠ5’KGF-2作为5’引物(下文给出的序列)，用HindⅢ3’KGF-2作为3’引物(下文给出序列)。用在实施例10A中的标准条件进行25个循环完成扩增。将所得产物用BspHⅠ和HindⅢ消化，然后克隆至已用NcoⅠ和HindⅢ消化的大肠杆菌表达载体pQE60中。BspHⅠ5’KGF-2引物TTTCATGACTTGTCAAGCTCTGGGTCAAGATATGGTTC(SEQ ID NO:40)HindⅢ3’KGF-2引物GCCCAAGCTTCCACAAACGTTGCCTTCC(SEQ ID NO:41)在图11A中列出了所得的克隆(SEQ ID NO:42和43)。C．构建另一大肠杆菌优化的成熟KGF-2
为了进一步提高KGF-2成熟形式在大肠杆菌表达系统中的表达水平，将所述大肠杆菌优化基因之氨基末端部分53个氨基酸的密码子变成其它常用的大肠杆菌密码子。为了合成优化的KGF-2区，合成6个寡核苷酸编号为18062,18061,18058,18064,18059和18063(下文给出序列)。在下列条件下，将这些重叠寡核苷酸用于7轮PCR反应变性95℃20秒退火58℃20秒延伸72℃60秒完成7轮合成后，将该区的5’引物18169和该整个区的3’引物18060加到PCR反应中，所述PCR反应含1μl来自所述6个寡核苷酸的初始反应物。用下列条件，将该产物扩增30轮变性95℃20秒退火55℃20秒延伸72℃60秒在与上述相同的条件下，用引物18066和18065开始第二个PCR反应以扩增该基因的3’区25轮。在琼脂糖凝胶上分离所得的产物。将含该产物的凝胶块用10mM Tris,1mM EDTA,pH7.5稀释。利用每一稀释过的凝胶块各1μl再进行另一个PCR反应，其中使用引物18169作为5’引物，引物18065作为3’引物。用与上述相同的条件将产物扩增25轮。将最后这次反应产生的产物用EcoRⅠ和HindⅢ限制性切割，然后克隆至也用EcoRⅠ和HindⅢ切割的pQE60中(现在为pQE6)。5’合成引物的序列18169 KGF2 5＇EcoRⅠ/RBS:TCAGTGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAATCATGACTTGCCAGG[SEQ ID NO:44]18062 KGF2合成的新R1有义引物TCATGACTTGCCAGGCACTGGGTCAAGACATGGTTTCCCCGGAAGCTA[SEQ ID NO:45]18061 KGF2合成的R2有义引物GCTTCAGCAGCCCATCTAGCGCAGGTCGTCACGTTCGCTCTTACAACC[SEQ ID NO:46]18058 KGF2合成的R3有义引物GTTCGTTGGCGCAAACTGTTCAGCTTTACCAAGTACTTCCTGAAAATC[SEQ ID NO:47]18066 KGF2 20bp AvaⅡ有义引物TCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGAC[SEQ ID NO:48]18064 KGF2合成的F1反义引物GATGGGCTGCTGAAGCTAGAGCTGGAGCTGTTGGTAGCTTCCGGGGAA[SEQ ID NO:49]18059 KGF2合成的F2反义引物AACAGTTTGCGCCAACGAACATCACCCTGTAAGTGGTTGTAAGAG[SEQ ID NO:50]18063 KGF2合成的F3反义引物TTCTTGGTCCCAGAAACTTTACCGTTTTTTTCGATTTTCAGGAAGTA[SEQ ID NO:51]18060 KGF2 AvaⅡ反义引物TTCTTGGTCCCAGAAACTTTACCG[SEQ ID NO:52]18065 KGF2 HindⅢ 3’终止引物AGATCAGGCTTCTATTATTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAG[SEQ ID NO:53]在图11B中列出了合成的KGF-2基因序列和其相应的氨基酸序列(SEQ ID NO:54和55)。
实施例11构建KGF-2缺失突变体用实施例10A的优化KGF-2构建体为模板，从KGF-2基因的5’末端和3’末端构建缺失突变体。以可能对大肠杆菌中表达产生不利影响的基因区为基础，选择缺失。对应5’缺失，用下文所列的引物作为5’引物。这些引物含有标明的限制位点和编码起始甲硫氨酸的ATG。将KGF-2(FGF-12)208氨基酸3’HindⅢ引物用作3’引物。用与实施例10所列相同的标准条件完成25轮的PCR扩增。用BspHⅠ限制性切割KGF-236aa/208aa缺失突变体产物的5’位点，用HindⅢ限制性切割3’位点，然后克隆至已用BspHⅠ和HindⅢ消化过的pQE60中。用NcoⅠ作为5’限制酶，用HindⅢ作为3’位点限制酶，对所有其它产物进行限制性切割，然后克隆至已用NcoⅠ和HindⅢ消化过的pQE60中。对于KGF-2(FGF-12)36aa/153aa，用128aa 3’HindⅢ作为3’引物，用FGF-1236aa/208aa作为5’引物。对于FGF-12 62aa/153aa，用128aa 3’HindⅢ作为3’引物，用FGF-12 62aa/208aa作为5’引物。所得克隆的名称显示因所述缺失而产生之多肽的第一个和最后一个氨基酸。例如，KGF-236aa/153aa表示该缺失突变体的第一个氨基酸是KGF-2的氨基酸36，最后一个氨基酸是KGF-2的氨基酸153。另外，如在图12-20中所说明的，每个突变体均加有N-末端Met。缺失引物的序列如下FGF12 36aa/208aa:5＇BsphⅠGGACCCTCATGACCTGCCAGGCTCTGGGTCAGGAC [SEQ IDNO:56]FGF1263aa/208aa:5＇NcoⅠGGACAGCCATGGCTGGTCGTCACGTTCG[SEQ ID NO:57]FGF1277aa/208aa:5＇NcoⅠGGACAGCCATGGTTCGTTGGCGTAAACTG[SEQ ID NO:58]FGF12 93aa/208aa:5＇NcoⅠGGACAGCCATGGAAAAAAACGGTAAAGTTTC[SEQ ID NO:59]FGF12 104aa/208aa:5＇NcoⅠGGACCCCCATGGAGAACTGCCCGTAGAGC[SEQ ID NO:60]FGF12 123aa/208aa:5＇NcoⅠGGACCCCCATGGTCAAAGCCATTAACAGCAAC[SEQ ID NO:61]FGF12 138aa/208aa:5＇NcoⅠGGACCCCCATGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAG[SEQ IDNO:62]FGF123＇HindⅢ:(用于上述所有的缺失克隆)CTGCCCAAGCTFATTATGAGTGTACCACCATTGGAAG[SEQ ID NO:63]FGF12 36aa/153aa:5＇BsphⅠ(如上述)3＇HindⅢCTGCCCAAGCTTATTACTTCAGCTTACAGTCATTGT[SEQ IDNO:64]FGF12 63aa/153aa:5’NcoⅠ和3’HindⅢ，如上述。
在图12-20中列出了所得缺失突变体的序列。(SEQ ID NO:65-82)实施例12构建KGF-2的半胱氨酸突变体为了构建C-37突变，用引物54575’BsphⅠ和5258 173aa 3’HindⅢ扩增来自实施例10A的KGF-2(FGF-12)模板。引物54575’BsphⅠ将半胱氨酸37变成丝氨酸。用实施例10A的标准条件进行25轮完成扩增。将所得产物用BsphⅠ和HindⅢ限制性切割，然后克隆至已用BsphⅠ和indⅢ消化的大肠杆菌表达载体pQE60中。(图21)(SEQ ID NO:83)为了将半胱氨酸106突变为丝氨酸，进行两个PCR反应以便进行该半胱氨酸的寡核苷酸定点诱变。在一个反应中，用5453 BsphⅠ作为该反应的5’引物，用5455作为该反应的3’引物。在第二个反应中，用5456作为5’引物，用5258 HindⅢ作为3’引物。在实施例10所列的标准条件下，将反应扩增25轮。在用5453 BsphⅠ作为5’引物、用5258 HindⅢ作为3’引物的随后反应中，用1μl各PCR反应的产物作为模板。用实施例10所列的标准条件完成25轮的扩增。将所得产物用BspHⅠ和HindⅢ消化，然后克隆至已用NcoⅠ和HindⅢ消化的大肠杆菌表达载体pQE60中。
需要进行两个PCR反应来产生C-37/C-106突变体。用引物5457BsphⅠ和5455来产生含半胱氨酸37被丝氨酸所取代的突变体的5’区，用引物5456和5258 HindⅢ来产生含半胱氨酸106被丝氨酸所取代的突变体的3’区。在第二个反应中，用从每个前期反应得到的各1μl产物一起作为模板，利用5457 BsphⅠ引物作为5’引物，用5258 HindⅢ引物作为3’引物来产生C-37/C-106突变体。将该PCR产物用BsphⅠ和HindⅢ限制性消化，然后克隆至已用NcoⅠ和HindⅢ消化的pQE60中。所得克隆列于图22(SEQ ID NO:84)。半胱氨酸突变引物的序列5457BspHⅠ:GGACCCTCATGACCTCTCAGGCTCTGGGT(SEQ ID NO:85)5456:AAGGAGAACTCTCCGTACAGC(SEQ ID NO:86)5455:GCTGTACGGTCTGTTCTCCTT(SEQ ID NO:87)5453BspHⅠ: GGACCCTCATGACCTGCCAGGCTCTGGGTCAGGAC(SEQID NO:88)5258HindⅢ: CTGCCCAAGCTTATTATGAGTGTACCACCATTGGAAG(SEO ID NO:89)实施例13KGF-2(FGF-12)的生产和纯化将编码实施例10B中所述的优化成熟蛋白质(即KGF-2的氨基酸T36至S208)的DNA序列克隆至质粒pQE-9(Qiagen)中。在37℃，含100μg/ml氨苄青霉素和25μg/ml卡那霉素的LB中，让大肠杆菌(M15/rep4；Qiagen)过夜生长至稳定期。以1∶50的稀释度，用该培养物接种含100μg/ml氨苄青霉素和25μg/ml卡那霉素的新鲜LB培养基。使细胞在37℃生长至O.D.595为0.7，通过加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至1mM的终浓度进行诱导。3-4小时后，离心收集细胞，然后以5体积缓冲液1体积细胞糊的比例，将细胞重悬于含60mM NaPO4和360mM NaCl的缓冲液中。在Mautin Gaulin中破碎细胞后，通过加入NaOH将提取物的pH调至8.0，然后离心澄清。
将澄清的可溶性提取物上样于Poros HS-50柱(2.0×10.0cm；PerSeptive Biosystems,Inc.)，然后用含0.5M,1.0M和1.5M NaCl的50mMNaPO4pH8.0分步洗脱已结合的蛋白质。然后用50mM NaPO4pH6.5将在1.5M的盐级分中洗脱下来的KGF-2稀释5倍，达到300mM的最终盐浓度。使含KGF-2的该级分依次通过Poros HQ-20柱(2.0×7.0cm；PerSeptive Biosystems，Inc.)，然后结合于Poros CM-20柱(2.0×9.0cm；PerSeptive Biosystems,Inc.)中。收集在约500mM-约750mM NaCl下洗脱出来的含KGF-2(FGF-12)的诸级分，稀释，再重上样于CM-20柱以便进行浓缩。最后，在凝胶过滤柱(S-75；Pharmacia)上于40mM NaOAcpH6.5,150mM NaCl中分离该蛋白质(E-5批)。或者，在磷酸缓冲盐溶液(PBS,E-4批)上跑凝胶过滤柱。收集含KGF-2的级分并用Bio-Rad蛋白质测定确定蛋白质的浓度。经SDS-PAGE判断蛋白质的纯度＞90％。最后，用Limulus AmebocyteLysate检测(Cape Cod Associates)确定的内毒素水平≤1Eu/mg。经这种方式制备的蛋白质能够与肝素结合，这是FGF家族成员的一个标志。
实施例14A．构建N-末端缺失突变体KGF-2Δ33为了提高KGF2在大肠杆菌中的表达水平，并提高大肠杆菌表达的KGF2的溶解性和稳定性，制备从加工前的KGF2中除去了前68个氨基酸的缺失变体KGF-2Δ33(KGF-2 aa 69-208)。产生该缺失变体的原理是基于下列观察结果。首先，成熟KGF2(KGF-2 aa 36-208)含奇数个(3个)半胱氨酸残基，这可因分子内二硫键形成而发生聚集。KGF Δ33缺失变体仅含有2个半胱氨酸残基，这样降低了分子内二硫键形成以及随后发生聚集的可能性。聚集的减少可导致活性KGF2蛋白质产率提高。第二，KGF Δ33缺失变体除去了多丝氨酸区，所述多丝氨酸区在KGF-1中不存在，而且似乎对活性并不重要，但可能会阻碍所述蛋白质在大肠杆菌中的表达。因此，除去多丝氨酸区可提高活性KGF-2蛋白质的表达水平。第三，KGFΔ33在大肠杆菌中的表达会引起KGF-2在残基68和69之间的自然裂解。因此，预期KGF2Δ33可以被有效地加工并在大肠杆菌中是稳定的。
在pQE6中构建KGF2Δ33为了进行聚合酶链反应指导的扩增并将KGF2Δ33亚克隆至大肠杆菌表达载体pQE6中，合成与所需KGF2区互补的两个寡核苷酸引物(5952和19138)，它们的序列如下引物5952:5＇GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG 3＇(SEQID NO:91)引物19138:5＇GGGCCCAAGCTTATGAGTGTACCACCAT 3＇(SEQ IDNO:92)在N-末端引物(5952)的情况下，插入一个AflⅢ限制位点，而在C-末端引物(19138)的情况下，插入一个HindⅢ限制位点。引物5952还含有一个与KGF2编码区邻接并符合读框的ATG序列以便在大肠杆菌中翻译克隆的片段，而引物19138含有与KGF2编码区邻接并符合读框的2个终止密码子(在大肠杆菌中优先使用的)，这样可确保在大肠杆菌中正确地进行翻译终止。
用本领域技术人员熟知的标准条件，将成熟KGF-2(aa 36-208)的核苷酸序列(在实施例10C中构建的)为模板，完成聚合酶链反应。将所得的扩增子用AflⅢ和HindⅢ限制性消化并亚克隆至经NcoⅠ/HindⅢ消化的pQE6蛋白质表达载体中。
在pHE1中构建KGF2Δ33为了进行聚合酶链反应指导的扩增并将KGF2Δ33亚克隆至大肠杆菌表达载体pHE1中，合成对应于所需KGF2区的两个寡核苷酸引物(6153和6150)，它们的序列如下引物61 53:5＇CCGGCGGATCCCATATGTCTTACAACCACCTGCAGG3＇(SEQ ID NO:93)引物6150:5＇CCGGCGGTACCTTATTATGAGTGTACCACCATTGG 3＇(SEQ ID NO:94)
在N-末端引物(6153)的情况下，插入一个NdeⅠ限制位点，而在C-末端引物(6150)的情况下，插入一个Asp718限制位点。引物6153还含有一个与KGF2编码区邻接并符合读框的ATG序列以便在大肠杆菌中翻译克隆的片段，而引物6150含有与KGF2编码区邻接并符合读框的2个终止密码子(在大肠杆菌中优先使用的)，这样可确保在大肠杆菌中正确地进行翻译终止。
用本领域技术人员熟知的标准条件，将成熟KGF-2(aa 36-208)的核苷酸序列(在实施例10C中构建的)为模板，完成聚合酶链反应。将所得的扩增子用NdeⅠ和Asp718限制性消化并亚克隆至经NdeⅠ/Asp718消化的pHE1蛋白质表达载体中。KGF2Δ33的核苷酸序列ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGAA GGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAAAAGGAGCTCCAAGGAGAGGACAGAAAACACGAAGGAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAA (SEQ ID NO:95)KGF2Δ33的氨基酸序列MSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPRRGQKTRRKNTSAHFLPMVVHS (SEQ ID NO:96)B．构建优化的KGF-2Δ33为了提高KGF2Δ33在大肠杆菌中的表达水平，将完整基因的密码子进行优化以便与大肠杆菌中最常使用的密码子相匹配。由于用于产生KGF2Δ33的模板在N末端区内已进行了密码子优化，因此，需要将C末端氨基酸(84-208)优化。
首先，将氨基酸172-208进行密码子优化以产生KGF2Δ33(s172-208)。通过重叠PCR策略可达到此目的。将寡核苷酸PM07和PM08(对应于氨基酸172-208)合并在一起，并通过将它们加热至70℃然后冷却至37℃而一起退火。然后将已退火的寡核苷酸用作标准PCR反应的模板，所述标准PCR反应由引物PM09和PM10指导。在按照本领域技术人员熟知的标准条件并用KGF2Δ33为模板进行的另一个PCR反应中，用寡核苷酸PM05(它与KGF2编码区内的Pst1位点重叠)和PM11扩增对应于氨基酸84-172的KGF2区。在第三个PCR反应中，将第一个PCR反应的产物(对应于已优化密码子的氨基酸172-208)和第二个PCR反应的产物(对应于密码子未被优化的氨基酸84-172)合并并作为寡核苷酸PM05和PM10指导的标准PCR反应的模板。将所得扩增子用Pst1/HindⅢ消化，并亚克隆至Pst1/HindⅢ消化的pQE6KGF2Δ33中，有效地取代对应的密码子未被优化的区，从而产生pQE6KGF2Δ33(s172-208)。
为了完成KGF2的密码子优化，用重叠寡核苷酸产生对应于KGF2氨基酸84-172区的已优化密码子的合成基因。首先，将四个寡核苷酸(PM31、PM32、PM33和PM34)合并并完成7个循环的PCR:94℃,30秒；46.5℃,30秒；和72℃,30秒。
按照标准方法，用1μl第一个PCR反应产物为模板，完成由引物PM35和PM36指导的第二个PCR反应。将所得的已优化密码子的基因片段用PstⅠ/SalⅠ消化并亚克隆至PstⅠ/SalⅠ消化的pQE6KGF2Δ33(s172-208)中以产生一个已完全优化的KGF2编码基因，pQE6KGF2Δ33s。
为了构建另一种大肠杆菌蛋白质表达载体，利用pQE6KGF2Δ33s上的引物PM102和PM130对KGF2Δ33s进行PCR扩增。所得的扩增子用NdeⅠ和EcoRⅤ消化，并亚克隆至已用NdeⅠ和Asp718消化的pHE1表达载体(钝末端形式)中，从而形成pHE1Δ33s。
在构建密码子优化的KGF2Δ3s中所用的寡核苷酸序列PM05:CAACCACCTGCAGGGTGACG (SEQ ID NO:97)PM07:AACGGTCGACAAATGTATGTGGCACTGAACGGTAAAGGTGCTCCACGTCGTGGTCAGAAAACCCGTCGTAAAAACACC(SEQ IDNO:98)PM08:GGGCCCAAGCTTAAGAGTGTACCACCATTGGCAGAAAGTGAGCAGAGGTGTTTTTACGACGGGTTTTCTGACCACG(SEQ ID NO:99)PM09:GCCACATACATTTGTCGACCGTT(SEQ ID NO:100)PM10:GGGCCCAAGCTTAAGAGTG(SEQ ID NO:101)PM11:GCCACATACATTTGTCGACCGTT(SEQ ID NO:102)PM31:CTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCCTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGTACCAAG(SEQ ID NO:103)PM32:AGCTTTAACAGCAACAACACCGATTTCAACGGAGGTGATTTCCAGGATGGAGTACGGGCAGTTTTCTTTCTTGGTACCAGAAACTTTACC (SEQ ID NO:104)PM33:GGTGTTGTTGCTGTTAAAGCTATCAACTCCAACTACTACCTGGCTATGAACAAGAAAGGTAAACTGTACG GTTCCAAAGAATTTAACAAC (SEQ ID NO:105)PM34:GTCGACCGTTGTGCTGCCAGTTGAAGGAAGCGTAGGTGTTGTAACCGTTTTCTTCGATACGTTCTTTCAGTTTACAGTCGTTGTTAAATTCTTTGGAACC(SEQ ID NO:106)PM35:GCGGCGTCGACCGTTGTGCTGCCAG(SEQ ID NO:107)PM36:GCGGCCTGCAGGGTGACGTTCGTTGG(SEQ ID NO:108)PM102:CCGGCGGATCCCATATGTCTTACA ACCACCTGCAGG(SEQ IDNO:109)PM130:CGCGCGATATCTTATTAAGAGTGTACCACCATTG(SEQ ID NO:110)KGF2Δ33(s172-208)的核苷酸序列ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCCTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGTACCAAGAAAGAAAACTGCCCGTACTCCATCCTGGAAATCACCTCCGTTGAAATCGGTGTTGTTGCTGTTAAAGCTATCAACTCCAACTACTACCTGGCTATGAACAAGAAAGGTAAACTGTACGGTTCCAAAGAATTTAACAACGACTGTAAACTGAAAGAACGTATCGAAGAAAACGGTTACAACACCTACGCTTCCTTCAACTGGCAGCACAACGGTCGACAAATGTATGTGGCACTGAACGGTAAAGGTGCTCCACGTCGTGGTCAGAAAACCCGTCGTAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTGCCAATGGTGGTACACTCTTAA(SEQ ID NO:111)KGF2Δ33(s172-208)的氨基酸序列MSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPRRGQKTRRKNTSAHFLPMVVHS(SEQ ID NO:112)C．构建N末端缺失突变体KGF-2Δ4为了提高KGF2在大肠杆菌中的表达水平，并提高大肠杆菌表达的KGF2的溶解性和稳定性，构建从加工前KGF2中除去了前38个氨基酸(包括37位的半胱氨酸)的一种缺失变体KGF-2Δ4(氨基酸39-208)。由于所得KGF2缺失分子含偶数个半胱氨酸残基，因分子内二硫键形成所引起的聚集问题就可以减少，从而提高了活性蛋白质的表达水平。
为了进行聚合酶链反应指导的扩增并将KGF2Δ4亚克隆至大肠杆菌蛋白质表达载体pQE6中，合成两个寡核苷酸引物(PM61和19138)，它们的碱基序列如下PM61:CGCGGCCATGGCTCTGGGTCAGGACATG(SEQ ID NO:113)19138:GGGCCCAAGCTTATGAGTGTACCACCAT(SEQ ID NO:114)
在N-末端引物(PM61)的情况下，插入一个NcoⅠ限制位点，而在C-末端引物(19138)的情况下，插入一个HindⅢ限制位点。PM61还含有一个与KGF2编码区邻接且读框一致的ATG序列以便在大肠杆菌中翻译已克隆的片段，而19138含有与KGF2编码区邻接且读框一致的1个终止密码子(在大肠杆菌中优先使用的)，这样可确保在大肠杆菌中正确地发生翻译终止。
用本领域技术人员熟知的标准条件，以全长KGF2(aa 36-208)(在实施例10C中构建的)为模板，完成聚合酶链反应。将所得的扩增子用NcoⅠ和HindⅢ限制性消化并亚克隆至已用NcoⅠ/HindⅢ消化过的pQE6蛋白质表达载体中。KGF2Δ4的核苷酸序列ATGGCTCTGGGTCAAGATATGGTTTCTCCGGAAGCTACCAACTCTTCCTCTTCCTCTTTCTCTTCCCCGTCTTCCGCTGGTCGTCACGTTCGTTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGAAGGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAAAAGGAGCTCCAAGGAGAGGACAGAAAACACGAAGGAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAA(SEQ ID NO:115)KGF2Δ4的氨基酸序列MALGQDMVSPEATNSSSSSFSSPSSAGRHVRSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPRRGQKTRRKNTSAHFLPMVVHS(SEQ ID NO:116)
实施例15构建KGF-2羧基末端突变KGF-2的羧基末端带有大量电荷。这些带电荷残基的密度有可能会影响该蛋白质的稳定性，从而影响溶解性。为了产生在溶液中稳定的突变蛋白，在所述基因的所述区域产生一系列突变。
为了产生点突变体194R/E、194R/Q、191K/E、191K/Q,188R/E、188R/Q，用本领域技术人员熟知的标准条件，在PCR反应中用KGF2Δ33为模板，用5952 KGF2Δ33 5’AflⅢ5’引物和标明的3’引物(所述引物含有KGF-2的适宜点突变)。将所得产物用AflⅢ和HindⅢ消化，然后克隆至已用NcoⅠ和HindⅢ消化的大肠杆菌表达载体pQE60中。KGF2Δ33,194R/E的构建使用下列引物5952KGFΔ335’AflⅢ5952KGFΔ335＇AflⅢ:5＇GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG3＇(SEQ ID NO:117)KGF23＇HindⅢ194aaR至E:5＇CTGCCCAAGCTTTTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAGTGAGCAGAGGTGTTTTTTTCTCGTGTTTTCTGTCC3＇(SEQ ID NO:118)KGF2Δ33,194R/E的核苷酸序列ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGAAGGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAAAAGGAGCTCCAAGGAGAGGACAGAAAACACGAGAAAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAG (SEQ ID NO:119)KGF2Δ33,194R/E的氨基酸序列MSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPRRGQKTREKNTSAHFLPMVVHS(SEQ ID NO:120)KGF2Δ33,194R/Q的构建使用下列引物5952KGFΔ335＇ AflⅢ:5＇GCGGCACATGTCTTACA ACCACCTGCAGGGTG 3＇(SEQ ID NO:121)KGF23＇HindⅢ194 aa R至Q:5＇CTGCCCAAGCTTTTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAGTGAGCAGAGGTGTTTTTCTGTCGTGTTTTCTGTCC3＇(SEQ ID NO:122)KGF2Δ33,194R/Q的核苷酸序列ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGAAGGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAAAAGGAGCTCCAAGGAGAGGACAGAAAACACGACAGAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAG(SEQ ID NO:123)KGF2Δ33,194R/Q的氨基酸序列MSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGS KEFNND CKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPRRGQKTROKNTSAHFLPMVVHS(SEQ ID NO:124)KGF2Δ33,191K/E构建使用下列引物5952KGFΔ335＇AflⅢ:5＇GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG3＇(SEQ ID NO:125)KGF23＇HindⅢ191aaK至E5＇CTGCCCAAGCTFTTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAGTGAGCAGAGGTGTTTTTCCTTCGTGTTTCCTGTCCTCTCCTTGG3＇(SEQ IDNO:126)KGF-2Δ33,191K/E核苷酸序列ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGAAGGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAAAAGGAGCTCCAAGGAGAGGACAGGAAACACGAAGGAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAG(SEQ ID NO:127)KGF-2Δ33,191K/E氨基酸序列MSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPRRGQETRRKNTSAHFLPMVVHS(SEQ ID NO:128)KGF2Δ33,191K/Q的构建使用下列引物5952KGFΔ335＇AflⅢ:5＇GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG3＇(SEQ ID NO:129)KGF23＇HindⅢ191aa K至Q5＇CTGCCCAAGCTTTTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAGTGAGCAGAGGTGTTTTTCCTTCGTGTCTGCTGTCCTCTCCTTGG 3＇(SEQ IDNO:130)KGF-2Δ33,191K/Q的核苷酸序列ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGAAGGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAAAAGGAGCTCCAAGGAGAGGACAGCAGACACGAAGGAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAG(SEQ ID NO:131)KGF2Δ33,191K/Q的氨基酸序列MSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPRRGQOTRRKNTSAHFLPMVVHS(SEQ ID NO:132)KGF2Δ33,188R/E的构建使用下列引物5952KGFΔ335＇AflⅢ:5＇GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG3＇(SEQ ID NO:133)KGF23 HindⅢ188aa R至E:5＇CTGCCCAAGCTTTTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAGTGAGCAGAGGTGTTTTTCCTTCGTGTTTTCTGTCCTTCCCTTGGAGCTCCTTT3＇(SEQ ID NO:134)KGF-2Δ33,188R/E的核苷酰序列ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGAAGGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAAAAGGAGCTCCAAGGGAAGGACAGAAAACACGAAGGAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAG(SEQ ID NO:135)KGF-2Δ33,188R/E的氨基酸序列MYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPREGQKTRRKNTSAHFLPMVVHS(SEQ ID NO:136)KGF2Δ33,188R/Q的构建使用下列引物5952KGFΔ335＇AflⅢ:5＇GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG3＇(SEQ ID NO:137)KGF23＇HindⅢ188aa R至Q:5＇CTGCCCAAGCTTTTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAGTGAGCAGAGGTGTTTTTCCTTCGTGTTTTCTGTCCCTGCCTTGGAGCTCCTTT3＇(SEQ ID NO:138)KGF-2Δ33,188R/Q的核苷酸序列ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGAAGGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAAAAGGAGCTCCAAGGCAGGGACAGAAAACACGAAGGAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAG(SEQ ID NO:139)KGF2Δ33,188R/Q的氨基酸序列MSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPRQGQKTRRKNTSAHFLPMVVHS(SEQ ID NO:140)KGF2Δ33,183K/E的构建为完成突变183K/E，进行两个PCR反应以便对该赖氨酸进行寡核苷酸定点诱变。在一个反应中，用5952KGFΔ335’AflⅢ为5’引物，用KGF2183aa K至E反义序列作为该反应的3’引物。在第二个反应中，用KGF25’183aa K至E有义序列作为该反应的5’引物，用KGF23’HindⅢTAA终止序列作为3’引物。用KGF2Δ33作为这些反应的模板。在本领域技术人员熟知的标准条件下扩增所述反应。在随后的反应中，用来自这些PCR反应的产物各1μl作为模板，5’引物为5453 BsphⅠ,3’引物为5258 HindⅢ。在本领域技术人员熟知的标准条件下进行扩增。将所得产物用AflⅢ和HindⅢ消化，然后克隆至已用NcoⅠ和HindⅢ消化的大肠杆菌表达载体pQE60中。使用下列引物5952KGFΔ33 5’AflⅢ:5＇GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG 3＇(SEQ ID NO:141)KGF2 5’183aa K至E有义序列5＇TTGAATGGAGAAGGAGCTCCA3＇(SEQ ID NO:142)KGF2183aa K至E反义序列5＇TGGAGCTCCTTCTCCATTCAA3 ＇(SEQ ID NO:143)KGF23’HindⅢTAA终止序列5＇CTGCCCAAGCTTTTATGAGTGTACCACCATTGG3＇(SEQ ID NO:144)KGF2Δ33,183K/E的核苷酸序列ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGAAG GGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGAAGGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAGAAGGAGCTCCAAGGAGAGGACAGAAAACACGAAGGAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAG(SEQ ID NO:145)KGF2Δ33,183K/E的氨基酸序列MSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGEGAPRRGQKTRRKNTSAHFLPMVVHS(SEQ ID NO:146)实施例16KGF-2Δ33对正常膀胱和前列腺及环磷酰胺诱发的大鼠出血性膀胱炎的影响本实施例证明KGF-2Δ33能够刺激正常大鼠膀胱增殖，并且KGF-2Δ33在环磷酰胺诱导的出血性膀胱炎大鼠模型中有治疗作用。
临床上使用的某些细胞毒性剂具有副作用，如导致膀胱中正常上皮增殖的抑制，造成潜在的致命性溃疡及膀胱被覆上皮的破坏。环磷酰胺作为一种细胞毒性剂，其引起某些病人的出血性膀胱炎--一种严重的并且有时是致命性的并发症。有或没有膀胱炎时也可发生膀胱的纤维变性。这种损伤被认为是由于尿中排出的环磷酰胺代谢产物引起的。环磷酰胺引起的血尿一般可持续几天，也可能长期存在。有些严重病例需要进行药物或外科手术治疗。严重的出血性膀胱炎须中断环磷酰胺治疗。另外，在环磷酰胺治疗的两年内和以前已有过出血性膀胱炎的病人可发生膀胱癌(Cytoxan(环磷酰胺)包装内插页)。环磷酰胺对前列腺和雄性生殖系统有毒性作用。环磷酰胺治疗可导致不孕的发展，并导致一定程度的睾丸萎缩。KGF-2Δ33对正常膀胱、睾丸和前列腺的影响实验设计这些研究中使用雄性Sprague-Dawley大鼠(160-220g)(n=4-6只/治疗组)。以5mg/kg/天的剂量投用KGF-2Δ33。每天腹膜内或皮下注射重组KGF-2Δ33或缓冲液(40mM乙酸钠+150mM NaCl,pH6.5)，连续1-7天，然后次日处死动物。为了检查KGF-2Δ33诱导的作用的可逆性，另一些动物每天腹膜内注射KGF-2Δ33或缓冲液共7天，再经过7天无处理阶段后处死动物。
处死动物这一天，给大鼠腹膜内注射100mg/kg Brd U。2小时后给大鼠过量吸入乙醚并除去动物的某些器官。将组织样品放在10％中性缓冲的福尔马林中固定24小时并用石蜡包埋。为了检测复制细胞中的Brd U掺入量，将组织切成5μm切片，并使用小鼠抗Brd U单克隆抗体和ABCElite检测系统进行组织化学检查。用苏木精轻微负染组织切片。
由不知情的观察者读片。对于前列腺，以10×放大倍数，每个动物随机计数10个视野中的增殖细胞数。为了估计KGF-2Δ33对膀胱的作用，制备这些组织的横断切片，并以20×放大倍数计数10个随机视野中的增殖和未增殖细胞数。结果以标记细胞比未标记细胞的百分数表示。数据表示为平均数+SEM。用Stat View Software Package软件进行统计学分析(两尾未配对T检验)，并将统计学显著性限定为p＜0.05。
结果膀胱腹膜内注射KGF-2Δ337天期间(黑方块，图23)诱导了膀胱上皮细胞的增殖，但这没有影响器官的重量。皮下给药引起增殖数小量增加，但这没有达到统计学的显著差异(黑圈，图23)。前列腺和睾丸皮下(sc)和腹膜内(ip)投用KGF-2Δ33诱导了前列腺的显著增殖(图24)，但2次注射后变为正常。长期用KGF-2Δ33腹膜内注射治疗没有增加前列腺或睾丸的重量。KGF-2Δ33对环磷酰胺诱发的出血性膀胱炎的作用实验设计以1或5mg/Kg的浓度通过尾静脉给雄性Sprague Dawley大鼠(300-400g)(n=5/组)注射KGF-2Δ33或缓冲液安慰剂，24小时后腹膜内注射环磷酰胺200mg/Kg。最后1天，即注射环磷酰胺后48小时，给大鼠腹膜内注射100mg/Kg Brd U。2小时后，用CO2吸入法杀死动物。以向腔内直接注射10％福尔马林方法固定膀胱，并用福尔马林淋洗膀胱外部。5分钟后，取出膀胱和前列腺。将膀胱和前列腺石蜡包埋，制成横切片，并用H&E和小鼠抗Brd U单克隆抗体染色。使用下列记分系统估计尿路上皮损伤的程度由两个独立的观察者对膀胱损伤分级，描述尿道上皮损失程度(记为尿道上皮损失0,25％、50％、75％和100％)。此外，以每切片10个随机部位测定膀胱壁的厚度，表示为μm。
结果肉眼观察在用安慰剂和环磷酰胺处理的大鼠中，膀胱粗厚且紧硬。注射10％福尔马林后，膀胱很少膨胀。但在KGF-2Δ33处理组，直接注射福尔马林后膀胱有较大弹性，表明纤维变性程度较小。
显微镜观察膀胱图25显示KGF-2Δ33预处理对膀胱溃疡形成程度的影响。用盐水腹膜内处理的正常大鼠(盐水对照组)中，膀胱组织学上表现正常，没有观察到尿道上皮的溃疡形成。腹膜内投用200mg/Kg环磷酰胺导致膀胱上皮溃疡形成，占总上皮面积的25-50％(平均37％)。投用环磷酰胺24小时前注射KGF-2Δ33，与投用环磷酰胺前用安慰剂处理的动物相比，显著地降低了溃疡程度(1mg/Kg,0.4％,p=0.0128；5mg/Kg,5％,p=0.033)。
图26显示KGF-2Δ33对膀胱壁(包括上皮、平滑肌层和浆膜表面)厚度的影响。在只用缓冲液处理的组中，膀胱壁厚度约为40μm。用环磷酰胺处理使膀胱壁厚度增加5倍，至210μm。KGF-2Δ33预处理环磷酰胺治疗的动物可显著地抑制环磷酰胺对膀胱壁的增厚作用(1mg/Kg98.6μm(p=0.007)；5mg/Kg 52.3μm(p＜0.0001))。
前列腺与正常动物相比，可见接受缓冲液和环磷酰胺的大鼠前列腺(腺泡)明显萎缩，并伴有胞间隙增大和显著水肿。此外，观察到前列腺的上皮细胞层变短，而且不如相应的正常前列腺组织致密。用1mg/Kg和5mg/Kg KGF-2Δ33预处理则前列腺呈现正常的组织学外观。未观察到胞间隙增大或水肿，而且前列腺上皮被复细胞大小和密度与正常前列腺组织相似。
结论结果证明KGF-2可特异性地诱导膀胱上皮细胞和前列腺被覆上皮细胞的增殖。结果还证明KGF-2可特异性地显著降低环磷酰胺诱发之出血性膀胱炎溃疡发生的程度。
实施例17KGF-2Δ33对大鼠血小板水平的影响本实施例证明KGF-2Δ33可增加血小板水平。
实验设计成年Sprague-Dawley大鼠每天皮下注射缓冲液或不同剂量的KGF-2Δ33(如下表所示)，共4周。一组动物当时被杀死。另一组动物于4周恢复期后被处死。过夜禁食后经眼窝穿刺取血样并收集在含有EDTA抗凝剂或3.13％(W/V)柠檬酸三钠抗凝剂水溶液的试管中，分别进行血液学和凝血试验。对摄入肝素锂抗凝剂的样品进行血液化学分析。
结果如下表所示，与缓冲液对照组相比，雄性和雌性大鼠经用0.3mg/Kg(p＜0.05)、1mg/Kg(p＜0.01)、3mg/Kg(p＜0.01)和10mg/Kg(p＜0.001)KGF-2Δ33处理后，血小板水平显著增加。在大多数情况下，这些影响在4周恢复期后可逆转。
KGF-2Δ33对大鼠血小板水平的影响
*p＜0.05,**p＜0.01,***p＜0.001实施例18KGF-2Δ33对大鼠血浆纤维蛋白原的影响本实验证明KGF-2Δ33可增加血浆纤维蛋白原水平。实验设计成年Sprague-Dawley大鼠每天皮下注射缓冲液或不同剂量的KGF-2Δ33(如下表所示)，共4周。一组动物当时被杀死。另一组动物于4周恢复期后被处死。过夜禁食后经眼窝穿刺取血样并收集在含有EDTA抗凝剂或3.13％(W/V)柠檬酸三钠抗凝剂水溶液的试管中，分别进行血液学和凝血试验。对摄入肝素锂抗凝剂的样品进行血液化学分析。结果如下表所示，相对于缓冲液对照组，雄性大鼠用3mg/Kg(p＜0.001)和10mg/Kg(p＜0.001)KGF-2Δ33处理，雌性大鼠用1mg/Kg(p＜0.001)、3mg/Kg(p＜0.001)和10mg/Kg(p＜0.001)KGF-2Δ33处理后，均显著增加了血浆纤维蛋白原水平。在大多数情况下，这些影响可在4周恢复期后逆转。
KGF-2Δ33对大鼠血浆纤维蛋白原水平的影响
*p＜0.05,**p＜0.01,***p＜0.001实施例119KGF-2Δ33对大鼠总血清蛋白质水平的影响本实验证明KGF-2Δ33可增加总血清蛋白质水平。实验设计成年Sprague-Dawley大鼠每天皮下注射缓冲液或不同剂量的KGF-2Δ33(如下表所示)，共4周。一组动物当时被杀死。另一组动物于4周恢复期后被处死。过夜禁食后经眼窝穿刺取血样并收集在含有EDTA抗凝剂或3.13％(W/V)柠檬酸三钠抗凝剂水溶液的试管中，分别进行血液学和凝血试验。对摄入肝素锂抗凝剂的样品进行血液化学分析。结果如下表所示，与缓冲液对照组相比，雄性和雌性大鼠经用1mg/Kg(p＜0.001)、3mg/Kg(p＜0.001)和10mg/Kg(p＜0.001)KGF-2Δ33处理后，总血清蛋白质水平显著增加。在一些情况下，这些影响在4周恢复期后可逆转。
KGF-2Δ33对大鼠总血清蛋白质水平的影响
*p＜0.05,**p＜0.01,***p＜0.001实施例20KGF-2Δ33对大鼠血清白蛋白水平的影响本实验证明KGF-2Δ33可增加血清白蛋白水平。实验设计成年Sprague-Dawley大鼠每天皮下注射缓冲液或不同剂量的KGF-2Δ33(如下表所示)，共4周。一组动物当时被杀死。另一组动物于4周恢复期后被处死。过夜禁食后经眼窝穿刺取血样并收集在含有EDTA抗凝剂或3.13％(W/V)柠檬酸三钠抗凝剂水溶液的试管中，分别进行血液学和凝血试验。对摄入肝素锂抗凝剂的样品进行血液化学分析。结果如下表所示，相对于缓冲液对照组，雄性大鼠用1mg/Kg(p＜0.01)、3mg/Kg(p＜0.001)和10mg/Kg(p＜0.001)KGF-2Δ33处理，雌性大鼠用1mg/Kg(p＜0.001)、3mg/Kg(p＜0.001)和10mg/Kg(p＜0.001)KGF-2Δ33处理后，均显著增加了血清白蛋白水平。在大多数情况下，这些影响可在4周恢复期后逆转。
KGF-2Δ33对大鼠血清白蛋白水平的影响
*p＜0.05,**p＜0.01,***p＜0.001实施例21KGF-2Δ33对大鼠血清球蛋白的影响本实验证明KGF-2Δ33可增加血清球蛋白水平。实验设计成年Sprague-Dawley大鼠每天皮下注射缓冲液或不同剂量的KGF-2Δ33(如下表所示)，共4周。一组动物当时被杀死。另一组动物于4周恢复期后被处死。过夜禁食后经眼窝穿刺取血样并收集在含有EDTA抗凝剂或3.13％(W/V)柠檬酸三钠抗凝剂水溶液的试管中，分别进行血液学和凝血试验。对摄入肝素锂抗凝剂的样品进行血液化学分析。结果如下表所示，与缓冲液对照组相比，雄性和雌性大鼠经用1mg/Kg(p＜0.001)、3mg/Kg(p＜0.001)和10mg/Kg(p＜0.001)KGF-2Δ33处理后，血清球蛋白水平显著增加。在一些情况下，这些影响在4周恢复期后可逆转。
KGF-2Δ33对大鼠血清球蛋白水平的影响
*p＜0.05,**p＜0.01,***p＜0.001实施例22KGF-2对正常大鼠细胞增殖的影响引言
KGF-2是FGF家族的成员，可诱导正常人和大鼠角质细胞的增殖。其与KGF-1(FGF家族的成员)有大约57％同源性。已报导KGF-1可诱导许多器官上皮的增殖(Housley等，角质细胞生长因子诱导肝细胞和大鼠整个胃肠道的上皮细胞的增殖。临床研究杂志(J.Clin.Invest.)94:1764-1777(1994)；Ulich等，角质细胞生长因子是体内Ⅱ型肺细胞的生长因子。临床研究杂志，93:1298-1306(1994)；Ulich等，角质细胞生长因子是体内乳腺上皮的生长因子。哺乳期大鼠乳腺上皮对角质细胞生长因子的增殖作用有耐受性。Am.J.Pathol.144:862-868(1994)；Nguyen等，转基因小鼠胎肝中角质细胞生长因子的表达导致上皮生长和分化的改变，引起多囊肾和其它器官异常。Oncogene 12:2109-2119(1996)；Yi等，角质细胞生长因子诱导胰腺导管上皮的增殖。Am.J.Pathol.145:80-85(1994)；Yi等，角质细胞生长因子引起体内尿道上皮的增殖。J.Urology 154:1566-1570(1995))。我们用KGF-2进行相似的实验，以确定当经皮下和腹膜内途经全身用药时，其是否诱导大鼠正常上皮的增殖。
方法用于这些研究的雄性Sprague-Dawley大鼠(160-220g)得自HarlanSprague Dauley。以5mg/Kg/天的剂量服用KGF-2Δ33(HG 03411-E2)。每天皮下或腹膜内注射KGF-2Δ33或重组缓冲液(40mM乙酸钠+150mM NaCl,pH6.5)，给药1-7天，并于次日处死大鼠(见下文)。为了检验KGF-2Δ33诱导的作用的可逆性，另外加一组动物每天腹膜内注射KGF-2Δ33或缓冲液共7天，7天无治疗期后处死之。
处死的当天，给大鼠腹膜内注射100mg/Kg Brd U。 2小时后给动物吸入过量乙醚并取出待观察的器官。有的要记录器官重量。在10％中性缓冲的福尔马林中固定组织样品24小时并用石蜡包埋。为检测Brd U在复制细胞中的掺入量，使用小鼠抗Brd U单克隆抗体(BoehringerMannheim)和ABC Elite检测系统(Vector Laboratories)对5μm切片进行免疫组织化学检查。用苏木精轻微负染组织切片。
由盲目的观察者(不知情者)读片。以10×放大倍数计数每只动物下列组织各10个随机视野中的增殖细胞数肝、胰、前列腺和心脏。也以20×放大倍数计数肺组织10个随机视野中的增殖细胞数。因为肾脏有许多功能上不同的区域，所以对每只动物的肾脏组织，都是取经肾中心的冠状横断切面计数增殖细胞数。为了估计KGF-2Δ33在食道和膀胱中的作用，制备这些组织的横断切片并分别以10×和20×放大计算10个随机视野中的增殖和非增殖细胞数。结果以标记细胞对未标记细胞的百分数表示。
数据表示为平均数±SEM。用Stat View软件包(Abacus Concepts,Inc.,Berkeley,CA)进行统计学分析(二尾未配对T检验)，并将统计学显著性限定为p＜0.05。
结果图27显示总的实验程序。每组6只动物。但在由不知情者进行分析时可以看出，有时Brd U注射是不成功的。在结果分析之前，116只大鼠中有8只(或7％动物)的数据已人研究排除，下表中显示所得到的组大小。这些研究中使用的组大小n=处理 时间ip scKGF-2Δ33 1天 6 5缓冲液1天 6 6KGF-2Δ33 2天 6 4缓冲液2天 6 6KGF-2Δ33 3天 5 5缓冲液3天 5 5KGF-2Δ33 7天 6 6缓冲液7天 6 5KGF-2Δ33 7天+7天无处理 6 ND缓冲液7天+7天无处理 6 ND肝脏腹膜内注射KGF-2Δ331次后诱导了肝细胞的迅速增殖(黑方块)(图28)，这种放大的促有丝分裂活性持续3天，每天注射共7天后转为正常。与腹膜内投用KGF-2对肝的显著作用相反，当皮下给予这种生长因子时则证明其作用较小(黑圈)(图28)。处理1天后增殖程度提高，但每天注射共2天后又转为正常值。
胰腺与腹膜内投用KGF-2Δ33对肝脏的快速可逆作用相反，在14天研究期间里均可见这种注射给药对胰腺有增殖促进作用(黑方块，图29)。令人惊奇的是，皮下投用KGF-2Δ33(黑圈)在各时间点均未见诱导细胞增殖。
肾脏和膀胱以皮下或腹膜内途径给药时，KGF-2Δ33诱导了肾上皮的增殖，但前一途径诱导的效果更大。皮下给药诱导了增殖的迅速增加(黑圈)，2天后达到峰值，每天处理共7天后转为正常(图30)。腹膜内给予KGF-2Δ33时(黑方块，图30)，只在第2和3天见有增殖的适度的，但比较显著的增加。在7天研究期间里，可见腹膜内注射KGF-2Δ33也诱导了膀胱上皮细胞的增殖(黑方块，图23)。皮下投用引起增殖的小量增加，但没有达到统计学上的显著性差异(黑圈，图23)。
前列腺皮下和腹膜内注射KGF-2Δ33诱导了前列腺的显著增殖(图24)，但在2次注射后即恢复正常。
食道皮下或腹膜内投用KGF-2Δ33引发了食道细胞的早期短时间增殖(分别为1和2天)，然后又迅速恢复正常(结果未示出)。
其他器官在7天给药期间，经皮下和腹膜内途径全身投用KGF-2Δ33没有引发肺上皮的增殖(结果未示出)。
讨论当以皮下途径用药时，在某些器官(肝、肾、食道和前列腺)可见有对正常上皮增殖的刺激作用，但这些作用大多是短时间的，并且都是可逆的。即使每天皮下投用KGF-2，这些器官的细胞增殖也是可逆转的。
给药途径对所观察到的增殖作用有十分显著地影响。虽然每天腹膜内注射给药在3天期间增加了肝细胞增殖的速率，但每天皮下投用KGF-2则只在治疗1天后表现有增殖速率提高。对胰腺的影响甚至更令人惊奇。当腹膜内投用KGF-2时，动物胰腺在整个14天的研究期间均明显地提高了增殖水平。但皮下投用KGF-2则没有增加胰腺的有丝分裂活性。同样，腹膜内而不是皮下投用KGF-2可引发膀胱粘膜的增殖。
腹膜内投用KGF-2使肾脏中含有收集管的区域发生短期小范围的细胞增殖。然而，每天皮下注射KGF-2则诱导该区域的长时期过度增殖。
实施例23气管内投用KGF-2Δ33后对肺细胞增殖的影响本实施例证明气管投用后，KGF-2Δ33能够刺激正常大鼠的肺增殖。
方法这些研究中使用雄性Lewis大鼠(220-270g)(n=5/处理组)。以1和5mg/Kg的剂量(0.6ml，然后是3ml空气)气管内投用KGF-2Δ33或安慰剂(40mM乙酸钠+150mM NaCl,pH6.5)。在实验的第1和2天用药。
第3天即处死动物的当天，腹膜内注射100mg/Kg Brd U。2小时后经CO2窒息杀死大鼠。通过气管内导管用10％缓冲福尔马林充胀肺，并用石蜡包埋肺的矢状切片。为了检测Brd U在复制细胞中的掺入，使用小鼠抗Brd U单克隆抗体和ABC Elite检测系统对5μm切片进行免疫组织化学检查。用苏木精小心负染切片。
由两个不知情的观察者读片。以20×放大倍数计数10个随机视野中的增殖细胞数。结果以每个视野中的Brd U阳性细胞数(平均数±SEM)表示。用Instat V.2.0.1进行统计学分析(未配对T检验)，并将统计学显著性限定为p＜0.05。
结果如图31中所示，气管内注射1和5mg/Kg KGF-2Δ33导致肺上皮细胞增殖的增加。相对于缓冲液对照组的每视野1.58个细胞，用KGF-2Δ33处理使每视野中Brd U阳性细胞数统计学上显著地增加，即用药1mg/Kg时为23.4个细胞/视野(p=0.0002),5mg/Kg时为10.3个细胞/视野(p=0.0003)。
实施例24KGF-2诱导正常大鼠唾液腺和泪腺增殖生产并纯化成纤维细胞生长因子(FGF)家族的新成员即重组人KGF-2。已显示KGF-2(FGF-10)可体外诱导小鼠角质细胞和大鼠前列腺上皮细胞的增殖(Igarashi,M.et.al.,J.Biol.Chem.273:13230-13235,1998；Emoto,H.et al.,J.Biol.Chem.272:23191-23194,1997；Lu,W.et al.,FASEB J.12:A1463,1998)。本实施例研究KGF-2对正常大鼠唾液腺和泪腺增殖速率的影响。检查已用KGF-2处理1-7天的正常大鼠的泪腺和两大唾液腺(腮腺和下颌下腺)，并发现增加了细胞增殖，如下所示。材料和方法重组KGF-2按以前所述方法，使用编码重组人KGF-2的细菌表达载体(pHE4)生产并从大肠杆菌表达系统中纯化KGF-2Δ33。用SDS-PAGE和反相高效液相层析法测知纯化的蛋白质纯度≥95％，而且内毒素水平很低(≤0.5EU/mg和≤5EU/ml)。
实验设计这些研究中，使用得自Harlan Sprague Dauley,Inc,Indianapolis,IN的雄性Sprague-Dawley大鼠(体重166-243g)。按照推荐的标准将动物保留在配有再循环纸垫的小型隔离笼(Harlan Sprague Dawley,Inc.)中，并提供粒状啮齿动物食物(Harlan Sprague Dawley,Inc.)和瓶装饮用水，不限饮食地喂养。本研究中使用的动物方案得到人类基因组科学院动物保护和使用委员会(Humau Genome Sciences Institutional Animal Careand Use Committee)的审阅和批准。
动物分为每组6只，以5mg/Kg的剂量注射KGF-2Δ33(在40mM乙酸钠和150mM NaCl中配制，pH6.5)或缓冲液(40mM乙酸钠和150mMNaCl,pH6.5)。每天以静脉内途径全身用药共1-7天，最后一次处理后24小时杀死大鼠。为了检查KGF-2Δ33诱导的作用的可逆性，另有-些动物每天注射KGF-2Δ33或缓冲液共7天，再经7天无治疗期后杀死动物。
组织学动物处死前2小时腹膜内注射100mg/Kg Brd U(BoehringerMannheim Corp,Indianapolis,IN)。分离唾液腺，称重并在10％中性缓冲的福尔马林中固定24小时。取出完整眼睛并固定之。固定后用石蜡包埋组织。为了检测Brd U在复制细胞中的掺入量，使用小鼠抗Brd U单克隆抗体(Boehringer Mannheim,Corp)和ABC Elite检测系统(VectorLaboratories,Inc,Burlingame,CA)对5μm组织切片进行免疫组化分析。用苏木精对切片进行负染。其他石蜡切片用苏木精和伊红染色。
用于定量的所有切片均由不知情的观察者读片。随机选择3个区域以10×放大观察，用IPLab Spectrum软件(3.1.1版本)(Signal AnalyticsCorp.,Vienna,VA)估计每个感兴趣区域中阳性细胞的百分数(％ROI)。
统计学分析数据用平均值±SEM表示。用StatViw软件包(Abacus Concepts,Inc.,Berkeley,CA)进行统计学分析。使用因子ANOVA法通过Scheffe的post hoc比较进行分析。
结果以5mg/Kg剂量每天静脉内注射KGF-2Δ33，连续5-6天后有的大鼠戴上湿口套。观察KGF-2Δ33对腮腺和下颌下唾液腺增殖速率的影响。因唾液腺和泪腺含有相似的细胞，而且临床中存在对两腺体的损伤，所以也检查泪腺。
腮腺以5mg/Kg剂量1次注射KGF-2Δ33后，明显地增加了腮腺中浆液分泌腺泡的增殖。定量分析也显示明显的增殖作用。如图32中所示，1次注射KGF-2Δ33诱导细胞增殖提高了40倍。连续注射7天后，增殖反应增加降低到18倍。连续处理7天后再恢复7天，则动物不再有增殖速率增加，证明这种显著的增殖刺激作用是可逆的。增殖的增加导致器官增大。连续每天注射KGF-2Δ33共7天后，腮腺重量增加3倍，但经7天恢复期后其大小又转为正常(图33)。
下颌下腺KGF-2Δ33处理显著地增加了下颌下腺的增殖。浆液和粘液分泌细胞均受影响，但导管似乎对KGF-2Δ33的增殖促进作用有耐受性。对增殖作用进行定量并将结果示于图34中。经每天处理共1-3天后，KGF-2Δ33提高了细胞的生长。7天后增殖作用仍有轻度增加，但并没有统计学上的显著性。与腮腺不同，这种细胞增殖的增加迅速反映在腺体重量增加上，停止处理7天后腺体重量开始变为正常(图35)。
讨论唾液和眼泪产生的抑制是一个较大的临床问题，而且目前单单治疗干燥性角结膜炎的花费在1亿美元以上(Lemp,M.A.,Adv.Exp.Med.Biol.438:791-803,1998)。腮腺是三大唾腺之一，由分泌水样物质的浆液细胞组成，其所分泌的水样物质中含有酶如淀粉酶和溶菌酶。下颌下腺则含有浆液和粘液分泌细胞并分泌较浓稠的液体(Wheater′s functionalhistology,A text and colour atlas,New York:Churchill Livingstons,Ed.3,1993)。
在第一次静脉内注射的24小时内，KGF-2诱导了腮腺和下颌下腺增殖的急剧增加。在7天处理期间腮腺增殖持续增加，而每天投用KGF-2的7天时间里下颌下腺则一直正常生长。这些增殖改变反映在器官重量的增加上，但也存在有增殖反应的空间差异。
已报导连续输注表皮生长因子(EGF)可使大鼠和小鼠腮腺和下颌下腺增殖增加，但其作用在腺管上皮中更为显著。Ohlsson等人报导，在小鼠体内投用EGF后可见浆液和腺管细胞均有增加(Ohlsson,B.et al.,Pancreas 14:94-98,1997)。在分别连续用药3天和7天后，可见腮腺和下颌下腺有细胞增殖。在腮腺和下颌下腺中腺管比浆液细胞有更高的标记指数，分别增加12和3倍。腮腺和下颌下腺中浆液细胞的增殖最大分别达到5和2倍。器官重量没有改变。Breider等人在用大鼠所作的实验中发现连续输注EGF共4周后，诱导了唾液腺腺管上皮的增殖，但腺泡细胞未见增殖(Breider,M.A.et al.,Vet Pathol.33:184,1996)。与EGF相比，KGF-2诱导了两种唾液腺中浆液上皮的远为显著的增殖。
已报导另一种与KGF-2有一定同源性的生长因子，即KGF-1，可诱导唾液腺的某些改变，如有人报导(Guo,L.et al.,EMBO J.12:973-986,1993)其可诱导出生5天内的转基因小鼠唾液分泌过多。这些小鼠的下颌下腺表现为很少或没有分泌颗粒的未分化形态学。给大鼠全身投用KGF-2共1周后，没有诱导这些细胞中的同样改变。
总之，KGF-2可诱导唾腺和泪腺的唾液和眼泪产生细胞增殖的显著增加。尽管没有仔细分析两种细胞类型，但似乎对这些器官中腺管细胞的作用很小。这些结果提示KGF-2可能对因为放射治疗、自身免疫病或其他临床状况下受损伤的唾腺具有临床有益作用。
实施例25KGF-2Δ33诱导眶外泪腺的增殖因为KGF-2Δ33对唾液腺和胰腺等分泌组织有增殖促进作用，所以也观察了全身投用KGF-2Δ33对泪腺的作用。
材料和方法每天给正常雄性Sprague Dawley大鼠静脉内注射KGF-2Δ33(HG03411-E6)或缓冲液。处死动物前2小时全身注射Brd U，以便能够用免疫组化方法检测增殖细胞。切掉泪腺后固定在10％中性缓冲的福尔马林中进行组织学处理。每组6只动物，使用计算机处理的形态测定装置由不知情的观察者估计组织增殖程度。增殖结果以具有增殖细胞的区域的百分率表示(％ROI)。误差栏反映SEM。使用StatView进行统计学分析。因子ANOVA法分析后进行Scheffe post-hoc检验，并将统计学显著性限定为p＜0.05。
结果如图36所示，每日用KGF-2Δ33处理(静脉内)1、2、3天后泪腺增殖。但如在许多器官和组织中观察到的情况一样，连续每日投用这种生长因子7天后，没有显示腺体增殖水平提高。每日处理共7天然后7天休息之后，缓冲液组比KGF-2处理组动物表现更高水平的增殖，这可能是由于KGF-2受体的下调作用。
这些结果提示，局部或全身投用KGF-2Δ33可因其对泪腺上皮细胞的增殖作用而治疗性提高腺体的分泌能力。这些结果还表明，KGF-2对因放射治疗、自身免疫病或其他临床状况造成的泪腺损伤有临床适用效果。
实施例26KGF-2对角膜和结膜的作用本实验在于确定KGF-2对角膜和结膜的作用。实验设计每天以5mg/Kg的剂量给雄性SD大鼠静脉内注射KGF-2Δ33。于第1、2、3和7天处死动物。另一组连续注射7天，接着再休息7天，然后处死动物。处死前2小时，给动物注射剂量为100mg/Kg的Brd U。取出眼睛和所附着的结膜。计数角膜和结膜中已掺入了Brd U的复制上皮细胞的数目。结果以每mm组织中复制上皮细胞数来表示。结果角膜如图37中所示，可见第1和2天KGF-2Δ33处理后增殖细胞数目增加。然而，只有第2天的结果达到统计学显著性。对结果所作的析因-ANOVA表明，KGF-2Δ33处理和时间之间没有相互影响。因此，KGF-2Δ33似乎不引起角膜中上皮细胞的增殖(p=0.077)。但从p值可以看出结果接近有显著差异。
结膜如可从图38中看出的，观察到第1、2和3天KGF-2Δ33处理后增殖细胞的数目增加。但处理第7天时增殖细胞的数目又转为正常。对结果进行的析因-ANOVA分析表明，KGF-2Δ33可引起结膜上皮细胞的增殖(p=0.0024)。
实施例27KGF-2对毛果芸香碱诱发的唾液分泌的影响口干的临床症状是因对头颈部肿瘤进行放射治疗或因Sjorgen氏综合症引起的。放射治疗造成病人唾液产生严重减少，并可导致吞咽困难、口腔溃疡和损伤及语言困难等问题。目前对口干没有太好治疗办法。最常用的治疗是口服毛果芸香碱片剂以诱导唾液分泌。
因为KGF-2Δ33可对唾液腺细胞发挥增殖作用，所以有必要确定注射KGF-2Δ33是否也在治疗的大鼠中诱导功能性差异。材料和方法每天给正常雄性SD大鼠静脉内注射KGF-2Δ33或缓冲液，连续7天。每组使用6只动物。以Student′s t检验对结果进行统计学分析。注射7天后，首先麻醉大鼠，然后注射盐酸毛果芸香碱(2mg/Kg；i.p.)，收集唾液。
结果在注射毛果芸香碱时开始直接从口腔中收集唾液30分钟。根据重量计算唾液体积，然后检测淀粉酶含量。
如图39(A)中所示，投用KGF-2Δ33使被治疗动物的唾液产生量大大增加。图39(B)则显示每日注射KGF-2Δ33后唾液中淀粉酶浓度降低。由于KGF-2Δ33治疗引起腮腺和下颌下腺的分泌腺泡大量增殖，故随后出现唾液产生量的增加。因此，KGF-2对于治疗口干症可能是有用的。
实施例28KGF-2上颌窦和鼻中隔的影响以5mg/Kg的剂量给正常SD大鼠静脉内投用KGF-2Δ33。处理后1、2、3和7天处死动物。另外，有一组大鼠每天注射KGF-2Δ33连续7天，然后休息7天(共14天)。处理前2小时，每只动物注射100mg/Kg BrdU。
断头处死动物，立即冲洗动物的鼻腔并固定在中性磷酸盐缓冲的10％福尔马林中。计数鼻中隔和上颌窦中标记(Brd U)的呼吸上皮细胞总数并以每毫米长组织中的细胞数表示结果。结果上颌窦如图40中所示，KGF-2Δ33治疗1、2、3或7天后，可见增殖细胞总数增加，所有各天的结果都有统计学意义(析因-ANOVA分别为p＝0.0024、＜0.0001、0.0190和0.0374)。到第14天增殖细胞数回复正常。
鼻中隔如图41中所示，鼻中隔呼吸道上皮也与上颌窦上皮一样。KGF-2Δ33治疗1、2、3和7天后均可见增殖细胞总数增加。除第14天外，所有各天都有统计学差异(析因-ANOVA分别是p=0.0022、＜0.0001、＜0.0001和0.0171)。到第14天，增殖细胞数恢复正常。结论KGF-2Δ33(5mg/Kg)使上颌窦和鼻中隔的Brd U标记上皮细胞总数显著增加。到第14天，增殖又回到正常水平。
实施例29KGF-2对结膜中杯形细胞的影响以5mg/Kg的剂量给SD大鼠静脉内投用KGF-2Δ33。于第1、2、3和7天处死动物；另外一些大鼠注射7天并休息7天，然后处死。切出眼睛和所附着的结膜。用PSA进行组织染色，并计数结膜中PAS阳性细胞(杯形细胞)的数目。结果以每毫米组织的杯形细胞数表示。
结果在治疗期间(第1、2、3和7天)，KGF-2Δ33和缓冲液两个治疗组没有差异。用KGF-2Δ33治疗7天并在其后休息7天(图中的14天组)的动物，杯形细胞数目比缓冲液处理组高。这种差异近于有统计学意义(p=0.085,Scheffe′s post-hoc试验)，结果如图中所示。
实施例30KGF-2对体内肺增殖的影响方法用异氟醚气体麻醉处于仰卧位的雄性SD大鼠(约200g，每组5只)。以0.5ml体积通过尾静脉投用缓冲液或KGF-2Δ33(1或5mg/Kg)。实验第1天静脉内投用单一剂量的KGF-2Δ33或安慰剂。静脉内注射6、24或48小时处死动物。处死这一天，于处死前2小时腹膜内注射100mg/Kg Brd U。用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉后使动物安乐死，然后断颈。
收获肺组织从胸骨区至颏部作一纵向皮肤切口。夹住左上腔静脉，通过胸骨缘打开胸腔并与肋骨分开。从膈上切出肺并从右心室注入盐水(10-15ml)以从肺系统中冲洗掉血液。血液/盐水通过左心房排出肺系统。用动脉镊子在主支气管处夹住左肺叶，同时通过颈部区域气管中的狭长槽用10-15ml 10％福尔马林将右肺充胀，夹住并固定约5分钟。切出右上肺和右下肺，放入组织盒中用10％福尔马林浸泡24小时。将肺组织放在70％乙醇中送交组织病理学分析。在石蜡中包埋组织，作横断切片并用H&E和小鼠抗Brd U单克隆抗体染色。
组织学分析以20倍放大在光学显微镜下计数Brd U阳性细胞数。每份组织样数10个随机视野。由两个对治疗组不知情的独立观察者计数。
统计学分析使用Instat 2.01版本进行所有的统计学分析。用未配对T检验分析实验数据。p＜0.05即认为有意义。数据以平均数±SEM表示。结果图43中显示Brd U增殖研究的结果。在接受缓冲液的大鼠中，20倍放大下每视野约有36个Brd U阳性细胞。一次静脉内注射1mg/Kg KGF-2Δ33后24小时，观察到每视野有97个Brd U阳性细胞；相对于KGF-2缓冲液对照组，增加比较显著(p=0.0118)。与缓冲液对照组(每视野37个细胞)相比，接受5mg/Kg KGF-2Δ33的大鼠其每视野的Brd U阳性细胞数显著增加(每视野197个细胞；p＜0.0001)。在6和48小时时间点上，观察到两组动物的Brd U阳性细胞数没有差异。
结论在静脉内注射KGF-2Δ33后6小时，Brd U免疫染色试验未见增殖增加。
以5mg/Kg单次静脉内给予KGF-2Δ33，可见肺内的Brd U免疫染色相对于两实验中的缓冲液对照组明显增加。
其中一个实验中，相对于投用缓冲液的对照组，静脉内注射1mg/KgKGF-2Δ33导致Brd U免疫染色显著增加。
静脉内投用KGF-2Δ33后48小时，各组间未见肺细胞增殖的差异。
实施例31雾化的KGF-2对体内肺增殖的影响方法用氯胺酮/甲苯噻嗪肌肉内注射麻醉雄性Lewis或SD大鼠(250-350g，每组5只)，以使动物在接触药物期间不动。使用Pari-Proneb LC Jet+雾化器雾化缓冲液或KGF-2Δ33。该雾化器放出的颗粒有不同大小，其中74％的颗粒大小＜5μm,24％大小＜2μm。大鼠在45-60分钟期间吸入雾化的缓冲液或KGF-2Δ33(6或12mg/大鼠)。接触药物后24小时(第2天)给大鼠腹膜内注射100mg/Kg Brd U,2小时后处死。给动物吸入CO2窒息致死，以收获组织。
收获肺组织从胸骨区至颏部作一纵向皮肤切口。夹住左上腔静脉，通过胸骨缘打开胸腔并与肋骨分开。从膈上切出肺，并从右心室注入盐水(10-15ml)以从肺系统中冲洗掉血液。血液/盐水通过左心房排出肺系统。用动脉镊子在主支气管处夹住左肺叶，取出肺叶并在液氮中快速冷冻以进行胶原蛋白含量测定。同时通过颈部区域气管中的狭长槽用10-15ml10％福尔马林将右肺充胀，夹住并固定约5分钟。切掉右上肺和右下肺，放入组织盒中用10％福尔马林浸泡24小时。将肺组织放在70％乙醇中送交组织病理学分析。在石蜡中包埋组织，作横断切片，并用H&E和小鼠抗Brd U单克隆抗体染色。
组织学分析在光学显微镜(20×)下计数Brd U阳性细胞数。每个组织样品计数10个随机视野。计数细胞由不知道治疗组的两个独立观察者完成。
统计学分析使用Instat 2.01版本进行所有的统计学分析。用未配对T检验分析实验数据。p＜0.05即认为有显著性。数据以平均数±SEM表示。
雾化器设计在1个雾化器装置上同时处理5只动物。结果显微镜观察经Brd U细胞计数的组织学观察，可见KGF-2Δ33缓冲液处理的动物(n=5)每视野平均有9个Brd U阳性细胞。与缓冲液对照组相比，以6mg/大鼠(n=5)的KGF-2Δ33处理，Brd U阳性细胞数不很显著地增加(每视野20个细胞，p=0.0857)。与缓冲液对照组相比，以12mg/大鼠(n=5)的KGF-2Δ33处理，可见每视野中Brd U阳性细胞数显著增加(每视野32个细胞；p=0.001)。结果示于图44中。
实施例32KGF-2Δ33对博来霉素诱发的肺损伤的预防作用本实验的目的是检查KGF-2Δ33在博来霉素诱发的大鼠肺损伤模型中的作用。博来霉素引起肺的纤维变性。试验KGF-2Δ33对肺损伤的预防(保护)作用。所使用参数包括体重、组织学和肺胶原蛋白含量。方法用异氟醚气体麻醉仰卧位的雄性lewis大鼠(200-250g，每组5-8只)。使用咽喉纤维镜固定咽部，将连有5ml注射器的金属饲喂管(20号针头)插入气管内。在实验的第1和2天以0.6ml体积经气管内途径向肺内注射缓冲液或KGF-2Δ33(0.5、1或5mg/Kg)，然后注入4cc空气。借助空气推动液体进入肺内。快速以斜卧位置放置大鼠并使之恢复。必要时使之恢复正常呼吸。实验的第3天，给非处理组外的所有动物气管内投用博来霉素(5单位/0.5ml)。每天进行临床观察(如体重损失、死亡等)。在实验的最后一天(第14天)，给大鼠腹膜内注射100mg/Kg Brd U,2小时后经用CO2窒息使动物安乐死亡。然后收获组织并进行组织病理学分析和肺胶原蛋白含量检测。
肺组织收获从剑胸区至颈部作一纵向皮肤切口。通过胸骨缘打开胸腔并与肋骨分开。从膈上切出肺并用动脉镊子在主支气管处夹住左肺叶，取出肺叶并在液氮中快速冷冻以进行胶原含量检测。通过颈部区域气管中的狭长槽用10％福尔马林将右肺充胀，夹住并固定约5分钟。切掉右肺，放入组织盒中用10％福尔马林浸泡24小时。将肺组织放在70％乙醇中送交组织病理学分析。在石蜡中包埋组织，作横断切片并用H&E和小鼠抗Brd U单克隆抗体染色。
组织学分析在光学显微镜(20×)下计数Brd U阳性细胞数。每个组织样品计数10个随机视野。计数细胞由不知道治疗组的两个独立观察者完成。
统计学分析使用Instat 2.01版本进行所有的统计学分析。用未配对T检验分析实验数据。p＜0.05即认为有显著性。数据以平均数±SEM表示。结果体重图45显示本实验期间动物的体重。整个实验中“未处理”组动物体重继续增加。整个实验期间，接受博来霉素和KGF-2缓冲液的动物体重都在降低，直到第7天。7天后，这些动物开始增加体重。处理组中，1mg/Kg剂量的KGF-2Δ33也能预防其他接受博来霉素组中观察到的体重损失。在第5、7和9天可看到相对于缓冲液安慰剂组的体重差异。接受0.5或5mg/Kg KGF-2Δ33的动物具有与KGF-2缓冲液对照组动物相似的体重。
显微镜观察在“未处理”组动物的肺实质H&E染色切片上没有观察到结构损伤。使用0-9的记分范围表示纤维变性程度(0=正常，1-3=轻度，4-6=中度，7-9=重度)。未治疗组动物平均分数为0.56。所有其他处理组(接受博来霉素组)均是有肺组织结构损伤。如图46中所示，博来霉素和KGF-2缓冲液处理组大鼠相对于未处理组有明显改变，平均纤维变性分数为4.24(**p＜0.0001)。与KGF-2缓冲液安慰剂对照组相比，接受0.5mg/KgKGF-2Δ33(2.91,*p=0.0248)、1mg/Kg KGF-2Δ33(2.07,p=0.0004)和5mg/Kg KGF-2Δ33(1.98,p=0.0005)的动物表现出纤维变性分数明显降低。
如图47中所示，经计数每视野中的Brd U阳性细胞数目来估计细胞增殖。正常大鼠中，每视野肺组织平均有7个Brd U阳性细胞，表明在正常生理条件下发生的细胞增殖水平很低。当用KGF-2缓冲液和博来霉素处理大鼠时，每视野中的细胞数较未处理组明显增加，为40(p=＜0.0001)。与KGF-2缓冲液对照组相比，接受0.5mg/Kg(26个，p=0.0003)、1mg/Kg(11个，p=＜0.0001)和5mg/Kg(24个，p=＜0.0001)剂量KGF-2Δ33的大鼠表现有Brd U阳性细胞数目的明显降低。
这些结果提示，KGF-2可能对治疗肺纤维变性有临床上的积极效果。
实施例33KGF-2Δ33对环磷酰胺诱发的大鼠膀胱炎模型之膀胱容量的影响实验设计雄性SD大鼠(200g)静脉内接受剂量分别为0.1mg/Kg、0.3mg/Kg、1.0mg/Kg或3.0mg/Kg的KGF-2Δ33。第1天，腹膜内注射200mg/Kg环磷酰胺(CP)。第4天处死动物。每个实验组6只动物。实验组包括盐水对照组、只给CP的对照(200mg/Kg)组、缓冲液+CP(200mg/Kg)组、KGF-2Δ33(1.0mg/Kg)+CP(200mg/Kg)组，及KGF-2Δ33(3.0mg/Kg)+CP(200mg/Kg)组。
处死动物时，进行膀胱容积和膀胱湿重两个额外参数的检测。膀胱容量确定为向膀胱内注射福尔马林直到可见1滴福尔马林从尿道中排出时的总注射量(ml)。充注膀胱前先轻轻挤压膀胱使尿液从尿道全部排出。使膀胱固定6分钟。取出固定的膀胱、排空并称量膀胱湿重(*与仅用CP处理的对照组比较，+与缓冲液对照组比较)。结果显微镜观察盐水对照组的膀胱容量为1.10±0.1ml。只用CP的组显著降低到0.62±0.15ml，缓冲液对照组为0.45±0.01ml。与缓冲液对照组相比，用0.3mg/Kg和1.0mg/Kg KGF-2Δ33处理的组的膀胱容量显著增加(分别为1.20±0.25ml,p=0.0206；1.28±0.27，p=0.0172)。与只用CP的对照组(p=0.0066)和缓冲液对照组(p=0.0018)相比，投用3.0mg/Kg KGF-2Δ33的动物膀胱容量显著增加(1.72±0.28,P=0.28mD。结果示于图48中。
盐水对照组的膀胱湿重量为0.11mg。仅用CP的组的湿重量为0.22±0.01mg，缓冲液对照组为0.19±0.01mg。与仅CP对照组(p=0.0015)和缓冲液处理组(p=0.0595)相比，KGF-2Δ33组(0.3mg/Kg)湿重量(0.15±0.007mg)显著或近乎显著降低。1.0mg/Kg(0.15±0.02mg,p=0.0314)和3.0mg/Kg(0.149±0.01mg,p=0.0057)KGF-2Δ33治疗组膀胱湿重量比缓冲液对照组显著降低。这些结果示于图49中。
实施例34KGF-2Δ33和Mesna对环磷酰胺诱发的膀胱炎的影响利用环磷酰胺诱导的膀胱炎大鼠模型，检查KGF-2Δ33和mesna对膀胱壁厚度、膀胱溃疡形成及尿道上皮的影响。实验方法和设计第0天，雄性SD大鼠(300-400g)通过尾静脉接受缓冲液或5.0mg/KgKGF-2Δ33。第1天，通过腹膜内注射200mg/Kg环磷酰胺(CP)和通过尾静脉注射Mesna(20μg/g或40μg/g)。一组动物腹膜内注射盐水作为CP对照。每个实验组5只动物。实验组包括盐水对照组、仅给CP的对照组(200mg/Kg)、Mesna(20mg/Kg)+CP(200mg/Kg)组、Mesna(40mg/Kg)+CP(200mg/Kg)组、缓冲液+CP(200mg/Kg)组，和KGF-2Δ33(5mg/Kg)+CP(200mg/Kg)组。
第3天处死动物，CP注射后48小时给动物注射100mg/Kg Brd U。2小时后CO2窒息处死动物。直接向膀胱腔内注射10％福尔马林并用福尔马林淋洗膀胱外部，以固定膀胱从而进行组织学处理。5分钟后，收获膀胱。用石蜡包埋膀胱、切片并用H&E和小鼠抗Brd U单克隆抗体染色。
使用下述记分方法估计尿道上皮损伤的程度根据尿道上皮丢失情况将尿道上皮损伤(溃疡)记为0-100％(以10为单位)。评估正常尿道上皮的量并计为0-100％(以10％量渐增)。正常尿道上皮定义为至少含有单层细胞的致密复层上皮细胞，该单层细胞为有圆核的高柱状或立方形细胞。此外，按每切片10个随机部位检测膀胱壁的厚度并以μm数表示。该检测包括从尿道上皮通过平滑肌层到浆膜表面的距离。所有组织学检测均由不知情者完成。在Instat 2.01上使用Students未配对T检验进行统计学分析，如果p≤0.05即为具有显著性差异。结果显微镜观察观察到腹膜内注射盐水(CP载体对照)的正常大鼠的膀胱壁没有增大，而且未见尿道上皮溃疡发生。在腹膜内投用CP(200mg/Kg)之前24小时用缓冲液安慰剂预处理，导致总膀胱上皮区的43％±19有溃疡发生。注射CP之前24小时投用KGF-2Δ33，动物溃疡程度(1.4％±0.24；p=0.0641)比给安慰剂后再用CP处理的动物小。投用20或40mg/Kg的Mesea使溃疡形成分别减少至1.4％±0.24或6.2％±4.7，但这些数值与对照组相比没有统计学显著性。结果示于图50中。
在有些情况下，尿道上皮内层可能未表现有溃疡，但外观仍是不正常的。因此，以具有柱状或立方形态，有圆形核并且厚度至少有一层细胞的尿道上皮的量来确定“正常尿道上皮百分比”。在投用CP之前24小时用KGF-2Δ33处理的组分别有97％±3(p=0.0574)和93％±3(p=0.0625)的正常尿道上皮。与只给CP的组相比，认为这些数值不太显著。结果示于图51中。
还估测了膀胱壁的厚度，以作为CP损伤另一个评估标准。膀胱壁厚度是从尿道上皮开始，通过平滑肌层直到浆膜表面的厚度。在单用盐水(CP载体对照)处理的对照组中，膀胱壁厚度约为100μm±16。KGF-2Δ33预处理组为252μm±30(P=0.0331)。与只给CP的组相比，Mesna治疗也明显地减小了膀胱壁厚度；20mg/Kg时为198μm±34；p=0.0361；40mg/Kg时为172μm±46,p=0.0215。这些结果示于图52中。
实施例35KGF-2Δ33和Mesna对环磷酰胺诱发的膀胱炎的协同作用利用环磷酰胺诱发的膀胱炎大鼠模型，检查KGF-2Δ33和Mesna对膀胱容量和膀胱湿重的协同影响。实验设计雄性SD大鼠(350-400g,n=7)在第0天静脉内接受缓冲液或5.0mg/Kg KGF-2Δ33，在第1天接受Mesna(40μg/g，静脉内)，或于各自给药日进行联合治疗。第1天，给盐水对照组以外的所有治疗组投用环磷酰胺(300mg/Kg，腹膜内)。外加一组作为不治疗的CP对照组。第3天，于处死前2小时动物接受Brd U(100mg/Kg，腹膜内)。排除膀胱内的尿液后，充入福尔马林直到从尿道中漏出。记录注入膀胱内的福尔马林的体积定出膀胱容量。用10％中性缓冲的福尔马林固定膀胱，称重并放在组织盒中进行组织学分析。
每个实验组有6只动物。实验组包括盐水对照组、仅用CP的对照组(300mg/Kg)、缓冲液+CP(300mg/Kg)组、KGF-2Δ33(3.0mg/Kg)+CP(300mg/Kg)组、Mesna(40mg/Kg)+CP(300mg/Kg)组和KGF-2Δ33(3.0mg/Kg)+CP(300mg/Kg)+Mesna(40mg/Kg)组。结果盐水对照组的膀胱容积为2.21±0.1ml。只接受CP的动物组膀胱容积明显地降低为0.80±0.27ml，而缓冲液对照组为0.40±0.15ml。KGF-2Δ33治疗组(1.66±0.31ml,p=0.0038)和Mesna(40mg/Kg)组(1.67±0.44ml,p=0.0147)的膀胱容积均比缓冲液对照组有显著增加。与仅用CP的对照组(p=0.0044)和缓冲液对照组(p＜0.0001)相比，用KGF-2Δ33和Mesna二者治疗的动物也表现有膀胱容积的显著增加(1.96±0.19ml)。结果如图53中所示。
盐水对照组的膀胱湿重量为0.16mg。仅用CP的对照组的湿重为0.30±0.01mg。KGF-2Δ33组(0.33±0.3mg)和Mesna组(0.28±0.03mg)与对照组没有明显差异。然而，用KGF-2Δ33和Mesna二者治疗的动物则表现有比仅用CP的组(p=0.193)和缓冲液对照组(p=0.0099)明显降低的膀胱湿重(0.19±0.08mg)。结果如图54所示。
实施例36KGF-2Δ33诱导的颊粘膜和舌的改变对于猕猴，每天静脉内注射KGF-2Δ33(300μg/Kg)导致口(颊)和食道粘膜出现肉眼可见的增厚。显微镜检可见，每天和隔日用KGF-2Δ33处理的猕猴的颊粘膜、舌和食道角化过度。颊和食道粘膜角化过度与颊和食道粘膜的大致可见增厚有关。
实施例37KGF-2Δ33诱导的杯形细胞改变在雄性SD大鼠中，每天静脉内注射5mg/Kg KGF-2Δ33使得动物鼻空气通道的呼吸道上皮中杯形细胞增生。连续7天用KGF-2Δ33处理，随之再休息7天后，可见杯形细胞有轻至中度增生。
很显然，可以不按照上文说明书和实施例中所作的特定描述实践本发明。
基于上述教导有可能对本发明作许多改变和改进，因此可以在本发明待批权利要求范围内，不必依照这些特定描述实践本发明。
所有出版物(包括专利、专利申请、期刊文章、实验室手册、书籍或其他文献)的全部公开内容均列为本文参考文献。
序列表<110>Human Genome Sciences,Inc.
Jimenez,PabloRampy,Mark A.
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gaaaatggat acaataccta tgcatcattt 300aactggcagc ataatgggag gcaaatgtat gtggcattga atggagaagg agctccaagg 360agaggacaga aaacacgaag gaaaaacacc tctgctcact ttcttccaat ggtggtacac 420tcatag426<210>146<211>141<212>PRT<213>Homo sapiens<400>146Met Ser Tyr Ash His Leu Gln Gly Asp Val Arg Trp Arg Lys Leu Phe1 5 10 15Ser Phe Thr Lys Tyr Phe Leu Lys Ile Glu Lys Asn Gly Lys Val Ser20 25 30Gly Thr Lys Lys Glu Asn Cys Pro Tyr Ser Ile Leu Glu Ile Thr Ser35 40 45Val Glu Ile Gly Val Val Ala Val Lys Ala Ile Asn Ser Asn Tyr Tyr50 55 60Leu Ala Met Asn Lys Lys Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Lys Glu Phe Asn65 70 75 80Asn Asp Cys Lys Leu Lys Glu Arg Ile Glu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr85 90 95Tyr Ala Ser Phe Asn Trp Gln His Asn Gly Arg Gln Met Tyr Val Ala100 105 110Leu Ash Gly Glu Gly Ala Pro Arg Arg Gly Gln Lys Thr Arg Arg Lys115 120 125Asn Thr Ser Ala His Phe Leu Pro Met Val Val His Ser130 135 140<210>147<211>3974<212>DNA<213>Homo sapiens<400>147ggtacctaag tgagtagggc gtccgatcga cggacgcctt ttttttgaat tcgtaatcat 60ggtcatagct 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1．增加血液中血小板水平的方法，包括给个体投用选自下列一组中的多肽(a)包括与SEQ ID NO:2的Arg(80)-Ser(208)至少95％相同的氨基酸序列的多肽；(b)包括与SEQ ID NO:2的Arg(80)-Ser(208)基本相同，只是其中至少有1个但不超过20个氨基酸取代的氨基酸序列的多肽；其中所说的多肽是以增加所说个体之血液中的血小板水平的有效量投用的。
2．权利要求1的方法，其中投用所说的多肽以缓解血小板减少。
3．权利要求2的方法，其中所说的血小板减少是由选自下列一组中的疾病或状况引起的药物诱导的超敏反应、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、输血后紫癜、新生儿血小板减少、骨内转移性肿瘤、再生障碍性贫血、骨髓纤维变性、白血病、微血管病性溶血性贫血、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、溶血性尿毒综合症、人工瓣膜性溶血综合症、肿瘤化疗、Zieve氏综合症、脓毒症、HELLP子痫前期综合症、由于B21和叶酸缺乏引起的巨成红细胞贫血、腹膜炎、先天性风疹综合症、HIV-1病毒感染、EB病毒感染性单核细胞增多症、系统性狼疮、子痫前期、甲状腺毒症、尿毒症和弥散性血管内凝血(DIC)。
4．增加血浆纤维蛋白原水平的方法，包括给个体投用选自下列一组中的多肽(a)包括与SEQ ID NO:2的Arg(80)-Ser(208)至少95％相同的氨基酸序列的多肽；(b)包括与SEQ ID NO:2的Arg(80)-Ser(208)基本相同，只是其中至少有1个但不超过20个氨基酸取代的氨基酸序列的多肽；其中所说的多肽是以增加血浆纤维蛋白原水平的有效量投用的。
5．权利要求4的方法，其中投用所说的多肽以缓解血纤维蛋白原过少。
6．权利要求5的方法，其中所说的血纤维蛋白原过少是由选自下列一组的疾病或状况引起的肝炎、硬化和弥散性血管内凝血(DIC)。
7．增加血清白蛋白水平的方法，包括给个体投用选自下列一组中的多肽(a)包括与SEQ ID NO:2的Arg(80)-Ser(208)至少95％相同的氨基酸序列的多肽；(b)包括与SEQ ID NO:2的Arg(80)-Ser(208)基本相同，只是其中至少有1个但不超过20个氨基酸取代的氨基酸序列的多肽；其中所说的多肽是以增加血清白蛋白水平的有效量投用的。
8．权利要求7的方法，其中投用所说的多肽以缓解血白蛋白过少。
9．权利要求8的方法，其中所说的血白蛋白过少是由选自下列一组的疾病或状况引起的出血、烧伤、渗出、风湿病、肉芽肿、细菌感染、合并有组织破坏的病毒感染、组织坏死、血管炎、溃疡性肠道疾病、浆膜炎、亚急性细菌性心内膜炎、寄生虫侵染、急性和慢性肝病、淀粉样变、营养不良、癌、充血性心力衰竭、狭窄性心包炎、心脏瓣膜病、肾病综合症、创伤和粉碎性损伤、胃肠和淋巴瘘，以及蛋白质丢失性胃肠病。
10．增加血清球蛋白水平的方法，包括给个体投用选自下列一组中的多肽(a)包括与SEQ ID NO:2的Arg(80)-Ser(208)至少95％相同的氨基酸序列的多肽；(b)包括与SEQ ID NO:2的Arg(80)-Ser(208)基本相同，只是其中至少有1个但不超过20个氨基酸取代的氨基酸序列的多肽；其中所说的多肽是以增加血清球蛋白水平的有效量投用的。
11．权利要求10的方法，其中投用所说的多肽以缓解血球蛋白过少。
12．权利要求11的方法，其中所说的血球蛋白过少是由选自下列一组中的疾病或状况引起的α-1抗胰蛋白酶缺乏、严重肝病、雌激素治疗、巨成红细胞性贫血、血丙球蛋白过少和丙球蛋白缺乏血症。
13．增加总血清蛋白质水平的方法，包括给个体投用选自下列一组中的多肽(a)包括与SEQ ID NO:2的Arg(80)-Ser(208)至少95％相同的氨基酸序列的多肽；(b)包括与SEQ ID NO:2的Arg(80)-Ser(208)基本相同，只是其中至少有1个但不超过20个氨基酸取代的氨基酸序列的多肽；其中所说的多肽是以增加总血清蛋白质水平的有效量投用的。
14．权利要求13的方法，其中投用所说的多肽以缓解总蛋白质丢失。
15．权利要求14的方法，其中所说的总血清蛋白质丢失是由选自下列一组中的疾病或状况引起的蛋白质丢失性胃肠病、急性烧伤、肾病综合症、慢性肝病、吸收不良综合症、营养不良及丙球蛋白缺乏血症。
16．减少因膀胱或前列腺上皮细胞正常增殖受到抑制而引起的损伤的方法，其包括给个体投用选自下列一组中的多肽(a)包括与SEQ ID NO:2的Arg(80)-Ser(208)至少95％相同的氨基酸序列的多肽；(b)包括与SEQ ID NO:2的Arg(80)-Ser(208)基本相同，只是其中至少有1个但不超过20个氨基酸取代的氨基酸序列的多肽；其中所说的多肽是以减少因膀胱或前列腺上皮细胞正常增殖受到抑制而引起的损伤的有效量投用的。
17．权利要求16的方法，其中膀胱或前列腺上皮细胞的正常增殖是因放射治疗或服用抗肿瘤药物而受到抑制。
18．权利要求17的方法，其中所说的抗肿瘤药物是环磷酰胺。
19．权利要求16的方法，其中所说的多肽是为防止或减少因出血性膀胱炎所引起损伤而投用的。
20．权利要求17的方法，其中所说的多肽是在进行所说的放射治疗或服用抗肿瘤药物之前投用的。
21．权利要求17的方法，其中所说的多肽是为增加膀胱荷量而投用的。
22．权利要求17的方法，其进一步包括投用有效量的Mesna。
23．刺激唾液腺细胞增殖的方法，包括给个体投用选自下列一组中的多肽(a)包括与SEQ ID NO:2的Arg(80)-Ser(208)至少95％相同的氨基酸序列的多肽；(b)包括与SEQ ID NO:2的Arg(80)-Ser(208)基本相同，只是其中至少有1个但不超过20个氨基酸取代的氨基酸序列的多肽；其中所说的多肽是以刺激唾液腺细胞增殖的有效量投用的。
24．权利要求23的方法，其中所说的多肽是以刺激下颌下腺唾液腺细胞增殖的有效量投用的。
25．权利要求23的方法，其中所说的多肽是以刺激腮腺唾液腺细胞增殖的有效量投用的。
26．权利要求23的方法，其中所说的多肽是以刺激舌下腺唾液腺细胞增殖的有效量投用的。
27．权利要求24的方法，其中所说的下颌下腺唾液腺细胞是浆液分泌细胞。
28．权利要求24的方法，其中所说的下颌下腺唾液腺细胞是粘液分泌细胞。
29．权利要求24的方法，其中所说的腮腺唾液腺细胞是浆液分泌腺泡细胞。
30．权利要求23的方法，其中所说的多肽是为治疗或减轻唾液腺功能障碍而投用的。
31．刺激泪腺细胞增殖的方法，包括给个体投用选自下列一组中的多肽(a)包括与SEQ ID NO:2的Arg(80)-Ser(208)至少95％相同的氨基酸序列的多肽；(b)包括与SEQ ID NO:2的Arg(80)-Ser(208)基本相同，只是其中至少有1个但不超过20个氨基酸取代的氨基酸序列的多肽；其中所说的多肽是以刺激泪腺细胞增殖的有效量投用的。
32．权利要求31的方法，其中所说的泪腺细胞是分泌细胞。
33．权利要求31的方法，其中所说的多肽是以治疗或减轻泪腺功能障碍的有效量投用的。
34．权利要求33的方法，其中所说的多肽是为治疗或减轻因放射治疗、自身免疫疾病、衰老、HIV感染、干燥性角结膜炎、烧伤或其他医学状况引起的泪腺功能障碍而投用的。
35．刺激窦上皮增殖的方法，包括给个体投用选自下列一组中的多肽(a)包括与SEQ ID NO:2的Arg(80)-Ser(208)至少95％相同的氨基酸序列的多肽；(b)包括与SEQ ID NO:2的Arg(80)-Ser(208)基本相同，只是其中至少有1个但不超过20个氨基酸取代的氨基酸序列的多肽；其中所说的多肽是以刺激窦上皮的有效量投用的。
36．权利要求35的方法，其中所说的多肽是以治疗或减少窦上皮损伤的有效量投用的。
37．权利要求36的方法，其中所说的多肽是为治疗或减少因外科手术、创伤或其他医学状况引起的窦上皮损伤而投用的。
38．权利要求36的方法，其中所说的多肽是为减少感染、疤痕、息肉、囊肿形成和复发而投用的。
39．刺激杯形细胞增殖的方法，包括给个体投用选自下列一组中的多肽(a)包括与SEQ ID NO:2的Arg(80)-Ser(208)至少95％相同的氨基酸序列的多肽；(b)包括与SEQ ID NO:2的Arg(80)-Ser(208)基本相同，只是其中至少有1个但不超过20个氨基酸取代的氨基酸序列的多肽；其中所说的多肽是以刺激杯形细胞增殖的有效量投用的。
40．权利要求39的方法，其中所说的杯形细胞位于鼻气通道的呼吸道上皮中。
41.权利要求39的方法，其中所说的杯形细胞是在大或小肠中。
42．权利要求39的方法，其中所说的杯形细胞是在结膜中。
43．权利要求39的方法，其中所说的多肽是为治疗或预防干燥性角结膜炎而投用的。
44．权利要求1的方法，其中所说的多肽是与医药上可接受的载体或赋形剂一起投用的。
45．权利要求1的方法，其中所说的多肽是通过选自静脉内、皮下和腹膜内的途径给药的。
46．权利要求1的方法，其中所说的多肽是(a)。
47．权利要求46的方法，其中所说的多肽包括SEQ ID NO:2的Arg(80)-Ser(208)。
48．权利要求46的方法，其中所说的多肽包括与SEQ ID NO:2的Val(77)至Ser(208)至少95％相同的氨基酸序列。
49．权利要求48的方法，其中所说的多肽包括SEQ ID NO:2的Val(77)至Ser(208)。
50．权利要求46的方法，其中所说的多肽包括与SEQ ID NO:2的Ser(69)至Ser(208)至少95％相同的氨基酸序列。
51．权利要求50的方法，其中所说的多肽包括SEQ ID NO:2的Ser(69)至Ser(208)。
52．权利要求46的方法，其中所说的多肽包括与SEQ ID NO:2的Ala(63)-Ser(208)至少95％相同的氨基酸序列。
53．权利要求52的方法，其中所说的多肽包括SEQ ID NO:2的Ala(63)-Ser(208)。
54．权利要求46的方法，其中所说的多肽包括与SEQ ID NO:2的Cys(37)-Ser(208)至少95％相同的氨基酸序列。
55．权利要求54的方法，其中所说的多肽包括SEQ ID NO:2的Cys(37)-Ser(208)。
56．权利要求46的方法，其中所说的多肽包括与SEQ ID NO:2的Thr(36)-Ser(208)至少95％相同的氨基酸序列。
57．权利要求56的方法，其中所说的多肽包括SEQ ID NO:2的Thr(36)-Ser(208)。
58．权利要求46的方法，其中所说的多肽包括与SEQ ID NO:2的Trp(2)-Ser(208)至少95％相同的氨基酸序列。
59．权利要求58的方法，其中所说的多肽包括SEQ ID NO:2的Trp(2)-Ser(208)。
60．权利要求46的方法，其中所说的多肽包括与SEQ ID NO:2的Met(1)-Ser(208)至少95％相同的氨基酸序列。
61．权利要求60的方法，其中所说的多肽包括SEQ ID NO:2的Met(1)-Ser(208)。
62．权利要求47、49、51、53、55或57的方法，其中所说的多肽在N末端具有Met残基。
63．权利要求51的方法，其中所说的多肽基本上是由SEQ ID NO:2的Ser(69)-Ser(208)组成的。
64．权利要求63的方法，其中所说的多肽在N末端具有Met残基。
65．权利要求51的方法，其中所说的多肽是由SEQ ID NO:2的Ser(69)-Ser(208)组成的。
66．权利要求51的方法，其中所说的多肽是由SEQ ID NO:96的Met(1)-Ser(141)组成的。
67．权利要求1的方法，其中所说的多肽是(b)。
68．权利要求67的方法，其中所说的取代选自下列一组取代Arg(80)Lys,Lys(87)Arg,Tyr(88)Trp,Phe(89)Tyr,Lys(91)Arg,Ser(99)Lys,Lys(102)Gln,Lys103(Glu),Glu(104)Met,Asn(105)Lys,Pro(107)Asn,Ser(109)Asn,Leu(111)Met,Thr(114)Arg,Glu(117)Ala,Val(120)Ile,Val(123)Ile,Ala(125)Gly,Ile(126)Yal,Asn(127)Glu,Asn(127)Gln,Tyr(130)Phe,Met(134)Thr,Lys(136)Glu,Lys(137)Glu,Gly(142)Ala,Ser(143)Lys,Phe(146)Ser,Asn(148)Glu,Lys(151)Asn,Leu(152)Phe,Glu(154)Gly,Glu(154)Asp,Arg(155)Leu,Glu(157)Leu,Gly(160)His,Phe(167)Ala,Asn(168)Lys,Gln(170)Thr,Arg(174)Gly,Tyr(177)Phe,Gly(182)Gln,Ala(185)Val,Ala(185)Leu,Ala(185)Ile,Arg(187)Gln(190)Lys,Lys(195)Glu,Thr(197)Lys,Ser(198)Thr,Arg(194)Glu,Arg(194)Gln,Lys(191)Glu,Lys(191)Gln,Arg(188)Glu,Arg(188)Gln,和Lys(183)Glu 。
全文摘要
本发明涉及投用角质细胞生长因子2(KGF－2)以刺激血小板增殖并增加纤维蛋白原、白蛋白、球蛋白和总血清蛋白质。此外,本发明涉及投用KGF－2以保护和治疗膀胱与前列腺。再者,本发明涉及投用KGF－2以刺激鼻、口腔和食道粘膜、泪腺、唾液腺及杯形细胞的生长。
文档编号A61K48/00GK1295579SQ99804591
公开日2001年5月16日 申请日期1999年2月12日 优先权日1998年2月13日
发明者P·吉姆尼兹, M·A·拉姆派, D·曼德里克, D·拉塞尔, A·路易 申请人:人类基因组科学公司