神经胶质细胞系源神经营养因子家族相关化合物在调节精子发生和制备雄性避孕药上的应用的制作方法

专利名称：神经胶质细胞系源神经营养因子家族相关化合物在调节精子发生和制备雄性避孕药上的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及神经胶质细胞系源神经营养因子(GDNF)家族的相关化合物的应用，所述相关化合物例如神经胶质细胞系源神经营养因子(GDNF)、GDNF样因子和/或像GDNF一样作用于它的受体和/或共同受体的其它化合物，该类化合物可用于调节和研究精子发生、阻止精细胞分化、开发雄性避孕药或作为一种雄性避孕及其可用于制造雄性避孕药组合物雄性。
背景技术：
精子发生是一系列复杂的事件，包括激素调节因子以及支持细胞与生殖细胞的局部相互作用。(Bellvé,A.R.和Zhang,W.J.,Reprod.Fertil.85,771-793(1989)；Skinner,M.K.,Endocr.Rev.12,45-72(1991)；Pescovitz,O.H.等,Trends Endocrinol.Metab.5,126-131(1994).Parvinen,M.等，J.Cell Biol.117,629-41(1992),Djakiew,D.等，Biol.Reprod.51,214-21(1994),Cancilla,B.Risbridger,G.P.,Biol.Reprod.58,1138-45(1998)；Bitgood,M.J.等，Curr.Biol.6,298-304(1996)；Zhao,G.Q.等，Genes Dev.10,1657-1669(1996)；Zhao,G.Q.等，Development 125,1103-1112(1998))。精细胞的分化或精子发生可划分为三个时期在精子发生的第一个时期，来自生殖系的未分化干细胞一精原细胞通过有丝分裂分裂并分化为精母细胞。精原细胞可以很好地抵抗各种类型的损伤，在损伤后，精子发生就开始于所述细胞。目前，仍不清楚是何种机制使精原细胞得以维持，其次，通过何种信号使它们分化成为精母细胞。精原细胞位于生精小管的边缘部分，并与支持细胞接触，支持细胞相当于生精小管的调节细胞，它属于该生物体的体细胞。
在下一个时期，精原细胞首先分化为初级精母细胞，其次分化为次级精母细胞，由此通过两次减数细胞分裂，它们的染色体成为了单倍体，其后它们就被称为精细胞。在第三个时期，精细胞成熟为精子或成熟精细胞。
黄体生成素、促卵泡激素和睾酮是精子发生最重要的激素调节因子。睾丸生精小管中的生殖系细胞并不是激素调节的直接目标，而激素调节作用是通过支持细胞来传递的。它们将激素信号转变为被认为是信号分子和生长因子的旁分泌信号，例如干细胞生长因子(c-kit配体)、胰岛素样生长因子-1和转化生长因子-β家族中的三个成员(转化生长因子-β、苯丙酸诺龙和抑制素)(BellvéA.R.和Zhang W.J.,Reprod.Fertil.85,771-793(1989)；Skinner,M.K.,Endocr.Rev.12,45-72(1991)；Pescovitz,O.H.等，Trends Endocrinol.Metab.5,126-131(1994))。全部所述配体都是由支持细胞表达，它们的受体位于生殖系的细胞中。所述调节系统的功能验证是令人吃惊的。大概是最好的精子发生中的旁分泌调节作用的实验证据是由desert hedgehog缺陷型转基因小鼠得来的(Bitgood,M.J.等，Curr.Biol.6,298-304(1996))。Desert hedgehog是一个在支持细胞中表达的信号分子。其结合(patched)受体位于睾丸间质细胞，即睾丸中生成睾酮的间质细胞。如果缺失desert hedgehog分子，就会造成精子的分化停止、不生成精细胞以及雄性小鼠全部不育。
生精细胞同样也会将信号回馈到支持细胞(BellvéA.R.和ZhangW.J.,Reprod.Fertil.85,771-793(1989)；Skinner,M.K.,Endocr.Rev.12,45-72(1991)；Pescovitz,O.H.等，Trends Endocrinol.Metab.5,126-131(1994))。通过以下事实举例表明了这一点神经生长因子和成纤维细胞生长因子-1都在生殖系的细胞中表达，而p75神经生长因子受体和成纤维细胞生长因子受体则位于支持细胞中。同样也存在精子发生中自分泌调节作用的线索。骨形成蛋白8a、8b和它们的受体都在同一生精细胞中表达(Zhao,G.Q.等，Gene Dev.10,1657-1669(1996)；Zhao,G.Q.等，Dev.125,1103-1112(1998))。目前仍然缺少自分泌调节作用的功能性证据。
神经胶质细胞系源神经营养因子(GDNF)是转化生长因子-β超家族中的一员(Lin,L.F.等，Science 260,1130-1132(1993))。GDNF在神经系统中维持多巴胺能神经元、去甲肾上腺素能神经元、胆碱能神经元和运动神经元，并保护外周副交感睫状神经细胞和外周副交感感觉神经细胞(Lin,L.F.等，Neural Notes.2,3-7,(1996))。在哺乳动物的发育过程中，GDNF在其它组织中也有表达，例如胚肾和睾丸(Suvanto,P.等，European Journal of Neuroscience 8,816-822(1996)；Trupp M等，Journal of Cell Biology 130,137-148,(1996))。在小鼠中利用基因剔除或基因缺失技术已经表明了GDNF是肾分化的一个调节因子(Pichel,J.G.等，Nature 382,73-75(1996))。由于该小鼠刚出生就死了，而且GDNF在精子发生中发挥作用开始地比较晚，只在出生后才发挥作用，因此不可能利用所述基因缺失模型或其它实验模型来研究GDNF在精子发生中的作用。
利用不同模型系统的研究表明，有许多方法可以干扰精子发生、开发雄性避孕药。迄今为止，表明这些方法对于雄性受治疗者都有严重的副作用。因此，亟待解决的问题是从众多激素生长调节因子中选择一个能够有效、特异性地靶向睾丸的因子，并同时提供一个无有害副作用的精子发生调节系统，该系统也不消极干扰雄性交配活动。
本发明人在进行将人GDNF掺入转基因小鼠睾丸的研究时，解决了这个问题。已经表明，具有提高水平的人GDNF的小鼠能够交配但不能够使雌鼠受精。因此，解决问题的方法就是利用本发明权利要求书中确定的神经胶质细胞系源神经营养因子家族相关化合物来调节精子发生、和阻止或防止精子发生，从而导致不育，并作为制造可用作雄性避孕药的组合物的活性成分，它们既有效也无严重副作用。
因此，本发明的第一个目的是将GDNF家族相关化合物用作雄性避孕药从而提供一种没有严重的、不希望有的副作用的雄性避孕药。
本发明的另一个目的是将GDNF家族相关化合物用作制造可用作雄性避孕药的组合物的活性成分。
本发明的再一个目的是提供调节和研究精子发生的工具。这是通过阻止精细胞分化来实现的。
本发明的第三个目的是提供一种对于由于精细胞分化受干扰而导致的不育有一定的作用的工具。
本发明的目的也是提供一种即可用于调节和研究精子发生、又可用于阻止精细胞分化的工具。
本发明的更进一步目的是提供转基因动物，特别是小鼠，从而由于GDNF家族相关化合物靶向睾丸而为研究精子发生提供一种有用的工具。
发明概要本发明的特征在权利说明书中明确了。本发明描述了一种方法，由此有可能研究由于精细胞的分化受干扰而导致的不育，其次在避孕意义上提供一种阻止精细胞分化的系统，由此导致雄性(雄性)不育。携带GDNF-转基因的转基因小鼠品系-GDNF t-小鼠品系，是一个由于精细胞分化障碍而引起的不育模型。它的特征在于GDNF适合于作为一种雄性避孕药，而像所述GDNF一样作用于另外cRet受体的化合物、另外的GDNF-受体活化化合物或者是活化精原细胞中cRet受体信号传递途径(signal transmitting tubules)的化合物也同样适合；它的特征还在于GDNF t-小鼠模型适合于作为研究精子发生中的调节作用和精子发生的动物模型。
附图简述

图1a表示3周龄野生型小鼠的睾丸形态。刻度100μm。
图1b表示3周龄转基因型小鼠的睾丸形态。刻度100μm。指示出未分化精原细胞成成的细胞簇。
图1c表示8周龄野生型小鼠的睾丸形态。刻度100μm。
图1d表示8周龄转基因型小鼠的睾丸形态。在d图中指示出在幼鼠中丰富的精原细胞簇的残留物。刻度100μm。
图1e表示6月龄野生型小鼠的睾丸形态。刻度100μm。
图1f表示6月龄转基因型小鼠的睾丸形态。表明了晚期生殖细胞萎缩和间质细胞增生(星号)。刻度100μm。
图1g表示8周龄野生型小鼠附睾管的睾丸形态。刻度100μm。
图1h表示8周龄转基因型小鼠附睾管的睾丸形态。刻度100μm。
图2a表示不同年龄野生型小鼠中GDNF mRNA的RNA印迹。出生后1周或2周后，GDNF水平强烈下调。
图2b表示不同年龄野生型小鼠睾丸中Ret mRNA的RNA印迹。出生后1周或2周后，GDNF mRNA水平强烈下调。
图2c表示不同年龄野生型小鼠中GFRα1 mRNA的RNA印迹。出生后1周或2周后，GFRα1 mRNA水平强烈下调。
图2d表示不同年龄转基因型小鼠睾丸中GDNF mRNA的RNA印迹。出生后1周或2周后，hGDNF仍然保持高水平。
图2e表示不同年龄转基因型小鼠睾丸中Ret mRNA的RNA印迹。
图2f表示不同年龄转基因型小鼠睾丸中GFRα1 mRNA的RNA印迹。在所有分析的年龄段内，转基因型小鼠中GFRα1 mRNA的水平高。
图2g描述了3周龄和6周龄野生型(WT)和转基因型(TG)小鼠睾丸中GDNF的免疫沉淀。在野生型小鼠的睾丸中检测不到GDNF蛋白。右边显示出的25ng重组人GDNF蛋白作为对照。
图3a表示通过cRNA原位杂交显示出GDNF转录物在野生型(WT)小鼠睾丸中的分布。有义对照未显示出高于背景的颗粒密度。1周龄野生型小鼠睾丸。刻度100μm。
图3b表示通过cRNA原位杂交显示出GDNF转录物在8周龄野生型(WT)小鼠睾丸中的分布。有义对照未显示出高于背景的颗粒密度。刻度100μm。
图3c表示通过cRNA原位杂交显示出GDNF转录物在8周龄转基因型(TG)小鼠睾丸中的分布。有义对照未显示出高于背景的颗粒密度。8周龄转基因型小鼠睾丸。注意到转基因型小鼠的精原细胞持续高水平表达人GDNF，但这些细胞的数量在8周龄时明显减少了。刻度100μm。
图3d表示通过cRNA原位杂交显示出Ret转录物在野生型(WT)小鼠睾丸中的分布。2周龄野生型小鼠睾丸。在2周龄时，Ret的表达位于生精小管基底层的一些精原细胞(箭头所指)。
图3e表示通过cRNA原位杂交显示出Ret转录物在野生型(WT)小鼠睾丸中的分布。8周龄野生型小鼠睾丸。在8周龄时，Ret既在某些精原细胞中表达，也在某些精细胞中表达。
图3f表示通过cRNA原位杂交显示出Ret转录物在转基因型(TG)小鼠睾丸中的分布。8周龄转基因型小鼠睾丸。注意到转基因型小鼠的精原细胞持续高水平表达Ret，但这些细胞的数量在8周龄时明显减少了。在转基因型小鼠中，Ret是在精原细胞簇中表达的。刻度100μm。
图3g表示GFRα1转录物在野生型(WT)小鼠睾丸中的分布。1至2周龄野生型小鼠睾丸。GFRα1是由一些形态上类似于那些表达Ret的精原细胞所表达的(箭头所指)。
图3h表示通过cRNA原位杂交显示出GFRα1转录物在野生型(WT)小鼠睾丸中的分布。8周龄野生型小鼠睾丸。GFRα1 mRNA的分布与Ret mRNA的分布一样，但精母细胞也高水平表达GFRα1。刻度100μm。
图3i表示通过cRNA原位杂交显示出GFRα1转录物在转基因型(TG)小鼠睾丸中的分布。8周龄转基因型小鼠睾丸。注意到转基因型小鼠的精原细胞持续高水平表达人GDNF，但这些细胞的数量在8周龄时明显减少了。在转基因型小鼠中，GFRα1是在精原细胞簇中表达的。刻度100μm。
图4a表示野生型小鼠睾丸中的细胞增殖。在3周龄野生型小鼠的睾丸中，只在野生型小鼠生精小管的边缘部分可看到BrdU标记的S期细胞。注意到在生精小管的一些横切片上缺乏标记，这反映出精子发生中S期细胞的节段分布(星号)。刻度100μm。
图4b表示转基因型小鼠睾丸中的细胞增殖。在3周龄转基因型小鼠的睾丸中，在生精小管的腔区可看到许多BrdU标记的细胞，这反映了精原细胞的异常分布(箭头所指)。在转基因型小鼠生精小管中看不到S期细胞的节段分布。刻度100μm。
图4c表示野生型小鼠睾丸中和转基因型小鼠睾丸中细胞系增殖指数的分布。在100个野生型小鼠和转基因型小鼠生精小管横切片中，计数了BrdU标记的细胞数/100个精原细胞。
图4d表示野生型小鼠睾丸中的编程性细胞死亡。在4周龄小鼠睾丸中编程性细胞死亡的TUNEL标记。只能看到少量的编程性细胞死亡细胞。刻度(c)100μm。
图4e表示转基因型小鼠睾丸中的编程性细胞死亡。在4周龄小鼠睾丸中编程性细胞死亡的TUNEL标记。注意到与野生型(图4d)小鼠生精小管相比，在(图4e)精原细胞簇中标记的细胞数增加了。刻度100μm。
图4f表示野生型小鼠和转基因型小鼠生精小管的活体形态。生精小管的活体标本来自15周龄的野生型(WT)小鼠和转基因型(TG)小鼠。注意到了转基因型小鼠生精小管的直径减小以及它周围的睾丸间质细胞(箭头所指)增加。刻度200μm。
图4g表示转基因型小鼠睾丸的活体形态。高倍放大未固定压片标本中来自转基因型小鼠生精小管的活体细胞，显示出在支持细胞中(箭头)存在大量的死细胞(箭头所指)，其中一些类似于A型精原细胞。刻度100μm。
发明详述定义在本发明中使用的名词具有它们在生物化学、药理学、重组DNA技术领域，其中包括转基因动物的制备中通常所含有的意思，但是其中一些词用到了比在正常范围稍微偏离或更广的意思。总而言之，为了避免由这些带有不清晰意思的名词所造成的不确定性，下面更详细地定义了一些在本说明书和权利要求书中用到的名词。
名词“神经胶质细胞系源神经营养因子(GDNF)家族相关化合物”即GDNF家族相关化合物包括神经胶质细胞系源神经营养因子(GDNF)、neurturin、persephin、artemin和其它相似的生长因子，也包括对GDNF受体或共同受体的作用与GDNF样化合物相同的其它化合物。所述受体或共同受体分别包括Ret酪氨酸激酶和GDNF家族受体αs。
名词“神经胶质细胞系源神经营养因子(GDNF)”是指作为转化生长因子-β家族中一员的神经胶质细胞系源神经营养因子(GDNF)(Lin,L.F.等，Science 260,1130-1132(1993))。GDNF在神经系统中维持多巴胺能神经元、去甲肾上腺素能神经元、胆碱能神经元和运动神经元，并保护外周副交感睫状神经细胞和外周副交感感觉神经细胞(Lin,L.F.等，Neural Notes.2,3-7,(1996))。在哺乳动物的发育过程中，GDNF在其它组织中也有表达，例如胚肾和睾丸(Suvanto,P.等，European Journal of Neuroscience 8,816-822(1996)；Trupp M等，Journal of Cell Biology 130,137-148,(1996))。Lin,L.F.等已经揭示出了它的特性、结构和氨基酸序列(Science 260,1130-1132(1993))。所述蛋白是由GDNF cDNA序列表征的基因编码的，该序列存储于基因库中，存储号是L15306。
名词“GDNF样因子”或GDNF样化合物是指具有相似结构或是作用类似于GDNF作用于它的受体或共同受体的生长因子。名词“GDNF样因子”或“GDNF样化合物”尤其是与三种GDNF样生长因子有关，它们是persephin、artemin和neurturin，在以下文献中有报道(Milbrandt,J.等，Neuron 20,1-20(1998)；Kotzbauer P.T.等，Nature384,467-470(1996))。
GDNF家族的所有四种生长因子在结构上是相似的，cRet受体酪氨酸激酶(Durbec,P.等，Nature 381,789-793(1996)；Buj-Bello,A.等，Nature 387,721-724,(1997))的作用是作为GDNF、artemin、persephin和neurturin的共同信号传递受体。
名词“作用类似于所述GDNF的化合物”是指类似于GDNF作用于传递GDNF信号的受体或其共同受体的化合物。
名词“受体”是指GDNF家族结合物质，即属于GDNF家族相关化合物的物质或化合物，它们能够传递GDNF家族相关化合物的信号。名词“受体”尤其是指GDNF家族信号中介受体就是cRet受体酪氨酸激酶。
名词“共同受体”是指不传递GDNF家族相关化合物的信号、但活化传递GDNF家族相关化合物信号受体的受体。这些化合物最重要的是GDNF家族受体αs(GFRα)，这是一类新的受体，它的成员都称为GDNF家族受体αs(GFRα)。它们也属于GDNF、persephin、aretmin和neurturin信号受体复合物。目前已经了解了所述家族的4个成员(GFRα1-4)(Jing,S.等，Cell 85,9-10(1996)；Jing,S.Q.等，J.Biol.Chem.272,33111-33117(1997)；Treanor,J.J.等，Nature.382,80-83,(1996)；Suvanto,P.等，Human Molecular.Genetics.6,1267-1273,(1997))。它们可以独立传递信号，但它们对于配体结合和cRet活化而言是必不可少的。
名词“阻止精细胞分化、调节精子发生和由于干扰精细胞分化而导致不育或使得雄性不能够使雌性受精的GDNF家族相关化合物的浓度”是指GDNF家族相关化合物的浓度，该浓度比在所述雄性睾丸中内源GDNF的浓度高出约50-5000倍、优选为50-500倍、最优选为50-100倍。可以从测量RNA印迹中显现出的转基因型小鼠的GDNF mRNA水平时(图2)获得的检测结果中计算出所述浓度，它表明了mRNA的量增加了，并从中可以计算出表达的蛋白水平。从这些结果中可以得出结论，在3-6周龄的小鼠中，转基因型小鼠的GDNF浓度高出内源水平50-500倍，但在新生小鼠中，只高出一点，在3-6周龄时GDNF水平在最高水平，而且没有出现精子发生。根据这些结果，那些本领域技术人员有可能计算出在男性中获得预期效果所需的量。
名词“衍生物”是指GDNF家族相关化合物的同分异构体。它也包括根据GDNF、persephin、neurturin和artemin化合物结构构建的杂交分子，以及所述化合物的截短形式、复合物和片段。成为所述化合物的唯一先决条件是它们仍然具有与上面所列化合物大致相同的特性和作用，并能够用本发明中所述的同样方法所鉴定。当然，名词“衍生物”在更常规意义上来说包括上面所列化合物的衍生物，例如所列化合物的游离基团，如羧基、氨基和/或羟基等可以通过烷基化反应、酯化反应、醚化反应和酰胺化反应例如用烷基取代，所述烷基包括甲基、乙基和丙基。这种情况下的唯一先决条件也是这种取代基本上不改变本段前面列出的所述分子或化合物的特性或作用。
发明综述神经胶质细胞系源神经营养因子(GDNF)是一个各类神经细胞的强效存活因子，它调节肾脏的分化(Lin,L.F.等，Science 260,1130-1132(1993)；Tomac,A.等，Nature 373,335-339(1995)；Winkler,C.等，J.Neurosci.16,7206-7215(1996),Oppenheim,R.W.等，Nature 373,344-346(1995),Nguyen,Q.T.等，Science 279,1725-1729(1998)；Trupp,M.等，J.Cell Biol.130,137-148(1995)；Hellmich,H.L.等，Mech.Dev.54,95-105(1996)；Schuchardt,A.等，Nature 367,380-383(1994)；Pichel,J.G.等，Nature 382,73-75(1996))并在睾丸中表达(Trupp,M.等，J.CellBiol.130,137-148(1995)；Hellmich,H.L.等，Mech.Dev.54,95-105(1996)；Suvanto,P.等，European Journal of Neuroscience 8,816-822(1996))，然而仍然不清楚它作用于何处。
GDNF是转化生长因子-β(TGF-β)超级家族的远缘成员(Lin,L.F.等，Science 260,1130-1132(1993))，它是黑质多巴胺能神经元和一些中枢神经及外周神经系统的其它类神经元的强效存活因子(Lin,L.F.等，Science 260,1130-1132(1993)；Tomac,A.等，Nature 373,335-339(1995)；Winkler,C.等，J.Neurosci.16,7206-7215(1996),Oppenheim,R.W.等，Nature 373,344-346(1995),Nguyen,Q.T.等，Science 279,1725-1729(1998)；Trupp,M.等，J.Cell Biol.130,137-148(1995)；Hellmich,H.L.等，Mech.Dev.54,95-105(1996)；Schuchardt,A.等，Nature 367,380-383(1994)；Pichel,J.G.等，Nature 382,73-75(1996))。在肾脏形态发生中,GDNF也作为一个输尿管分支中的信号分子(Schuchardt,A.等，Nature 367,380-383(1994)；Pichel,J.G.等，Nature 382,73-75(1996))。它是由一些神经元和非神经元胚胎器官，包括胚胎睾丸和出生后睾丸合成的(Trupp,M.等，J.Cell Biol.130,137-148(1995)；Hellmich,H.L.等，Mech.Dev.54,95-105(1996)；Suvanto,P.等，European Journal ofNeuroscience 8,816-822(1996))。GDNF的信号受体复合物包括Ret受体酪氨酸激酶(Durbec,P.等，Nature 381,789-793(1996)；Trupp,M.等，Nature 381,785-789(1996))、连接糖基磷脂酰激酶的共同受体中的一员-GDNF家族受体αs(GFRα1-4)(Jing,S.等，Cell 85,9-10(1996)；Jing,S.Q.等，J.Biol.Chem.272,33111-33117(1997)；Enokido,Y.等，Curr.Biol.18,1019-1022(1998))。GDNF无效小鼠、GFRα1无效小鼠和Ret无效小鼠展现出异常相似的表型肾缺乏或肾发育不全以及在肠神经分布上严重缺陷(Schuchardt,A.等，Nature 367,380-383(1994)；Pichel,J.G.等，Nature 382,73-75(1996))。由于这些突变体小鼠在出生后第1天就死去，因此无法在它们身上进行精子发生的分析。
为了探讨GDNF在精子发生中的作用，本发明人研究了靶向睾丸生殖细胞中超表达GDNF的转基因鼠。雄性转基因鼠不育，并在生精细胞-A型精原细胞的分化中表现出了早期停滞。它们在生精小管中形成细胞簇，最后导致睾丸萎缩。获得的数据表明了GDNF在早期精子发生期间具有作为一种旁分泌抑制信号的新功能。
在野生型小鼠中，认为GDNF调节精原细胞集合体(pool)并逐步被提交给精子分化。这些不育转基因型小鼠被用于雄性生精缺陷不育症的模型。活化GDNF信号级联有可能为我们提供一种开发男性避孕药的方法。当把GDNF样分子用于神经变性性病症如帕金森氏病的临床治疗时，当然也要把GDNF对精子发生的作用考虑在内。
在高表达人GDNF的研究转基因型小鼠时，我们发现了GDNF的一种新功能，这种高表达是利用了人翻译延伸因子-1(EF-1)启动子(Mizushima,S.和Nagata,S.,Nucleic Acids Res.18,5322(1990))，该启动子靶向睾丸生殖细胞进行转基因特异性表达(Furuchi,T.等，Development 122,1703-1709(1996))。在靶向高表达GDNF的转基因型小鼠睾丸中的精子发生有障碍，表明GDNF是做为精原细胞分化的一个局部抑制信号。转基因型小鼠的生殖细胞逐步退化、睾丸间质细胞增生很明显对于精子发生缺陷是次生的，因为支持细胞清除分化不良的生殖细胞和异常的生殖细胞，而且各型细胞间的相互作用被破坏了。因此，GDNF靶向睾丸提供了一个新的雄性不育动物模型。由GDNF、Ret激动剂或下游物质引起的GDNF信号级联的活化，有可能为我们提供一种方法，由此阻止雄性精子生成并开发雄性避孕药。当设计GDNF样因子并将其用于神经变性性病症如帕金森氏病的临床试验时，当然也要把GDNF对精子发生的作用考虑在内。
为了研究GDNF在睾丸中的功能，本发明人培育了超表达人GDNF的转基因型小鼠，这种超表达利用了靶向睾丸生殖细胞进行转基因特异性表达(Furuchi,T.等，Development 122,1703-1709(1996))的人翻译延伸因子-1(EF-1)启动子(Mizushima,S.和Nagata,S.,NucleicAcids Res.18,5322(1990))。同样也可利用其它靶向睾丸生殖细胞进行转基因特异性表达的启动子。我们分析了4个独立的转基因型建立者，2个雄性C10、C12和2个雌性S6、E19，它们所携带的转基因拷贝数分别是10、3、20和4。雄性建立者C10和C12是不育的，而且进一步用2个雌性建立者S6和E19子代分析了雄性表型。转基因型小鼠正常地发育到成年，并具有相类似的表型。它们的体重正常，而且除睾丸外的实质器官的重量和形态没有缺陷(数据未列出)。小鼠4周龄大后，与野生型对照组相比，发现转基因型小鼠睾丸的重量下降了(表1)。雌性建立者S6和E19的子代中所有转基因型雄性均不育。在连续6个月的繁殖期内，每隔3至4天就把3只转基因型雄鼠与野生型FVB和NMRI雌鼠关在同一个笼中。通过呈现阴道塞表明野生型雌鼠与转基因型雄鼠以正常频率交配，但未有一只雌鼠怀孕。另外20只繁殖期内的转基因型雄鼠与野生型FVB和NMRI雌鼠进行了短期繁殖试验。在2周的连续繁殖期内，来自2个品系的约200只雌鼠进行了交配，但未有一只怀孕。通过转基因型FVB小鼠与NMRI小鼠进行杂交繁殖，排除了不育表型的品系依赖性。像FVB品系的转基因型雄鼠一样，它们的F1代也是不育的。
已经表明1周龄转基因型小鼠的睾丸组织学是正常的。来自2-3周龄小鼠(图1a、1b)的结果表明，在形态上类似于A型精原细胞的细胞簇从生精小管的基底膜部分脱落。在随后的几周内，这些细胞经过逐步退化，导致在10周时，生精小管的支持细胞已经显示出进一步的严重萎缩，而只剩余精原细胞(图1c-1f)。从出生后第4周开始睾丸的间质细胞-Leydig细胞逐渐增生(图1d、1f)。精原细胞簇外的偶尔几个生殖细胞会进一步发育为精母细胞，但很少会发育成精细胞，它们在减数分裂后停滞并退化。虽然在将精子从睾丸传导至附睾的输出小管中未发现阻塞，但在生精小管或附睾管中也未发现成熟精子(图1g、1h)。
通过各种年龄的野生型小鼠和转基因型小鼠睾丸的RNA印迹测定，也表明在转基因型小鼠中的鼠GDNF的mRNA、人GDNF的mRNA和所述GDNF受体的mRNA水平都提高了(图2)。在野生型小鼠睾丸中，出生和出生后第一周时，GDNF、Ret和GFRα1转录物都是高表达的(图2a-c)。青春期开始前不久(在2周龄时)，GDNF的mRNA是严重下调的(图2a)。与此同时，Ret mRNA(图2b)和GFRα1 mRNA(图2c)水平也下降了，但仍然能够在成鼠睾丸中检测到。4#artemin(ART)结合GFRα3，而且也是通过Ret传递信号的。
Neurturin(NTN)是同GDNF一样利用相同的多组分受体复合物的GDNF相关分子，但优选GFRα1的同系物GFRα2作为共同(Klein,R.D.等，Nature 387,717-721(1997))。NTN和GFRα2转录物均由出生后小鼠的睾丸表达(Widenfalk,J.等，J.Neurosci.17,8506-8519(1997))，然而在青春期后会优先表达。GDNF家族的第3个成员一persephin(Milbrandt,J.et al.,Neuron 20,1-20(1998))结合鸡GFRα4(Enokido,Y.等，Curr.Biol.18,1019-1022(1998))，到目前为止，在哺乳动物中还未发现鸡GFRα4的同系物。
用人GDNF mRNA特异性探针进行的RNA印迹表明，转基因只在睾丸中表达，而在雌性、雄性的其它器官中不进行表达，所述其它器官如卵巢、阴茎、脑、肝、肾、肺和皮肤(数据未列出)。与野生型小鼠的GDNF mRNA水平下降相比，转基因型小鼠从新生到成年，它的睾丸的GDNF mRNA的表达水平仍然保持高水平(图2d)。此外，Ret和GFRα1 mRNA在所有分析过的年龄阶段中，都保持高水平(图2e、2f)。3周龄和6周龄野生型小鼠和转基因型小鼠睾丸的GDNF的免疫沉淀，证实与野生型小鼠睾丸相比，转基因型小鼠睾丸的GDNF蛋白水平高度增长(图2g)。
先前，已经表明胚胎睾丸支持细胞和睾丸支持细胞谱系表达GDNF(Hellmich,H.L.等，Mech.Dev.54,95-105(1996)；Trupp,M.等，J.Cell Biology 130,138-148(1995))。出生后第一周内，通过原位杂交，在野生型小鼠的生精小管中可检测GDNF mRNA，但之后就检测不到了(图3a、3b),GDNF mRNA的标记分布在睾丸支持细胞上，从2周龄到成年期，转基因型小鼠睾丸显示出A型精原细胞簇持续并高水平表达人GDNF mRNA(图3c)。Ret mRNA由野生型小鼠睾丸的精原细胞和精细胞(图3d、3e)以及转基因型小鼠睾丸的精原细胞簇(图3f)表达。GFRα1 mRNA由野生型小鼠睾丸的精原细胞、精母细胞和周围的精细胞表达(图3g、3h)，并由转基因型小鼠睾丸的精原细胞簇集中表达(图3i)。因此，GDNF的信号受体复合物存在于野生型小鼠和转基因型小鼠的精原细胞中。在野生型小鼠中，GDNF很明显是作为源于睾丸支持细胞的精子发生的旁分泌调节因子，但在转基因型小鼠中，这种调节被生殖细胞持续的自分泌表达GDNF所破坏。
精原细胞睾丸中仅有的增生性生殖细胞，在正常生精小管中的有丝分裂活动是高度节段化的(图4a)。在转基因型小鼠中，BrdU标记的精原细胞在生精小管中呈现出异常分布，这表明精原细胞在生精小管腔中形成团簇(图4b)。由于野生型小鼠睾丸中细胞增生的高度节段性，因此很难比较野生型小鼠睾丸和转基因型小鼠睾丸的净增生率，然而，转基因型小鼠的精原细胞的最高细胞增生指数(BrdU标记的细胞核数/100个精原细胞)比野生型小鼠明显下降，分别为0.26+/-0.11(n=714)和0.72+/-0.14(n=436个细胞，由生精小管的增生节段计数的)(图3c)。
通过TUNEL标记显示，从出生后第2周开始，在精原细胞簇和其它分化不良的生殖细胞中编程性细胞死亡非常显著(图4d、4e)。其中有一些类似于A型精原细胞的大量死亡细胞都被睾丸支持细胞吞食和吞噬性清除了(图4f、4g)。因此，可以用增加的编程性细胞死亡超过了细胞增生来解释GDNF超表达小鼠中睾丸的逐步萎缩。另一方面，幼鼠中精原细胞的积聚似乎是由于阻断了它们的分化而引起的，而不是因为增强了细胞增生。
跟踪观察3只GDNF超表达雄性小鼠5个月，在这段时间内，都未发现肉眼可见的睾丸肿瘤或是微观侵入的癌细胞。而且，我们在对雄性幼鼠进行尸体剖检时(n=103)，未发现睾丸恶性肿瘤，这表明GDNF超表达小鼠精原细胞的分化缺陷并未最终导致生殖系恶性肿瘤，但造成了睾丸萎缩。然而，应该在长时间内跟踪观察更多的小鼠以避免任何睾丸癌增加的风险。
通过喂养雄性小鼠和大鼠维生素A缺乏(VAD)的食物表明，它们由于缺乏维生素A代谢物、视黄酸(RA)而不育。A型精原细胞的分化完全被VAD食物所阻断，并可通过重新施用维生素A或它的活性代谢物而恢复(Kim,K.H.等，Molec.Endocrinology 4:1679-1688,(1990))。视黄酸受体a(RARα)的mRNA和蛋白质水平因VAD食物而下降了(Akmal,K.等，Endocrinology 139,1239-1248,(1998))。所以，RARα缺乏的转基因型小鼠是不育的，并呈现出睾丸萎缩(Lufkin,T.等，Devel.Biol 90,7225-7229,(1993))。因此，在野生型小鼠和GDNF超表达转基因型小鼠中分析了RAR蛋白的表达情况。通过用抗RAR蛋白抗体的间接免疫过氧化物酶染色显示出，在转基因型小鼠的精原细胞簇中RAR的表达实际上消失了。这些数据表明，GDNF作为精原细胞的一个负调节因子的其中一个机制就是在表达Ret的精原细胞中下调RAR的表达。
为了分析GDNF家族的其它成员是否也是作为精子发生的负调节因子，本发明人构建了在睾丸中超表达neurturin的转基因型小鼠。通过超表达GDNF小鼠进行交配实验相同的交配实验显示出，在靶向睾丸中进行转基因特异性表达的翻译延伸因子1α启动子的作用下表达neurturin的转基因型小鼠在青春期后的前4周内也是不育的。
哺乳动物的精子分化可被划分为3个独立的阶段，并受局部细胞间相互作用和激素控制的调节(Russell,L.D.等，Histological andhistopathological evaluation ofthe testes.Clearwater,F.L.,Cache River,第1-40页(1990))。精子发生的第一个阶段是有丝分裂期，在这个阶段精原细胞发育为精母细胞。在精原细胞阶段之外，进行精子发生而没有细胞有丝分裂。精原细胞进一步分类为各种亚型，这其中的A型精原细胞亚型包括精子发生干细胞。第二个阶段是精母细胞的减数分裂期，产生单倍体精细胞。第三个阶段是精子发生期，在这个阶段精细胞转化为精子、成熟精细胞，在结构上为精子到达卵细胞和使卵细胞受精做好了准备。在有丝分裂期，A型精原细胞增殖并被触发进行分化。然而，其中一些A型精原细胞仍然未分化，而被认为是作为干细胞的储存(Russell,L.D.等，Histological and histopathological evaluationof the testes.Clearwater,F.L.,Cache River，第1-40页(1990))。通过何种精确机制干细胞得以维持或转化为分化性精原细胞的问题至今仍未解决。RNA印迹显示出在正常小鼠和GDNF超表达小鼠中，GDNF的下调作用与精子分化的起始同时发生，精原细胞分化停滞。因此，局部的GDNF信号传递对于精原细胞维持在未分化阶段也许是必需的。
越来越多的证据表明，精子发生的每一步都需要身体支持细胞和生殖细胞间的旁分泌相互作用，这些相互作用可能由生长因子和它们的受体调节介导(BellvéA.R和Zhang W.J.,Reprod.Fertil.85,771-793(1989)；Skinner,M.K.,Endocr.Rev.12,45-72(1991)；Pescovitz,O.H.等，Trends Endocrinol.Metab.5,126-131(1994).Parvinen,M.等，J.CellBiol.117,629-41(1992),Djakiew,D.等，Biol.Reprod.51,214-21(1994),Cancilla,B.和Risbridger,G.P.,Biol.Reprod.58,1138-45(1998)；Bitgood,M.J.等，Curr.Biol.6,298-304(1996)；Zhao,G.Q.等，GenesDev.10,1657-1669(1996)；Zhao,G.Q.等，Development 125,1103-1112(1998))。然而，仍然缺乏与睾丸体细胞和生殖细胞间细胞通讯有关的直接功能性数据。支持细胞与生殖细胞间的相互作用可能包括许多分子，例如干细胞生长因子(c-kit配体)、胰岛素样生长因子-I、TGF-β家族的三个因子(苗勒氏抑制物、苯丙酸诺龙和抑制素)和转铁蛋白(Pescovitz,O.H.等，Trends Endocrinol.Metab.5,126-131(1994))。支持细胞分泌所有这些分子，而生殖细胞具有它们的受体。相反，支持细胞表达生殖细胞所分泌配体的受体。例如，它表达p75神经生长因子受体和成纤维细胞生长因子受体，它们的相关配体是由睾丸生殖细胞分泌的(Pescovitz,O.H.等，Trends Endocrinol.Metab.5,126-131(1994)；Parvinen,M.等，J.Cell Biol.117,629-41(1992),Djakiew,D.等，Biol.Reprod.51,214-21(1994))。此外，支持细胞也与间质细胞相互作用。Desert hedgehog(Dhh)基因是由支持细胞表达的，它的推断受体主要是由间质细胞修补的(patched)(Bitgood,M.J.等，Curr.Biol.6,298-304(1996))。实际上,Dhh无效小鼠呈现出严重的精子发生分化缺陷(Bitgood,M.J.等，Curr.Biol.6,298-304(1996))。最近，在生殖细胞中发现了骨形成蛋白8a和8b以及它们的推断受体，这些配体的失活导致异常的精子发生和雄性不育(Zhao,G.Q.等，Genes Dev.10,1657-1669(1996)；Zhao,G.Q.等，Development 125,1103-1112(1998))。在生殖细胞中，那些生长因子和它们的受体的共同定位表明了生殖细胞的一种自分泌调节作用。
我们的数据证实了GDNF的一个新功能。在靶向的超表达GDNF的转基因型小鼠睾丸中的精子发生受到干扰表明，在精原细胞分化中GDNF是作为一个局部抑制信号。转基因型小鼠睾丸的逐步萎缩和间质细胞的异常增生对于精子发生缺陷是次生的。因此，将GDNF靶向睾丸就为雄性不育提供了一个新的动物模型。由GDNF、Ret激动剂或是下游物质活化GDNF信号级联可能为我们提供了阻止男性精子发生和开发雄性避孕药的方法。当设计GDNF样因子并将其用于神经变性性病症如帕金森氏病的临床试验时，当然也要把GDNF对精子发生的作用考虑在内。
在下面的实验部分更详细描述了本发明，实验部分公开了用于制备转基因型小鼠的材料和方法以及用于论证GDNF在动物模型中的作用的实验。但并不应当认为所述实验部分限制了本发明的范围。那些本领域的技术人员能够预见到建立在从以下实验部分得来的结果基础上的广泛的不同应用。
方法构建GDNF转基因和培育转基因型小鼠通过用整个的人GDNF cDNA编码序列(基因库存储号L15306)取代xbaⅠ-xbaⅠ填充片段，就把人GDNF cDNA克隆到带有EF1α启动子(Migushima,S.和Nagata,S.,Nucleic Acid Res.18,5322(1990))的pEF-BOS载体中。表达结成物的正确性可通过进行序列测定而得到证实。用所述构成物正确表达GDNF蛋白可通过Cos细胞转染，然后免疫沉淀来自溶胞产物和培养上清液的GDNF而得到证实。通过所记载的方法，将2.7kb的GDNF cDNA构成物的PvuⅠ-HindⅢ片段显微注射到新受精的FVB近亲杂交小鼠卵细胞的前核中(Hogan,B.等，Manipul ating the Mouse Embryo.Cold Spring Harbor,NY:Cold SpringHarbor Laboratory Press(1994))，可以培育转基因型小鼠。通过人GDNF cDNA的DNA印迹来确认建立者，以及通过尾部DNA的PCR来确认转基因阳性小鼠的子代。人GDNF的引物来自外显子1(5’-TGTCGT GGC TGT CTG CCT GGT GC-3’)和外显子2(5’-AAG GCG ATGGGT CTG CAA CAT GCC-3’)。组织学、细胞增殖和编程性细胞死亡关于组织学，将新解剖的睾丸和附睾混合到布安氏混合液中或是4％PFA中，并根据数量多少混合2-24小时，然后包埋在石蜡中，切片，厚度7μm，再经过苏木精/曙红染色。对于细胞增殖检测，将在PBS液中浓度为10mmg/kg的BrdU和5-氟-2-脱氧尿苷尿核苷(FrdU)混合剂(Amersham)腹腔注射入小鼠中。2小时后，将小鼠断颈处死，进行尸检，取出睾丸并于布安氏固定液中固定。将睾丸包埋在石蜡中，切片，厚度7μm，脱蜡。通过针对抗-溴脱氧尿苷的单克隆抗体(Amersham)和碱性蕊香红缀合的山羊抗鼠IgG(Jackson)的间接免疫荧光来检测BrdU的掺入。依照制造厂家的说明书，利用ApopTag原位细胞死亡检测试剂盒(Oncor)检测脱蜡切片中的编程性死亡细胞。活细胞解剖生精小管，并压片到带有PBS缓冲液的制备载玻片上。依照Parvinen M.等的方法(Histochem.& Biol.108,77-81(1997))，进行计算机辅助分析生精小管内的细胞。RNA印迹法依照制造厂家的说明书，利用TRIZOL试剂盒(Life Technology)分离不同组织的总RNA，每一道用30μg总RNA。依照Maniatis的实验设计(Sambrook,J.等，T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual.第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989第7.43-7.50页)进行RNA印迹。用[32P]dCTP标记cDNA探针(同原位杂交，见下面)。滤膜在FujiBAS磷光成像仪(phosphoimager)中曝光。利用抗-GDNF抗体的免疫沉淀和蛋白质印迹将新解剖的睾丸匀浆，然后裂解于高盐裂解缓冲液(300mg/蛋白/ml；高盐裂解缓冲液1M NaCl,100mM Tris HCl,pH8,2％BSA,4mM EDTA,0.2％Triton X-100,2mM PMSF,1mM正钒酸钠和1片/10mL的蛋白酶抑制剂混合剂药片(complete mini EDTA,BoehringerMannheim)。利用与鼠GDNF(R&D系统)和A蛋白琼脂糖进行交叉反应的抗人重组GDNF肽的多克隆抗体免疫沉淀溶胞产物。将免疫沉淀物在20％SDS-PAGE上电泳，然后转移到Hybond ECL硝化纤维滤膜(Amersham Life Science)。利用5％牛血清清蛋白封闭滤膜，利用抗-GDNF多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology)在室温下对免疫沉淀的GDNF进行2小时的检测。这些检测是按照制造厂家的说明书，利用缀合辣根过氧化物酶(Sigma)和ECL化学发光剂(Amersham)的抗-兔Ⅱ级抗体来完成的。原位杂交原位杂交是按照所记载的方法进行的(Wilkinson,D.和Green,P.,连续切片的原位杂交和三维重建。载于Postimplantation MammalianEmbryos.A practical approach(A.Copp和D.Cockroft编辑)，第155-171页.Oxford University Press:London(1990))。反义cRNA探针和有义cRNA探针(来自鼠GDNF外显子3的328bp；来自人GDNF外显子1和2的513bp；鼠Ret3端的714bp；鼠GFRα1的777bp)是利用适当的RNA聚合酶和35S标记的UTP合成的。杂交温度为52℃，放射自显影玻片于+4℃曝光2-4周。利用连到计算机的CCR照相机对载玻片进行拍照。在Photo Shop图形程序中，暗视野图像被翻转过来，并被人为地染成红色，而且结合亮视野图像。
第一引物(5’GCTGAG/CCAGTGACTCA/CAATATGCC3’)可识别小鼠和人的GDNF等位基因，并为了避免基因组污染而覆盖了内含子区域。另一端的引物对于内源和转基因型GDNF(小鼠中的GDNF特异性区域5’TGTTAGCCTTCTACTCCGAGACAG3’)以及对转基因型引物(转基因型GDNF的特异性区域5’CACCAGCCTTCTATTTCTGGATAA3’)是有选择性的。在同等条件下(于自身缓冲液的1μM引物、1mM dNTP和Dynazyme聚合酶(Finnzymes,Helsinki))，这些引物被用于复制来自内源和转基因型GDNF cDNA中长度为373bp的片段，这些cDNA是由一个正常或转基因型小鼠睾丸中的RNA逆复制而来的。循环程序是95℃保持30s，62℃保持30s,72℃保持45s，在“热启动”即95℃保持2分钟后，重复循环程序20-36次。最后一个循环在72℃保持5分钟，复制就停止了。PCR产物在含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶上进行电泳，然后在紫外灯下观察，并用偏振照相机进行拍照。利用[α-32P]标记的种特异性GDNF cDNA探针进行RNA印迹杂交来确定转基因型hGDNF的mRNA和内源小鼠GDNF的mRNA的表达，该探针来自于依照制造厂家说明书利用TRIzol试剂盒(Life Technologies)从睾丸中分离的总RNA。所述探针是小鼠GDNF(328bp外显子3(NCB1基因库，存储号U37459)和人GDNF(536bp、来自于外显子1和2(Lin等，Science260,1130-1132(1993)))。RNA印迹杂交是依照Sambrook,J.，等的方法进行的(Molecular Cloning:A Laboratory Manual.第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press 1989第7.43-7.50页)。在每一个样品中，使用的总RNA的量为30μg。杂交膜固定在一个Fuji磷光成像仪的平板上，曝光过夜，用Fuji BAS磷光成像仪记录图像。将肌动蛋白-探针作为探针，以控制RNA的平均加载量，在GDNF-探针杂交后，将肌动蛋白探针杂交到每一个滤膜上。结果表明，小鼠出生时睾丸中的GDNF mRNA强烈表达(图2a)，而在出生后的前几周内，特别是小鼠达到青春期时，GDNF mRNA的表达减弱(减退)，而且在成鼠中几乎检测不到GDNF mRNA。以RNA印迹为基础可以判断出，在3周龄GDNF t-小鼠的睾丸中(图2d)，转基因型人GDNF mRNA高出内源GDNF mRNA(图2a)50～500倍。
从RNA印迹杂交和cRNA原位杂交中所获得的结果表明，人GDNF-探针只与睾丸的RNA杂交，在睾丸中原位杂交的信号定位于精原细胞和一些早期精母细胞(图3)。
这些结果也同样表明，在转基因型GDNF t-小鼠和正常小鼠中，小鼠GDNF-受体Ret都是在青春期前小鼠的精原细胞中表达的，而在成年鼠中也在精细胞中表达，但在分化的精子中不表达，而GFRα1和GFRα2的共同受体在精子发生期内也在生殖系细胞中表达(见图3)。
对1-4周龄小鼠的睾丸进行组织学研究时，在GDNF t-鼠品系的雄性中可以观察到精原细胞数量的大量增加，这种增加是与精原细胞不再继续分化为精细胞和精子的事实相关的。根据它们的组织学结构，在生精小管中形成的细胞簇被确定为A型精原细胞(图1B)。四周后，生精小管中所述精原细胞簇的数量下降了；11周后，就只剩余很少的精原细胞了。在任何阶段都没有形成成熟和自由的精子，而且在附睾管中也不能检测到精细胞。实施例5GDNF导致不育的能力的证明由于GDNF可阻止精细胞形成，因此通过让雄性GDNF t-小鼠品系与8周龄以上的可生育雌鼠交配，来研究雄性GDNF t-鼠品系的受精能力。将20只雄鼠(6周龄以上)与雌鼠关在一起两周。它们共计与200只雌鼠进行了交配。另外，3只雄鼠(8周龄)与雌鼠关在一起半年，雌鼠以3至4天的间隔就被更换。它们交配的频率与正常小鼠一样。在交配后，对一些雌鼠的子宫和输卵管(egg leader)进行了研究以寻找精细胞。
所获得的结果表明，没有任何一只与携带转基因的GDNFt-鼠品系雄鼠进行交配过的雌鼠怀孕了，而且在它们的子宫和输卵管中也未发现精细胞。携带转基因的GDNF t-鼠品系雄鼠全部不育，也不能生育后代。
在下面详细描述的图中，对结果也进行了讨论图1表示三个不同年龄段的野生型(左部a、c、e)小鼠和转基因型(右部b、d、f)小鼠的睾丸形态以及8周龄野生型(g)和转基因型(h)的附睾管形态。(a和b)小鼠3周龄。(c和d)小鼠8周龄。(e和f)小鼠6月龄。在d中注意到在幼鼠中很丰富的A型精原细胞簇残留物(d)，在f中注意到晚期生殖细胞萎缩和间质细胞增生(星号)。野生型(g)小鼠和转基因型(h)小鼠的附睾管显示出在转基因小鼠中缺乏精子。刻度100μm。
图2表示不同年龄段的野生型小鼠睾丸(左部)和转基因型小鼠睾丸(右部)的GDNF(a、d)、Ret(b、e)和GFRα1(c、f)mRNA的RNA印迹。在a和b中分别使用的是小鼠GDNF cDNA和人GDNF cDNA探针，出生后第1周或第2周后，GDNF(a)、Ret(b)和GFRα1(c)的mRNA水平严重下调。与野生型小鼠中减退的内源GDNF mRNA水平相比，转基因型小鼠的人GDNF mRNA转基因水平(d)直到成年仍然保持高水平。此外，分析过的所有年龄段的转基因型小鼠的Ret(e)和GFRα1(f)的mRNA保持在高水平。(g)表示3周龄、6周龄和5周龄野生型(WT)和转基因型(TG)小鼠睾丸GDNF的免疫沉淀。在野生型小鼠睾丸中，检测不到GDNF蛋白。在右边，25ng的重组人GDNF蛋白作为对照。
图3表示利用cRNA原位杂交显示出的GDNF(a、b、c)、Ret(d、e、f)和GFRα1(g、h、i)转录物在野生型(WT，左部和中间)睾丸和转基因型(TG，右部)睾丸中的分布。在(a、b)中使用的是小鼠GDNF cDNA模板，在(c)中使用的是人GDNF cDNA模板。所有其它的探针都是针对鼠转录物的。有义对照并未显示出高于背景颗粒密度。(a、d、g)表示1到2周龄的野生型小鼠睾丸。(b、e、h)表示8周龄的野生型小鼠睾丸。(c、f i)表示8周龄的转基因型小鼠睾丸。注意到转基因型小鼠的精原细胞持续高水平表达人GDNF，但这些细胞的数量在8周龄时明显减少了。(d)表示2周龄时，Ret的表达位于生精小管基底层的一些精原细胞(箭头所指)。(g)表示GFRα1也是由一些在形态上与那些表达Ret的精原细胞相似分精原细胞(箭头所指)表达。(e)表示8周龄时，一些精原细胞和精细胞都表达Ret。(h)表示GFRα1 mRNA的分布与Ret mRNA的分布一致，但它也由精母细胞高水平表达。在转基因型小鼠中，Ret(f)和GFRα1(i)在精原细胞簇中都进行表达。刻度100μm。
图4表示野生型(a、d)和转基因型(b、e、g)小鼠睾丸中的细胞增殖(a、b、c)、编程性细胞死亡(d、e)和活体形态(f、g)。(f)显示了野生型小鼠和转基因型小鼠的生精小管。(a)表示在3周龄小鼠的睾丸中，BrdU标记的S期细胞只有在野生型小鼠生精小管的边缘部分才可以看到。注意到在生精小管的某些横切片上缺乏标记，反映出精子发生中S期细胞的节段分布。(b)表示在3周龄转基因型小鼠的睾丸中，可以看到许多BrdU标记的细胞存在于生精小管的腔区，这反映了精原细胞的异常分布(箭头所指)。在转基因型小鼠的生精小管中看不到S期细胞的节段分布。图4c表示野生型小鼠和转基因型小鼠睾丸中细胞增殖指数的分布。在100个野生型小鼠和转基因型小鼠生精小管中，计数了BrdU标记的细胞数/100个精原细胞。在转基因小鼠睾丸中BrdU标记的细胞的正常节段分布被扰乱(pertured)。(d和e)表示4周龄的小鼠睾丸中编程性细胞死亡的TUNEL标记。注意到与野生型(d)小鼠生精小管相比，在精原细胞簇(箭头所指)(e)中标记数量增加了。(f)表示15周龄的野生型(WT)小鼠和转基因型(TG)小鼠的生精小管的活体标本。注意到转基因型小鼠生精小管的直径减小，以及它周围的睾丸间质细胞增加了(箭头所指)。(g)表示高倍放大未固定的压片标本中来自转基因型小鼠生精小管的活体细胞，显示出在支持细胞中(箭头)存在大量的死细胞(箭头所指)，其中一些类似于A型精原细胞。刻度(a-d)100μm、(e)200μm、(f)10μm。
表1不同年龄段野生型小鼠和转基因型小鼠的睾丸重量(平均±SD)n=每一组中睾丸的数量年龄 野生型 转基因型周 mg n mg n15.5 ±2.6204.8 ±2.520227.8±6.02022.7±12 20350.2±6.52058.7±8.620468.8±8.01040.3±10.0 10579.9±7.31030.5±9.3108102.2 ±4.61034.7±8.0813 100.9 ±6.01038.3±8.3624 90.0±4.61043.2±8.9权利要求
1．神经胶质细胞系源神经营养因子(GDNF)家族相关化合物的应用，其特征在于所述与GDNF家族相关的化合物是神经胶质细胞系源神经营养因子(GDNF)、GDNF样因子或者化合物及其衍生物，这些化合物或者衍生物像所述GDNF一样作用于传递GDNF、GDNF样因子或化合物信号的受体或者共同受体等，可用于调节和研究精子发生、抑制精细胞分化、开发雄性避孕药或是作为一种雄性避孕药。
2．依照权利要求1的GDNF家族相关化合物的应用，其特征在于所述GDNF家族相关化合物或其衍生物是GDNF、persephin、neurturin和/或artemin、GDNF家族样化合物或者作用类似于GDNF家族相关化合物的化合物。
3．依照权利要求1的GDNF家族相关化合物的应用，其特征在于所述GDNF家族相关化合物是GDNF及其衍生物。
4．依照权利要求1的GDNF家族相关化合物的应用，其特征在于所述GDNF家族相关化合物是persephin及其衍生物。
5．依照权利要求1的GDNF家族相关化合物的应用，其特征在于所述GDNF家族相关化合物是neurturin及其衍生物。
6．依照权利要求1的GDNF家族相关化合物的应用，其特征在于所述GDNF家族相关化合物是artemin及其衍生物。
7．依照权利要求1的GDNF家族相关化合物的应用，其特征在于所述传递GDNF家族相关化合物信号的受体是cRet受体酪氨酸激酶。
8．依照权利要求1的GDNF家族相关化合物的应用，其特征在于所述活化GDNF家族相关化合物信号传递受体或者传递GDNF家族相关化合物信号的共同受体是GDNF家族受体α:S(GFRα)。
9．依照权利要求1的GDNF家族相关化合物在制造雄性用组合物方面的应用，其特征在于所述组合物包括GDNF、GDNF相关化合物或者像GDNF一样作用于它的受体或者共同受体的化合物，所述化合物的含量使得阻止精细胞分化、可以调节精子发生以及可实现由于干扰精细胞分化而导致的不育。
10．依照权利要求1的GDNF家族相关化合物在制造有效用于雄性避孕药组合物方面的应用，其特征在于该组合物包括GDNF、GDNF相关化合物或者像GDNF一样作用于它的受体或共同受体的化合物，并且其含量使雄性不能够导致雌性受精。
11．依照权利要求10的GDNF家族相关化合物在制造有效作为雄性避孕药的组合物方面的应用，其特征在于该组合物包含的GDNF、GDNF相关化合物或者像GDNF一样作用于它的受体和/或共同受体的化合物的量，使雄性体内所述化合物的浓度比所述雄性睾丸中内源GDNF的浓度高50-5000倍，优选高50-500倍，最优选高50-100倍。
全文摘要
本发明涉及神经胶质细胞系源神经营养因子(GDNF)家族相关化合物,例如神经胶质细胞系源神经营养因子(GDNF)、GDNF样因子,如persephin、artemin和neurturin或是像GDNF一样作用于其信号传递受体,即cRet受体酪氨酸激酶和/或共同受体等、如GDNF家族受体α∶S(GFRα1－4)等的其它化合物,也涉及它们在调节和研究精子发生、阻止精细胞分化、开发雄性避孕药或作为一种雄性避孕方面的应用以及在制造雄性避孕药雄性方面的应用。
文档编号A61K45/00GK1323218SQ99812289
公开日2001年11月21日 申请日期1999年8月20日 优先权日1998年8月21日
发明者汉鲁·萨里奥拉, 孟小娟, 默维·萨洛, 玛利亚·琳达, 马特·萨尔马 申请人:汉鲁·萨里奥拉, 孟小娟, 默维·萨洛, 玛利亚·琳达, 马特·萨尔马