齐墩果酸多囊脂质体、制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种齐墩果酸多囊脂质体、制备方法、及其应 用。
【背景技术】
[0002] 齐墩果酸（Oleanolic acid，简称0A)，又名土当归酸，别名庆四素，化学名为 (3 β )-3-Hy-droxyolean-12-en-28-〇ic_acid，为白色簇状结晶性粉末，无臭、无味，不溶于 水，可溶于甲醇、乙醇、氯仿及丙酮。OA属五环三萜类化合物，主要以游离或者皂苷形式存在 于夏枯草、连翘、油橄榄、女贞及木瓜等植物中。1908年，OA首次由FB Powers自木樨科植 物Oleaeuro-peae L的叶中分离出来，并由Ruzicka在1946年确定了其结构。我国湖南医 药工业研宄所在1975年对青叶胆抗肝炎有效成分的化学和药理研宄中，分离并鉴定了 OA 单体，此后研宄者们便对OA的药理作用进行了广泛深入的研宄。OA除了具有保肝、抗炎、抗 病毒、降糖降脂、双向免疫调节、抗高血压的生物物活性外，还具有强心、抗心律失常、抑制 血小板聚集和抗过氧化等多种药理作用，临床上OA制剂主要用于治疗急性黄疸型和慢性 中毒型肝炎，并作为抗癌辅助药物。此外，OA还凭借其高效低毒、材料易取等特点成为了肿 瘤防治研宄方面的热点，其抗癌作用机制几乎贯穿了肿瘤发展的各个阶段。目前临床上齐 墩果酸的相关制剂主要是齐墩果酸片，但齐墩果酸为脂溶性药物，存在着在胃肠道溶出度 低、吸收性差、肝脏首过效应明显等缺点，使其生物利用度大大降低，因此，研宄开发齐墩果 酸的新剂型非常必要。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于解决上述现有技术存在的缺陷，提供一种生物利用度高的齐墩 果酸多囊脂质体、制备方法、及其应用。
[0004] 一种齐墩果酸多囊脂质体的制备方法，包括以下步骤：
[0005] 1)、按量称取大豆磷脂、胆固醇、三油酸甘油酯、齐墩果酸、硬脂酸溶解于有机溶剂 中，溶解形成油相；
[0006] 2)、按量取规定量的油相加入内水相中，用乳化机剪切分散形成初乳；
[0007] 3)、按量取规定量的初乳加入到外水相中，旋涡振荡形成复乳；
[0008] 4)、将复乳迅速转移至圆底烧瓶中，旋转蒸发去除有机溶剂，即得齐墩果酸多囊脂 质体。
[0009] 进一步地，如上所述的齐墩果酸多囊脂质体的制备方法，所述大豆磷脂、胆固醇、 三油酸甘油酯、齐墩果酸的质量比为: 0.57 : 0.38 : 0.2;硬脂酸在油相中的添加浓度 为：lmg/ml〇
[0010] 进一步地，如上所述的齐墩果酸多囊脂质体的制备方法，所述油相与内水相的体 积比为1-1.5 : 1，初乳与外水相的体积比为0.3-0. 5 : 1。
[0011] 进一步地，如上所述的齐墩果酸多囊脂质体的制备方法，所述内水相按质量百分 比计，包括：
[0012] 葡萄糖5%
[0013] 余量：水；
[0014] 所述外水相按质量百分比计，包括：
[0015] 葡萄糖4%
[0016] 吐温-80 2%
[0017] 聚乙烯醇3%
[0018] 余量：水。
[0019] 进一步地，如上所述的齐墩果酸多囊脂质体的制备方法，所述有机溶剂为氯仿与 乙醚按体积比为1 : 1混合而成。
[0020] 进一步地，如上所述的齐墩果酸多囊脂质体的制备方法，步骤2中，初乳的剪切速 度为13500rpm、剪切时间为150s。
[0021] 进一步地，如上所述的齐墩果酸多囊脂质体的制备方法，步骤3中，旋涡振荡的时 间为25s。
[0022] -种根据如上任一制备方法制备得到的齐墩果酸多囊脂质体。
[0023] 如上所述的齐墩果酸多囊脂质体在制备治疗抗癌药物中的应用。
[0024] 如上所述的应用，所述药物是用于治疗肝癌的药物。
[0025] 本发明将齐墩果酸载于多囊脂质体的类脂层中制备齐墩果酸多囊脂质体 (OA-MVLs)，以期提高生物利用度，达到缓慢释放药物，减少给药次数，提高患者顺应性的目 的。
【附图说明】
[0026] 图1为OA-MVLs在光学显微镜下形态（X 400);
[0027] 图2为OA-MVLs的粒度分布图；
[0028] 图3为OA-MVLs及游离OA在释放介质中的累积释放率曲线图；
[0029] 图4A为OA-MVLs作用于HepG2模型细胞，孵育4h后，DAPI蓝色荧光标记的细胞 核显微镜图；
[0030] 图4B为OA-MVLs作用于HepG2模型细胞，孵育4h后，DHPE绿色荧光标记的 OA-MVLs显微镜图；
[0031] 图5为各因素交互作用对包封率和平均粒径影响的响应曲面和等高线图；图5A为 X1 (胆固醇与磷脂的质量比）和X2 (药脂比）对包封率的影响；图5B为X1 (胆固醇与磷脂 的质量比）和X3(三油酸甘油酯与磷脂的质量比）对包封率的影响；图5C为X2 (药脂比） 和X3 (三油酸甘油酯与磷脂的质量比）对包封率的影响；图为X1 (胆固醇与磷脂的质量 比）和X2(药脂比）对粒径的影响；图5E为X2(药脂比）和X 3(三油酸甘油酯与磷脂的质 量比）对粒径的影响；图5F为X1(胆固醇与磷脂的质量比）和X 3(三油酸甘油酯与磷脂的 质量比）对粒径的影响；
[0032] 图6为不同浓度OA-MVLs作用于H印G2细胞后的细胞核形态学变化显微镜图。
【具体实施方式】
[0033] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将本发明中的技术方案进行 清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基 于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其 他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0034] 实施例1 :
[0035] -种齐墩果酸多囊脂质体的制备方法，包括以下步骤：
[0036] 1)、按量称取大豆磷脂、胆固醇、三油酸甘油酯、齐墩果酸、硬脂酸溶解于有机溶 剂中，溶解形成油相；其中，所述大豆磷脂、胆固醇、三油酸甘油酯、齐墩果酸的质量比为： 1 : 0. 57 : 0. 38 : 0. 2;硬脂酸在油相中的添加浓度为：lmg/ml;
[0037] 2)、量取Iml的油相加入1ml内水相中，用乳化机剪切分散形成初乳；剪切速度为 13500rpm、剪切时间为150s ;
[0038] 3)、量取0. 3ml的初乳加入到Iml外水相中，旋涡振荡形成复乳；旋涡振荡的时间 为 25s ;
[0039] 4)、将复乳迅速转移至圆底烧瓶中，旋转蒸发去除有机溶剂，即得齐墩果酸多囊脂 质体。
[0040] 实施例2 :
[0041] 1)、按量称取大豆磷脂、胆固醇、三油酸甘油酯、齐墩果酸、硬脂酸溶解于有机溶 剂中，溶解形成油相；其中，所述大豆磷脂、胆固醇、三油酸甘油酯、齐墩果酸的质量比为： 1 : 0. 57 : 0. 38 : 0. 2;硬脂酸在油相中的添加浓度为：lmg/ml;
[0042] 2)、量取I. 5ml的油相加入1ml内水相中，用乳化机剪切分散形成初乳；剪切速度 为13500rpm、剪切时间为150s ;
[0043] 3)、量取0. 5ml的初乳加入到Iml外水相中，旋涡振荡形成复乳；旋涡振荡的时间 为 25s ;
[0044] 4)、将复乳迅速转移至圆底烧瓶中，旋转蒸发去除有机溶剂，即得齐墩果酸多囊脂 质体。
[0045] 上述实施例中，所述内水相按质量百分比计，包括：5%葡萄糖、余量：水。所述外 水相按质量百分比计，包括：4%葡萄糖、2%吐温_80、3%聚乙稀醇、余量：水。所述有机溶 剂为氯仿与乙醚按体积比为1:1混合而成。
[0046] 齐墩果酸（OA)属于五环三萜类化合物，临床上主要用于治疗急性黄疸型和慢性 中毒型肝炎。目前临床上其相关制剂主要是齐墩果酸片，但齐墩果酸为脂溶性药物，存在着 在胃肠道溶出度低、吸收性差、肝脏首过效应明显等缺点，使其生物利用度大大降低。因此， 本发明将齐墩果酸载于多囊脂质体的类脂层中制备齐墩果酸多囊脂质体（OA-MVLs)，以期 提高生物利用度，达到缓慢释放药物，减少给药次数，提高患者顺应性的目的。
[0047] 下面对本发明的实验方法进行简述：
[0048] 1、本发明采用复乳法制备OA-MVLs，并用中心组合设计优化其处方和制备工艺。
[0049] 2、考察OA-MVLs的形态、包封率、粒径及其在pH7. 4的PBS缓冲液中的释药行为。
[0050] 3、采用MTT法和DAPI染色法研宄OA-MVLs对!fepG2细胞的抑制及促凋亡作用，并 采用激光共聚焦测定OA-MVLs的入胞情况，测定给药后H印G2细胞内外齐墩果酸浓度的变 化。
[0051] 4、选用SD大鼠为动物模型，以齐墩果酸原料药溶液为对照，通过皮下注射给药， 研宄OA-MVLs在大鼠体内的缓释效果。
[0052] 结果：
[0053] 1、本实验制得的OA-MVLs形态规则，粒径符合正态分布，包封率为82. 3±0. 61 %。
[0054] 2、OA-MVLs在pH7. 4的PBS缓冲液中没有明显的突释现象，120h累积释药 80. 56±1. 27%，显示了较好的缓释及长效作用。对OA-MVLs的释药曲线进行拟合，最符合 Ritger-Peppas方程，表明OA-MVLs的释放可能以Fick扩散为主。
[0055] 3、OA-MVLs作用于HepG2细胞，能抑制细胞增殖，并能促使细胞凋亡；OA-MVLs入 胞后分布在细胞核及细胞膜上。随着OA-MVLs对H印G2细胞作用时间的增加，细胞内OA浓 度逐渐增加，细胞外浓度变化不大；随着OA-MVLs浓度的增加，细胞内外的OA浓度也逐渐增 加。
[0056] 4、与OA溶液剂相比，OA-MVLs的半衰期明显延长，t1/2为（4. 38±4. 34) VS(48. 14± 27. 67)h ;AUC 显著增加，AUC(0_t)* (500 7 · 5 I ± 1 346 · 5 5) VS (24530. 94±1293. 42) ng/mL · h ;平均滞留时间显著延长，MRT 为（6. 30±3. 63) VS(56. 84±28. 99)h，在注射96h后仍能在血浆中检测到药物。
[0057] 主要实验试剂
[0058] 大豆磷脂（PC，上海太伟药业有限公司）
[0059] 三油酸甘油醋（TO, Aladdin chemistry Co. Ltd)
[0060] 胆固醇（Chol，成都市科龙化工试剂厂）
[0061] 齐墩果酸