（A0,绵阳东方源生物科技有限公司）
[0062] 吐温-80 (成都科龙化工试剂厂）
[0063] 硬脂酸（国药集团化学试剂有限公司）
[0064] 聚乙烯醇（PVA，成都科龙化工试剂厂）
[0065] 其余试剂均为国产分析纯试剂。
[0066] I. 1磷脂与胆固醇之比
[0067] 由于胆固醇（Cholesterel，Chol)具有对磷脂膜流动性的双向调节作用，可以减 少药物的渗漏率而成为脂质体制备的重要成分。实验在保持制备工艺及其他成分不变的前 提下，通过调节磷脂与胆固醇的质量比（80 : 20,80 : 30,80 : 40)来考察其对OA-MVLs 包封率的影响，结果表明，在PC : Chol = 80 : 30时药物的包封率最高。
[0068] 1. 2磷脂与三油酸甘油酯之比
[0069] 三油酸甘油酯作为中性脂质，并无成膜能力，而是填充于脂质双分子层中的疏水 腔室，稳定交叉连接处，形成不连续的药物溶液囊泡。本实验通过调整三油酸甘油酯的加入 量来制备OA-MVLs，并测定包封率，结果表明当磷脂与三油酸甘油酯的质量比值为80 : 33 时包封率最高。
[0070] 1.3药脂比
[0071] 在OA-MVLs的制备过程中，当其它条件不变时，改变药脂比（即油相中齐墩果酸的 加入量），并测定包封率，结果表明随着药物所占比例的增大，MVLs的包封率明显升高，但 随着药物加入量的增多，其溶解性降低，药脂比为1 : 10时最佳。
[0072] 1. 4外水相
[0073] 外水相对OA-MVLs的外观和稳定性都有较大的影响，实验以聚乙烯醇（PVA)、葡萄 糖（Glu)及吐温-80 (Tween-80)作为外水相，通过改变这三种成分的浓度比例来制备不同 的外水相，考察其包封率，以期得到较好的外水相比例。结果显示，当聚乙烯醇：葡萄糖： 吐温-80 = 3 : 4 : 2时得到的MVLs包封率最高。
[0074] 1. 5硬脂酸
[0075] 据文献报导，制备MVL时常加入荷负电磷脂作为膜保护剂，以提高磷脂双电子层 间的静电斥力，阻止磷脂膜的合并及破坏。但是，荷负电的磷脂价格昂贵且不易获得。有研 宄发现，在油相中加入少量的油酸或硬脂酸，也可以明显提高MVL的成型性，所形成的MVL 粒径大小均匀，能大幅减少磷脂碎片的产生并消除聚集沉淀的现象。
[0076] 结果表明，加入硬脂酸后MVL的包封率有所升高，但硬脂酸加入过量将会导致药 物的渗漏增加，因此，硬脂酸的加入量为lmg/ml较合适。
[0077] L 6油相与内水相相比
[0078] 在初乳的制备过程中，通过调节油相与内水相的体积比来考察形成的初乳的稳定 性及制备出的OA-MVLs的包封率。结果表明由于OA是脂溶性药物，增加油相的加入量有利 于得到载药量更高的脂质体，且这三种体积比的制剂在制备过程中均未出现分层现象，因 此优选包封率较高的一组，即体积比为0.75 : 0.5。
[0079] 2. 1制备初乳的剪切速度及时间
[0080] 制备初乳时需经过高速的剪切过程，为形成乳剂提供能量。剪切速度及时间对初 乳的粒径及稳定性有一定的影响，也间接影响了复乳的质量。实验在相同的处方工艺条件 下，分别以12000rpm、13500rpm及15000rpm高速剪切120s，比较所得脂质体的粒径及包封 率。结果表明，在13500rpm时制得的脂质体包封率较高，且在显微镜下观察到的粒径也较 小。
[0081] 剪切时间对药物的包封率也有一定的影响。结果表明剪切时间过短时，初乳无法 达到高度分散状态，乳剂不稳定，所得的OA-MVL包封率较低，剪切150s时包封率较高，实验 选用 13500rpm 剪切 150s。
[0082] 2. 2复乳涡旋时间
[0083] 在相同的处方工艺条件下，固定旋涡混合仪的强度而改变混合时间来制备复乳， 以包封率和粒径为指标，单因素考察旋涡混合时间对OA-MVLs包封率的影响，实验结果表 明，复乳的涡旋时间在l〇s、15s、25s的包封率的变化不大，但在显微镜下观察时，发现随着 涡旋时间的增加，MVL的粒径有所减小，故实验选用涡旋振荡25s来制备复乳。
[0084] 中心组合实验设计
[0085] 根据前期单因素实验结果，结合有关文献，选择对粒径和包封率影响较为显著的3 个因素作为考察对象，即胆固醇与大豆磷脂质量比（X 1)、药脂比（即齐墩果酸：磷脂）（X2)、 三油酸甘油酯与大豆磷脂质量比（X3)，中心组合实验设计各因素水平见表1。
[0086] 表1实验考察变量及实验水平编码的实际值
[0087]
[0088] 在中心组合设计中所要求的试验次数为2f+2f+l(f为所研宄的因素的数量），本试 验为3因素的中心组合设计，所需的试验次数为15次。另外，为了考察试验的误差大小，将 中心点的试验重复进行了5次。其他实验条件采用单因素实验确定的实验方案。以多囊脂 质体平均粒径和包封率作为指标筛选最佳处方条件，实验设计方案及实验结果见表2。
[0089] 表2CCD实验设计表和考察指标实验结果
[0091] 其中，乂1:胆固醇与磷脂的质量比X2:三油酸甘油酯与磷脂的质量比，X 3:药脂比； Y1:包封率，Y2:粒径。
[0092] 数据处理和方程拟合
[0093] 以平均粒径、包封率作为评价指标（因变量），采用统计学软件Design Expert 7.0分别对各因素（自变量）进行多元线性回归和多项式拟合，并用F检验，Lack of fit 和R-Squared等统计学指标考察所得回归方程的准确性，结果见表3、表4 :
[0094] 通过对各拟合方程F检验，P值，Lack of fit项的综合考察，删除一些项达到对多 项式方程进行简化的目的，拟合方程如下：
[0095] Υ1=67·07+69·36*Χ1+1·20*Χ2+22·82*Χ 3-1·10*Χ1*Χ2+24·89*Χ1*Χ3+2·10*Χ 2*Χ3-60· 84?!~2-0. 053*Χ2~2-92. 44*Χ3~2(Ρ < 0. 0001, R2= 0. 93)
[0096] Υ2 = +0. 58-7. 50?+!. 28*X2+63. 98*X3-81. 86^^-5. 06*X2*X3+22. 12^^2+78. 17*X3~2(P < 0· 0003, R2= 0· 85);
[0097] 从各方程拟合度和统计学检验结果可以看出，所考察的2项指标均可用多项式方 程进行较好的拟合。
[0098] 表31拟合方程方差分析结果
[0103] 由于影响多囊脂质体粒径及包封率的因素较多，故本发明先采用单因素实验初筛 对其影响最显著的因素，再用中心组合设计法优化其处方及工艺条件。
[0104] 响应曲面优化及验证
[0105] 根据各指标的拟合方程，固定一个因素的水平，采用统计学软件Statistical0.0 ， 分别绘制出各考察指标与另外两个实验因素的三维响应曲面关系图，如图5。
[0106] 根据拟合方程和响应曲面关系图，确定制备OA-MVLs的最优处方为：Chol !PC(X1) =〇. 57,药脂比（X2) = 16, TO :PC (X3) = 0. 39。按此处方制备样品，测定其平均粒径和包 封率，各指标预测值和实测值结果见表5。
[0107] 表5优化处方的平均粒径和包封率的预测值和实测值对比结果（η = 3)
[0108]
[0109] 由表5可以看出，优化后的各指标实测值均接近优化预测值，说明本发明得到的 拟合方程可以较好的描述因素与指标的关系。
[0110] 响应曲面图能直观地展现各因素对指标的影响和因素之间的交互效应关系，曲率 越高，表明因素之间交互作用的影响就越显著；等高线的形状也可反映交互效应的强弱，椭 圆形表明因素交互作用显著，而圆形则反之，等高线中的最小椭圆的中心点即是响应面的 最高点（包封率最高点）。
[0111] 由图5-A至图5-C可知，当Chol含量，TO含量，药脂比在因素考察范围中间附近 取值有利于提高MVLs的包封率，药脂比与TO含量的交互影响最显著，胆固醇含量与药脂比 交互影响次之。
[0112] 由图5-D至图5-F可知，药脂比和TO含量对OA-MVLs粒径影响较大，药脂比与TO 含量交互影响作用较强，胆固醇含量与药脂比交互影响一般。
[0113] 综合以上的优化结果，本发明OA-MVLs的制备方法为：
[0114] 步骤1 :精密称取大豆磷脂0. 0800g，胆固醇0. 0456g，三油酸甘油酯0. 0300g，齐墩 果酸0. 0160g，硬脂酸0.0 OlOg于Iml氯仿：乙醚（v/v=l : 1)的有机溶剂中，溶解形成 油相。
[0115] 步骤2 :精密量取0.75ml油相，加入0.5ml内水相中（5%葡萄糖），用乳化机以 13500rpm剪切150s形成初乳。
[0116] 步骤3 :精密量取0.4ml初乳，快速加入到Iml外水相中（4%葡萄糖，2%吐温-80， 3 %聚乙烯醇），旋涡振荡25s形成复乳。
[0117] 步骤4 :将复乳迅速转移至圆底烧瓶中，旋转蒸发去除有机溶剂，即得OA-MVLs。
[0118] 在驱除复乳中的有机溶剂的过程中，若有机溶剂挥发过快，会造成复乳的破坏，而 挥发过慢复乳稳定性不够，也不能得到形态较好的MVLs。本实验采用减压旋蒸驱除有机溶 剂，同时需在冰浴的条件下进行。
[0119] 齐墩果酸多囊脂质体的外观及结构
[0120] 实验方法
[0121] OA-MVLs 形态观察
[0122] 取适量OA-MVLs混悬液，滴加于载玻片上，置于光学显微镜下观察其形态。
[0123] OA-MVLs 粒径分布
[0124] 测定脂质体粒径的常用方法有：激光散射法、光学显微镜法、离心沉降法、电子显 微镜法和微孔滤膜-光密度法等。本实验采用显微镜拍摄高清照片，利用Image-pro plus 6. 0专业图像处理软件测得平均粒径。
[0125] 由图1、图2可见，OA-MVLs外观圆整、均匀，有多个非同心囊泡组成。粒度分布符 合正态分布。
[0126] OA-MVLs包封率的测定
[0127] 脂质体的包封率（Encapsulation Efficiency)是指包封于脂质体中的药量占体 系中总药量的百分比，是脂质体质量评价的重要指标之一，常用的包封率的测定方法有葡 聚糖凝胶柱色谱法、微柱离心法、超滤膜过滤法和透析法等。由于多囊脂质体粒径较大，用 低速离心法就能较好地分离脂质体与游离药物，且能除去单室脂质体