一种仿生siRNA胶束纳米复合物及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学领域，具体涉及一种仿生SiRNA胶束纳米复合物及其制备方法。
【背景技术】
[0002]病毒是目前基因治疗领域应用最多的一种核酸药物载体，其转染效率高，但存在着制备困难、目的基因容量小、靶向特异性差，以及生物安全性等问题。特别是1998年美国宾州大学人类基因治疗中心发生一例使用腺病毒基因治疗导致死亡的病例后，人们对人体内使用病毒载体的安全性提出了质疑。尽管如此，病毒载体细胞外稳定存在，细胞内解组装且动态转染的特点依然为人工合成非病毒基因载体的设计提供了很好的启示。依据仿生原理，人工合成的非病毒基因载体也可以通过组装功能基团，响应外界环境的刺激，改变自身的空间构象，达到类似病毒的动态、精密、高效的转染效果。
[0003]但到目前为止，非病毒基因载体的制备还存在以下几方面的问题:
[0004]I)大多数的非病毒载体的基因沉默效果较差，这主要与其进入细胞后依然被包埋在内涵体内，无法将siRNA释放到RNAi机制发挥作用的细胞质中有关，这也是siRNA有效传递的主要瓶颈。
[0005]2)大多数的非病毒siRNA载体的稳定性差，siRNA不能很好地被保护，在生物体内仍容易被核酶(RNase)降解、半衰期短。
[0006]3)大多数的非病毒基因载体带正电荷，这大大增加了载体的生物毒性，不利于体内的应用。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种具备主动靶向、内涵体逃逸、触发释药、长循环、安全稳定等多种性能的仿生型siRNA胶束纳米复合物。
[0008]本发明具体通过以下技术方案实现:
[0009]一种仿生siRNA胶束纳米复合物，包括活性成分壳聚糖、阳离子材料、疏水长链烷烃、靶向配体和穿内涵体小肽，所述的复合物为以壳聚糖为骨架，阳离子材料和疏水长链烷烃为核心，靶向配体和穿内涵体小肽通过PEG、腙键共价修饰的仿生型siRNA胶束纳米载体。该siRNA胶束纳米载体充分利用阳离子聚合物易于修饰的优点，制备出具有肿瘤靶向、内涵体逃逸、胞内触发释放、长循环、高效稳定等多种性能的仿生型非病毒基因载体。
[0010]所述的壳聚糖的分子量优选50000?200000 ;所述的阳离子材料优选精氨酸(Arginine，Arg)、组氨酸(Histidine，His)、赖氨酸(Lysine，Lys)带正电荷的氨基酸；所述的靶向配体优选脱氧氨基葡萄糖(DG)、叶酸(FA)、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽(RGD)或表皮细胞生长因子(EGF);所述的PEG的分子量优选1500?10000 ;所述的疏水长链烷烃优选正丁醛、己醛、辛醛、癸醛或十二烷基醛；所述的具有内涵体逃逸功能的小肽优选HA2、L2、蜂毒肽(Melittin，MEL)、E5。
[0011]本发明SiRNA胶束纳米复合物通过以下方法制备:
[0012]I)胶束亲水外壳的构建:
[0013]1.1壳聚糖骨架上修饰羧基:将邻苯二甲酸酐溶于DMF/H20溶液中，搅拌后加入将壳聚糖，加热反应得到氨基保护的壳聚糖，与溴代乙酸乙酯反应。
[0014]1.2PEG-配体复合物的制备:一端带有CHO的PEG与肿瘤靶向配体采用DCC/NHS体系进行催化羧基，形成酰胺键，得到CHO-PEG-配体的复合物进一步与水合肼反应，得到含腙键的PEG-配体复合物。
[0015]1.3将修饰了羧基的壳聚糖采用DCC/NHS体系进行活化后，按摩尔比为I?10:1与含腙键的PEG-配体复合物反应，用水合肼将产物中保护氨基的壳聚糖脱保护，反应产物与水合肼的摩尔比为1:3，得到壳聚糖-PEG-肿瘤配体溶液。
[0016]1.4穿内涵体小肽的修饰:选用EDC/NHS体系将小肽羧基活化后，加入到壳聚糖-PEG-肿瘤配体溶液中。
[0017]2)胶束疏水核心的构建
[0018]2.1Boc-L-赖氨酸与疏水长链烷烃按摩尔比1:3反应，搅拌过夜后再加入硼氢化钠反应后，用乙醚进行萃取分离，将反应产物溶于体积比7:3的二氯甲烷/三氟乙酸体系脱去L-赖氨酸氨基上的Boc保护。
[0019]2.2赖氨酸与长链烷烃的反应产物与带正电荷的氨基酸反应:按带正电荷的氨基酸与EDC、NHS的摩尔比1: 1.2:1.5用EDC/NHS体系活化后，将步骤2.1产物与活化的带正电荷的氨基酸溶液按摩尔比为1:1?5反应过夜，加入足量乙酸乙酯萃取分离。
[0020]3)亲水疏水修饰壳聚糖自组装成胶束
[0021 ] 将疏水核心用DMF溶液溶解，然后使用EDC/NHS体系活化过夜，按疏水核心与壳聚糖的摩尔比为1:0.5?3加入化学修饰壳聚糖骨架得到的胶束亲水外壳，反应12小时后透析，在水溶液中自组装成胶束。
[0022]本发明步骤1.1中DMF与H2O的体积比为19:1，邻苯二甲酸酐与壳聚糖单元体的摩尔比为5?1:1，优选为3:1，氨基保护的壳聚糖与溴代乙酸乙酯的摩尔比为1:1?5，优选为1:2。
[0023]本发明步骤1.2中PEG与靶向配体的摩尔比为1:1?5，优选为1: 2，所述的羧基与DCC、NHS的摩尔比优选1: 1.2:1.5，所述的CHO-PEG-配体复合物与水合肼的摩尔比为1:1 ?20，优选 1:10。
[0024]本发明步骤1.3中所述的活化条件为羧基与DCC、NHS的摩尔比为1:1.2:1.5，所述的壳聚糖与PEG-配体复合物(含腙键)的摩尔比为2?5:1。
[0025]本发明步骤1.4中小肽与EDC、NHS的摩尔比为1: 1.2:1.5，壳聚糖与小肽的摩尔比为1:0.2?2，优选0.7 ο
[0026]本发明步骤2.2中赖氨酸与长链烷烃的反应产物与带正电荷的氨基酸的摩尔比为 1:1.5o
[0027]本发明步骤(3)中疏水核心与EDC、NHS的摩尔比为1: 1.2:1.5，疏水核心与壳聚糖的摩尔比1:1。
[0028]本发明所述的复合物用于药物载体的用途。
[0029]本发明的有益效果为:
[0030]I)本项目将肿瘤靶向配体与穿内涵体肽共同修饰在siRNA纳米载体的表面，从而制备出具有肿瘤靶向摄取、内涵体逃逸等功能的仿病毒基因载体。该载体基因转染效率高，同时生物相容性好，解决了传统基因载体安全性能差、转染效率低的问题。
[0031]2)在本项目设计的复合纳米载体中，细胞内siRNA的释放是一个智能的过程，可以通过细胞内低PH环境诱导。因此与传统的siRNA载体相比，siRNA在细胞内能更快更容易地从载体中释放，因而也具有更强的基因沉默的作用。
[0032]3)本项目构建的siRNA载体核心是由阳离子聚合物壳聚糖、带正电荷的氨基酸与疏水基团共同组建的。与传统的非病毒载体相比，本项目构建的载体核心稳定性更强，并且增加了载体与siRNA之间的静电作用，更有利于siRNA的浓缩。
【附图说明】
[0033]图1为本发明制备的仿生型siRNA自组装胶束纳米粒的构建示意图；
[0034]图2为本发明制备的仿生型siRNA自组装胶束纳米粒的粒径分布图；
[0035]图3为本发明制备的仿生型siRNA自组装胶束纳米粒的Zeta电位图；
[0036]图4为本发明制备的仿生型siRNA自组装胶束纳米粒的透射电镜示意图；
[0037]图5为本发明制备的仿生型siRNA自组装胶束纳米粒的琼脂糖凝胶电泳图；
[0038]图6为本发明制备的仿生型siRNA自组装胶束纳米粒的细胞转染图。
【具体实施方式】