alvern纳米粒度仪测定其粒度及分布； 利用扫描电子显微镜观察纳米晶体的形态。结果见图3的A和B。
[0041] 实施例5 :聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体的制备与表征
[0042] 聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体（PEG -PTX -NCs)的制备采用抗溶剂沉淀合并超声法。 分别称取实施例1中合成的PEG -PTX 0. 125mg、0. 25mg和0. 625mg，连同Img紫杉醇一起溶 于0. 5ml二甲基亚砜（DMSO)中，将此溶液在探头超声作用下注射入5ml的蒸馏水中，探头 超声5min即得（处方1、2、3)。粒径等相关药剂学性质见表1。
[0043] 实施例6 :聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体的制备与表征
[0044] 聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体（PEG -PTX -NCs)的制备采用抗溶剂沉淀合并超声法。 分别称取实施例1中合成的PEG - PTX 0. 5mg、I. 25mg和2. 5mg溶于5ml去离子水中，形成 PEG -PTX溶液。称取Img紫杉醇溶于0. 5ml二甲基亚砜（DMSO)中，将此溶液在探头超声作 用下注射入上述PEG - PTX的溶液中，探头超声5min即得（处方4、5、6)。粒径等相关药剂 学性质见表1。
[0045] 优选4号处方的粒径分布和形态见图3的C和D。聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体形 成的示意图见图4。
[0046] 实施例7 :聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体水化层的测定
[0047] 聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体（PEG - PTX - NCs)的水化层的测定采用文献方法 (Yasuyuki Sadzuka, Sadao Hirota Physical properties and tissue distribution of adriamycin encapsulated in polyethyleneglycol-coated liposomes. Adv. Drug Deliv. Rev. 24(1997)257 - 263)。具体地，将适量 PEG - PTX - NCs 在 4 °C 下，IOOOOrpm 离心 45 分 钟，得到纳米晶体的沉淀物，磷酸缓冲液清洗后，将此沉淀物用不同浓度的氯化钠溶液再分 散，测定这些溶液的zeta电位ζ，水化层L与In ζ的关系如下：1η ζ = InA - κ L，公式中 的κ为Debye Huckel参数，k =根号c/0. 3, c为氯化钠溶液的浓度。方程的斜率即为水 化层，测定结果见表1。
[0048] 实施例8 :聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体中mPEG含量的测定
[0049] 聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体中mPEG含量的测定采用I2复合物-比色法。 精密配制I. 〇mg/ml的mPEG5_溶液作为储备液。储备液被去离子水稀释成浓度为 5. 0, 10. 0, 20. 0, 30. 0, 40. 0和50. 0 μ g/ml的系列溶液。分别精密吸取上述溶液0. 8ml，加 入I. 2ml去离子水混匀后，加入50 μ 1的显色液（I210g/L+KI 20g/L)，系列溶液在阴暗处 显色5min后，测定样品在525nm的吸光度。以质量浓度为纵坐标，吸光度为横坐标，进 行回归处理，计算回归方程。按照此法测定不同溶液在525nm的吸光度，根据回归方程，计 算mPEG的量。mPEG化紫杉醇纳米晶体混悬液中总mPEG记为Ml，将该纳米晶体混悬液离心 45min(10000rpm，4°C )，得到的上清液，同法测定得到的mPEG为M2。离心后的纳米晶体用 去离子水混悬，测得的mPEG为M3，即为纳米晶体表面的mPEG，而晶体内部的mPEG可以通过 公式计算出来（M = Ml - M2 - M3)。测定结果见表1。
[0050] 实施例9 :聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体抗肿瘤活性实验
[0051] 紫杉醇纳米晶体和PEG化紫杉醇纳米晶体的体内抗肿瘤效应采用雌性nu/nu裸鼠 (6周龄，18 - 22g)。高转移性转染了荧光素酶的乳腺癌细胞MDA - MB - 231/luc用于该实 验。将2X IO6Ail的细胞悬液按照200 μ 1/只的剂量，接种于裸鼠前右侧腋下。待肿瘤达到 50mm3以上时，进行抗肿瘤效果实验。将荷瘤裸鼠随机分为5组，每组6只，分别尾静脉注射 生理盐水（Control)、紫杉醇商业制剂Taxol? (TAXOL?)、紫杉醇商业制剂AbraXane'紫杉醇 普通纳米晶体（PTX - NCs)和PEG化紫杉醇纳米晶体（PEG - PTX - NCs)。给药剂量为IOmg/ kg，每两天给药一次，共5次。隔天测量一次裸鼠的体重，并用游标卡尺测量肿瘤长径（L) 和短径（r)，计算肿瘤体积（V= (LXr2)/2)。绘制肿瘤体积-时间变化图。同时监测裸鼠 体重变化，作为毒性的参考数据。结果见图5。
[0052] 实施例10 :聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体抗肿瘤活性实验
[0053] 紫杉醇纳米晶体和PEG化紫杉醇纳米晶体的体内抗肿瘤效应采用雌性nu/nu裸鼠 (6周龄，18-22g)。裸鼠由北京大学医学部实验动物中心提供。高转移性转染了荧光素酶 的乳腺癌细胞MDA - MB - 231/luc用于该实验。将2X l〇7ml的细胞悬液按照200 μ 1/只 的剂量，尾静脉注射到裸鼠体内。肿瘤细胞将主要在肺部截留，在肺部形成肺转移瘤，用生 物发光成像仪监测肺转移瘤的形成和大小，当肺转移瘤达到一定大小时，进行抗肿瘤效果 实验。将荷瘤裸鼠随机分为4组，每组6只，分别尾静脉注射生理盐水（Control)、紫杉醇商 业制剂Taxol? (TAXOL?)、紫杉醇普通纳米晶体（PTX-NCs)和PEG化紫杉醇纳米晶体（PEG-PTX - NCs)。给药剂量为10mg/ml，每两天给药一次，共5次。隔天测量一次裸鼠的体重，给 药结束后1天时，裸鼠腹腔注射荧光素钾溶液（剂量为150mg/kg)，IOmin后用生物发光成 像仪照相，计算活的肿瘤细胞与底物荧光素钾结合后产生的光强度。裸鼠体重变化等结果 见图6。
[0054] 实施例11 :聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体的载药量
[0055] 称取实施例6中优化处方4所制备的PEG -PTX -NCs，用适量DMSO溶解，高效液相 色谱测定紫杉醇的含量，结果，紫杉醇占纳米晶体总重的82%，聚乙二醇化紫杉醇占纳米晶 体总重的18%。
[0056] 表1不同PEG -PTX添加模式和浓度对PEG -PTX -NCs的药剂学性质及其表面mPEG 含量的影响。
[0057]
【主权项】
1. 一种聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体，其特征在于，由聚乙二醇化紫杉醇和紫杉醇制备 而成，其粒径为100?800nm，该晶体中，紫杉醇占总重的50?90%，聚乙二醇化紫杉醇占 总重的10?50%，X射线衍射数据在2 Θ为5. 1，10. 5, 12. 6, 20. 4, 22. 4有特征峰，该晶体 中，聚乙二醇的平均分子量为700?10000道尔顿，聚乙二醇分布在纳米晶体的表面和内 部，聚乙二醇化紫杉醇可以溶解在有机溶剂或水中，聚乙二醇化紫杉醇吸附在紫杉醇纳米 晶体表面，或是其分子结构中的紫杉醇与形成纳米晶体的紫杉醇一起结晶，使得聚乙二醇 裸露在外，形成聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体。
2. 根据权利要求1所述的纳米晶体，其特征在于，其制备方法选自：抗溶剂沉淀法、乳 化法、超临界流体沉淀法。
3. 根据权利要求1所述的纳米晶体，其特征在于，其中紫杉醇部分可以由其他难溶性 药物代替，所述难溶性药物选自：多烯紫杉醇、喜树碱、10 -羟基喜树碱、9 -硝基喜树碱、拓 扑替康、伊立替康、9 -氨基喜树碱、替尼泊苷、依托泊苷、环孢素 A、非诺贝特、西罗莫司、阿 瑞吡坦、甲地孕酮、帕潘立酮、厄洛替尼、水飞蓟素、槲皮素、伊曲康唑、萘普生、地塞米松、地 奥司明、淫羊藿素、冬凌草甲素、姜黄素、葛根素、奈韦拉平、齐拉西酮。
4. 根据权利要求1所述的纳米晶体，其特征在于，其中的聚乙二醇端，可以连接配体， 所述配体选自：叶酸、RGD及其类似物、多肽、半乳糖、转铁蛋白、抗体。
5. 根据权利要求1所述的纳米晶体，其特征在于，其中所述的聚乙二醇化紫杉醇，其 聚乙二醇可以由比如短链的壳聚糖、聚乙二醇维生素 E琥珀酸酯的亲水性高分子化合物取 代。
6. 权利要求1所述的纳米晶体的制备方法，其特征在于，采用抗溶剂沉淀法，首先将聚 乙二醇化紫杉醇和紫杉醇溶解在有机相中，再注入到水相，紫杉醇与聚乙二醇化紫杉醇一 起析出结晶，其中有机相选自：乙醇、二甲基亚砜、二氯甲烷、三氯甲烷和丙酮。或者紫杉醇 溶解在有机相中，再注入到含有聚乙二醇化紫杉醇的水相中。
7. 权利要求6所述的制备方法，其特征在于，其中有机相选自：二甲基亚砜和乙醇。
8. 权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤如下：PEG - PTX 0. I - 5mg，连同Img 紫杉醇一起溶于〇. 2 - Iml有机溶剂中，将此溶液在探头超声作用下注射入I - IOml的蒸馏 水中，探头超声2 - IOmin即得。或者将PEG - PTX 0. I - 5mg溶解在水中，其他步骤不变。
9. 含有权利要求1所述纳米晶体的药物组合物，其特征在于，该纳米晶体可以分散在 水中，也可以加入适当冻干保护剂做成固体冻干粉。冻干保护剂选自葡萄糖、蔗糖、甘露醇、 乳糖中的任意一种或多种。
10. 根据权利要求6所述的药物组合物，为口服、注射、经皮或粘膜给药制剂。
【专利摘要】本发明涉及一种聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体的制备及其应用。本发明的纳米晶体由聚乙二醇化的紫杉醇与紫杉醇组成，首先以亲水性聚合物聚乙二醇(PEG)、紫杉醇(PTX)和小分子连接剂为起始原料，制备成聚乙二醇化紫杉醇(PEG‐PTX)，然后以此为修饰剂，制备聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体(PEG‐PTX‐NCs)，所制备的聚乙二醇化紫杉醇纳米晶体，粒径较小，载药量可达80％以上，具有长循环作用，增加了紫杉醇的抗肿瘤效果。
【IPC分类】A61P35-00, A61K47-34, A61K31-337, A61K9-14, A61K47-48
【公开号】CN104548125
【申请号】CN201410838596
【发明人】张华 , 胡宏祥, 张强, 王学清, 代文兵
【申请人】北京大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月30日