一种表面接种骨细胞的多孔生物陶瓷微球骨支架制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种表面接种骨细胞的多孔生物陶瓷微球人工骨支架制备方法，属于 生物组织工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 骨组织是人体中最坚硬的结缔组织，在维持肌体功能方面有着不可替代的作用。 骨骼作为人体的支架，担负着支持、保持、承重、造血、贮钙和代谢等功能。长期以来骨缺损 的治疗就是困扰人类的一大难题，临床证明，自体骨移植是治疗骨缺损的最佳方法，但以牺 牲健康组织为代价。异体骨移植有优越的组织学特点，但存在免疫排斥反应，易感染病毒， 且制样、处理和储存的成本较高。组织工程的出现，为临床治疗骨缺损提供了一种新的选 择。
[0003] 骨组织工程支架材料作为细胞外基质的仿生，由于直接作用于人体，并与人体健 康存在密切的关系，因此对其各种性能有比较严格的要求：（1)具有良好的组织相容性和 生物相容性；（2)抗生物老化，即长期植入的材料生物稳定性要好，暂时植入的材料在一定 时间内能够降解为可被人体吸收或排出体外的额度单体或片段；（3)力学性能和物理性质 稳定；（4)无毒、无热源，无致癌、致畸作用；（5)易加工成形；（6)便于消毒和灭菌。对于不 同用途的生物材料，以上要求各有侧重。同时，用于骨组织工程支架的材料不同，制造方法 也各不相同。这些方法都推动着骨组织工程支架的发展，但材料本身的缺点、支架制造方法 的局限性以及肌体组织的适应性问题，都使得支架发展受到了一定程度的影响。由致孔方 法制备的支架材料孔隙率较高。但普遍存在力学性能差的缺点；而由成型方法制备的支架 材料力学性能较好，但孔的连通性不好。针对此情况，在快速成型方法制备过程中添加致孔 剂有希望获得孔隙率高、力学性能好的组织工程支架。再对其表面进行生物活性处理，改善 支架的组织相容性，增加细胞黏附性，就能提高材料的组织适应性，为组织工程支架更好地 应用到临床治疗骨科疾病上提供新思路，其临床的作用效果还没有得到很好的验证。因此， 目前大部分的人工骨支架制备方法都较为传统。
[0004] 发明专利CN100536802C公开了一种双尺度微结构人工骨支架及其制备方法，该 方法基于计算机辅助设计CAD和光固化快速成型技术，先制备人工骨负型的树脂模具，在 模具中填充一定直径的石蜡小球适当加压，再填充生物材料浆体，待固化后真空烘干，最 后，热分解去除树脂模具和石蜡小球，形成宏观尺度的管道系统和微观尺度的球形孔。其特 点是，该支架微结构包括微观尺度的球连孔和宏观尺度的管道系统，球形孔随机分布，管道 系统可预先设计。但是该方法仍然存在如下问题：制备支架的有机粘结剂需要在高温下烧 除，延长了支架制作时间，提高了制备成本，并增加生物陶瓷颗粒被污染的几率，同时也不 能根据实际需要来精确的控制骨架的孔隙率。此外，其中的石蜡去除干净是一个难题，还没 能充分地考虑生物相容性问题，故该支架必须要进行二次处理。
[0005] 发明专利CN102499794公布了一种孔隙率可控的人工骨支架的制备方法，该方法 首先根据病患个体特性建立CAD模型，将该模型导入三维打印机，根据离散数值分析颗粒 流软件数值计算结果，按一定比例均匀混合生物陶瓷小球和生物可速溶小球；然后通过三 维打印机喷洒生物胶黏剂粘结混合球，实现人工骨支架的制备。其通过采用可速溶小球来 获取孔隙率，避免了支架制备工程中的烧结以及化学反应给人工骨支架带来的污染。还可 以通过控制可速溶小球的数量和半径来获得满足一定力学性能和孔隙率的生物陶瓷人工 骨支架。但是该方也没有从相容性角度充分进行考虑。
[0006] 发明专利CN102283723A公布了一种可控力学性能的生物陶瓷微球人工骨支架快 速成型方法，同样是首先将人工骨支架CAD模型分割成等距离的二维截面图形N份；然后按 生成的二维截面图形，控制喷头的扫描运动，将瞬干粘结剂选择性的喷洒到生物陶瓷微球 表面，从而将生物陶瓷微球分层叠加粘结，堆积成型出三维人工骨支架结构。其优点是：通 过控制瞬干粘结剂的喷洒量来控制微球层间的粘结强度，即控制整个骨支架的力学性能。 其主要的不足在于：粘结剂的喷洒量的控制难度较高，不能实现力学性能精确可控；其次 是该方法较为偏重于实现力学性能的可控，同样也没有着重考察支架的相容性问题。
[0007] 通过对以上专利的分析我们可以看出，目前人工骨支架的制备方法还较为传统， 仅偏重于某一个方面的研宄，不能够使得人体对骨支架的要求得到极大的满足，都或多或 少存在一定不足，特别是在支架的相容性方面尤为突出。因此，实现骨支架的极大生物相容 性是对现有骨支架制备的创新和探索。
【发明内容】
[0008] 为了克服现有技术不能制备出使得骨支架生物相容性得到极大满足的难点，本发 明提出了一种表面接种骨细胞的多孔生物陶瓷微球骨支架制备方法，该方法分为运用三维 打印机制备骨支架基体和骨支架表面细胞接种制造两部分，现其具体步骤如下： 步骤一、运用三维打印机制备骨支架基体，其具体包括以下子步骤： 子步骤1 :计算机处理人工骨支架三维CAD模型，将其从下至上顺序分割成间距为A h 的二维截面图形N份，第i份截面图形面积为Ai,其中A h的大小为多孔生物陶瓷微球的直 径； 子步骤2 :将子步骤1中输出的N份二维截面图形导入三维打印机，并将生物胶黏剂装 入三维打印机的储液腔； 子步骤3 :i=l，在成型工作台上均匀的铺上一层多孔生物陶瓷微球； 子步骤4 :启动三维打印机，把第i层生物胶黏剂喷洒到第i层多孔生物陶瓷微球上； 然后再均匀铺上一层多孔生物陶瓷微球，形成第i+1层； 子步骤5 :判断i值，如果i〈N，则i=i+l，重复子步骤6 ;否则，进入下一步； 子步骤6:支架制作完毕，取出支架，将支架放入到医用消毒酒精中浸泡，然后水洗，凉 干，此时得到的是一种微结构满足要求的骨支架基体； 步骤二、接种骨细胞支架的制造过程： 子步骤1 :取病患骨修复或骨移植部位的成骨细胞进行培养，细胞培养液为高糖DMEM 培养液，其中每100mL培养液中添加有IOml胎牛血清、29. 2mg谷氨酰胺和IOmg青霉素/链 霉素，经过多次传代已达到需求数量，使用前用胰酶消化后，提取成骨细胞，并加入一定量 的骨生长因子，从而制备出含有骨生长因子的成骨细胞悬浮液； 子步骤2 :将子步骤1所得成骨细胞悬浮液和某种生物相容性水凝胶按一定体积比均 勾混合，并装入到自制生物成型机的储液腔，控制自制成型机墨泵，使其施加一个特定的气 压，以确保成骨细胞、骨生长因子以及凝胶混合体从打印机喷头顺利挤出； 子步骤3 :将上述理后的骨支架基体进行电子扫描，并对所得图像进行处理，从而获得 骨支架基体的轮廓特征，并将所得的参数输入到自制生物成型机； 子步骤4:将骨支架基体固定于自制生物成型机平台上，并启动生物成型机在支架基 体表面打印上若干层混合体，使整个骨支架基体表面都打印上成骨细胞、骨生长因子以及 水凝胶的混合体； 子步骤5 :支架制作完毕，取出打印完成后的支架。
[0009] 步骤三、表面接种骨细胞的羟基磷灰石微球骨支架的培养： 并将该骨支架复合物至于生物反应后器，连接到体外动态灌流系统平台中，加入预热 的DMEM细胞培养液后进行动态培养，已备临床使用。
[0010] 本发明的有益效果是： 1)本发明的器官软体支架制备过程无需烧除，而是采用了生物相容性较好的多孔羟基 磷灰石陶瓷微球来制备骨支架基体，从而保证了支架的一次成型，不必考虑支架结构负型 的去除，实现了常温制备，减少了软体支架制备过程中对软体支架的污染几率。
[0011] 2)本发明三维打印机，该设备可以根据病患的个体差异和不同部位对骨支架的需 求来制备满足特定需求的骨支架基体，比如支架内部微结构和外形等特征都能得到很好的 满足，从而实现骨支架的可定制性。
[0012] 3)本发明突破了传统骨支架的制备方法，即在传统骨支架制备的基础上，采用了 接种骨细胞制造技术，在骨支架基体上采用自制生物成型机打印上了病患成骨