分钟，吸掉染液，加 PBS洗细胞 五遍，夹出爬片，将其覆盖在载玻片上，立即放置于激光共聚焦显微镜下观察细胞的摄取情 况，结果见图4A及图4B。
[0183] 由图4A及图4B可见，由DHPE绿色荧光标记的OA-MVLs主要分布在细胞核，其次 在细胞膜上也有分布，这提示药物能进入到细胞内，并在细胞核上大量聚集，其抗肿瘤活性 可能与抑制DNA合成及分裂有关。
[0184] 大鼠体内药代动力学实验
[0185] 实验动物
[0186] 雌性SD大鼠，200g左右。
[0187] 实验方法
[0188] 给药剂量的确定
[0189] 本次实验的给药剂量按照药理试验中动物与人体间的等效剂量换算，以标准体重 的普通人用的剂量1. 00-1. 33mg/kg，按照如下公式换算成大鼠给药剂量：
[0190] Db = Da*Sa*Rab*Sb ;
[0191] Db :大鼠给药剂量（mg/kg);
[0192] Da :普通人用药剂量（mg/kg);
[0193] Rab :换算系数（查表知由普通人a到大鼠 b的换算系数Rab为6. 17);
[0194] Sa、Sb :折算系数（动物为标准体重时，Sa、Sb = 1，动物为非标准体重时，通过查 表可得Sa、Sb值）；
[0195] 根据上式最终换算出0. 2kg标准体重大鼠的给药剂量为：6. 17-16. 40mg/kg。设定 本次实验大鼠的给药剂量为l〇mg/kg。
[0196] 实验设计
[0197] 将10只SD大鼠随机分成两组，每组各5只，一组为实验组，一组为对照组，均采用 背部皮下注射的方式给药，给药前禁食不禁水12h。实验组注射OA-MVLs，对照组注射相同 剂量的OA溶液（将40mg OA加入20mlPEG400中，磁力搅拌溶解后再加入20ml注射用水）。 给药后实验组分别于〇. 5、l、2、4、8、12、24、36、48、60、72、96、120h时间点眼底静脉丛采血 0. 5-lml，对照组分别于0. 25、0. 5、1、1. 5、2、3、5、7、9、llh时间点眼底静脉丛采血0. 5-lml。 采血后迅速以4000rpm/min离心10分钟，分离得到的上清即为血浆。将血浆按时间和序号 标号后放入 -20°C冰箱保存，备用。
[0198] 结果
[0199] 大鼠分别皮下注射OA-MVLs和OA溶液剂后的体内血药浓度的变化见表9和表10。
[0200] 表9大鼠皮下注射OA-MVLs后各个时间点的平均血药浓度（η = 5)
[0202] 表10大鼠皮下注射OA溶液剂后各个时间点的平均血药浓度（η = 5)
[0203]
[0204] 由实验结果可知，皮下注射OA原料药溶液和OA-MVLs后，二者血药浓度-时间 曲线相差显著。OA原料药溶液经皮下注射后，迅速达到峰浓度，随即下降。而皮下注射 OA-MVLs后，由于脂质体存在部分游离药物，在0. 5h就达到最高药浓点，但峰浓度较OA溶液 组显著降低，随后血药浓度逐渐降低，药物在大鼠体内的消除时间显著延长，直至96h药物 释放基本完全。这说明OA-MVLs具有较好的缓释效果，起到了药物储库的作用。
[0205] 将表9及表10的数据用PKSolver分析处理，确定最佳房室模型，求算药动学参 数。组间数据采用t检验进行比较：P > 0. 05时，无显著性差异；P < 0. 05时，差异具有显 著意义；P < 0. 01，差异具有非常显著意义。结果显示，OA和OA-MVLs经皮下注射后在大鼠 体内的药物动力学特征均符合二室模型，主要药动学参数见表11。
[0206] 表11大鼠分别皮下注射10mg/kg OA-MVLs混悬液和OA溶液后的药代动力学参数 (η = 5)
[0208] * :ρ < 0· 01，** :ρ < 0· 05,与 OA 溶液剂相比
[0209] 由表6结果可知，与OA溶液剂相比较，OA-MVLs的AUC (Ο-t)显著增大，半衰期显 著延长，平均滞留时间MRT也显著延长，峰浓度降低，说明将OA制成多囊脂质体，不仅具有 良好的缓释效应，还能增加药物的生物利用度。
[0210] 本发明研宄了 OA-MVLs的制备方法及其体外释药特性，通过细胞实验研宄了肝癌 HepG2细胞对OA-MVLs的摄取程度，并研宄了 OA-MVLs在SD大鼠体内的药动学过程，为该药 在临床上的应用提供了一定的理论基础。现将结果总结如下：
[0211] 1、首先，我们采用单因素实验筛选了影响粒径和包封率最显著的三个因素，然后 利用中心组合设计对这三个因素进行优化，得到了最优处方，成功制备了 OA-MVLs ;并建立 了体外测定OA的高效液相色谱法。
[0212] 2、进一步地我们对OA-MVLs理化性质进行了研宄。肉眼观察OA-MVLs为白色半透 明状的混悬液，光学显微镜下观察OA-MVLs外观囊形圆整，每个粒子由很多非同心的小囊 泡构成。利用Image-pro plus 6.0专业图像处理软件测得OA-MVLs的平均粒径符合正态 分布。为了研宄OA-MVLs在体外的释放特性，我们采用透析法研宄了 OA-MVLs在pH7. 4的 PBS中的释放，并对释放模型进行了拟合，结果显示OA-MVLs具有良好的缓释性能，在pH7. 4 的PBS中能够缓释120h左右，120h的累积释药百分率达80. 56±1. 27%。
[0213] 3、之后我们为了考察人肝癌细胞H印G2对OA-MVLs的摄取程度，采用了 MTT法和 DAPI染色法研宄OA-MVLs对H印G2细胞的抑制及促凋亡作用，并采用了激光共聚焦测定 OA-MVLs的入胞情况。结果显示OA-MVLs对H印G2细胞具有明显的抑制作用，并能促使细胞 凋亡，OA-MVLs入胞后主要分布在细胞核中，其次分布在细胞膜上。同时我们还建立了细胞 内外测定OA含量的HPLC法，该方法的空白回收率，精密度，准确度均符合分析要求。检测 结果显示，随着OA-MVLs对H印G2细胞作用时间的增加，细胞内OA浓度逐渐增加，细胞外浓 度变化不大；随着OA-MVLs浓度的增加，细胞内外的OA浓度也逐渐增加。
[0214] 4、为了考察OA-MVLs在大鼠体内的释药特点，我们对其在大鼠体内的药代动力学 性质进行了研宄。首先建立了体内测定OA含量的HPLC法，结果显示该方法在100-900ng/ mL浓度范围内线形关系良好（r = 0. 993)，精密度、回收率、稳定性均满足生物样品测定要 求。分别在SD大鼠皮下注射OA原料药溶液和OA-MVLs混悬液（剂量均为10mg/kg)，结果 显示OA-MVLs经皮下注射后，相比于OA溶液在体内的最大血药浓度降低，半衰期延长，达到 了缓释作用。
[0215] 综上，本发明通过OA载入多囊脂质体，制备得到的OA-MVLs体内外缓释良好，实现 了本发明的目的，为脂溶性药物载入多囊脂质体达到缓控释提供了一个新思路。
[0216] 结论：
[0217] 1、本发明成功制备了 OA-MVLs，并用中心组合设计优化得到了最优处方及制备工 乙；
[0218] 2、OA-MVLs在体外具有明显的缓释效应；
[0219] 3、OA-MVLs较易被!fepG2细胞摄取，并对其有明显的抑制作用；
[0220] 4、OA-MVLs在体内也具有缓释作用。
[0221] 最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽 管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然 可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替 换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精 神和范围。
【主权项】
1. 一种齐墩果酸多囊脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 、按量称取大豆磷脂、胆固醇、三油酸甘油酯、齐墩果酸、硬脂酸溶解于有机溶剂中， 溶解形成油相； 2) 、按量取规定量的油相加入内水相中，用乳化机剪切分散形成初乳； 3) 、按量取规定量的初乳加入到外水相中，旋涡振荡形成复乳； 4) 、将复乳迅速转移至圆底烧瓶中，旋转蒸发去除有机溶剂，即得齐墩果酸多囊脂质 体。2. 根据权利要求1所述的齐墩果酸多囊脂质体的制备方法，其特征在于，所述大豆磷 月旨、胆固醇、三油酸甘油酯、齐墩果酸的质量比为1 : 0.57 : 0.38 : 0.2;硬脂酸在油相中 的添加浓度为：lmg/ml。3. 根据权利要求1所述的齐墩果酸多囊脂质体的制备方法，其特征在于，所述油相与 内水相的体积比为1-1.5 : 1，初乳与外水相的体积比为0.3-0. 5 : 1。4. 根据权利要求1所述的齐墩果酸多囊脂质体的制备方法，其特征在于，所述内水相 按质量百分比计，包括： 葡萄糖5% 余量：水； 所述外水相按质量百分比计，包括： 葡萄糖4% 吐温-80 2% 聚乙烯醇3% 余量：水。5. 根据权利要求1所述的齐墩果酸多囊脂质体的制备方法，其特征在于，所述有机溶 剂为氯仿与乙醚按体积比为I:1混合而成。6. 根据权利要求1所述的齐墩果酸多囊脂质体的制备方法，其特征在于，步骤2中，初 乳的剪切速度为13500rpm、剪切时间为150s。7. 根据权利要求1所述的齐墩果酸多囊脂质体的制备方法，其特征在于，步骤3中，旋 涡振荡的时间为25s。8. 根据任一权利要求1-7制备方法制备得到的齐墩果酸多囊脂质体。9. 根据权利要求8所述的齐墩果酸多囊脂质体在制备治疗抗癌药物中的应用。10. 根据权利要求9所述的应用，所述药物是用于治疗肝癌的药物。
【专利摘要】本发明提供一种齐墩果酸多囊脂质体及其制备方法、应用。该方法包括：(1)、按量称取大豆磷脂、胆固醇、三油酸甘油酯、齐墩果酸、硬脂酸溶解于有机溶剂中，溶解形成油相；(2)、按量取规定量的油相加入内水相中，用乳化机剪切分散形成初乳；(3)、按量取规定量的初乳加入到外水相中，旋涡振荡形成复乳；(4)、将复乳迅速转移至圆底烧瓶中，旋转蒸发去除有机溶剂，即得齐墩果酸多囊脂质体。本发明将齐墩果酸载于多囊脂质体的类脂层中制备齐墩果酸多囊脂质体(OA-MVLs)，以期提高生物利用度，达到缓慢释放药物，减少给药次数，提高患者顺应性的目的。
【IPC分类】A61K9/127, A61K31/56, A61P35/00
【公开号】CN104983684
【申请号】CN201510401465
【发明人】钟志容, 刘中兵, 柯发敏, 唐灿, 李劲薇, 罗玉玲, 熊丹, 景沛, 肖双礼, 刘丽
【申请人】钟志容
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年7月9日