分泌型IgA组合物、其制备方法和使用方法
【技术领域】
[0001] 本公开内容涉及产生分泌型IgA的方法、经纯化的分泌型IgA、包含分泌型IgA的 组合物及其使用方法。
【背景技术】
[0002] 免疫球蛋白A是5类免疫球蛋白中最丰富的并且主要存在于胃肠道和呼吸道的粘 膜中。存在两种类型的免疫球蛋白A :分泌型IgA和血清型IgA。血清型IgA-般是存在于 很多物种血清中的单体，其中其作为第二防线介导对已突破粘膜表面的病原体的消除。分 泌型IgA(SIgA)是二聚体或多聚体，并且包含除IgA之外的分泌型组分。SIgA是用于幼体 之母乳的常见成分，并且是断奶后的发育期和成年期中进入胃肠系统中的分泌型蛋白质。 已提出全身施用IgA可保护免受导致感染性休克的炎症的发展。目前，没有被设计来矫正 动物和人的胃肠道中SIgA缺乏的方法，并且也没有证据证明所述施用可矫正这些疾病。
[0003] 已表明，SIgA与广泛多种环境蛋白质和多糖（例如，细菌、病毒、毒素和食物组分） 的结合阻止其进入体内并激活宿主炎症免疫机制。目前，除了动物中的合成之外，没有已知 用于产生具有各种抗原结合活性的SIgA的方法（例如，具有多种抗原结合活性的SIgA不 能够用化学物质、重组微生物在发酵或干细胞中产生）。此外，动物对环境损害的暴露越多 样化，SIgA活性的库（r印ertoire)和多样性越大。为了探索SIgA作为用于治疗疾病的饮 食/ 口服补充剂的用途，必须存在可直接从动物收集的SIgA源。此外，有利的是，所收集材 料的量相对于疾病病症的治疗是成本效益的，因为可用SIgA治疗的很多疾病没有威胁生 命到足以必须进行昂贵的药物治疗。
[0004] 所需要的是可用作治疗SIgA相关疾病的补充剂的SIgA源。
【发明内容】
[0005] 在一方面，组合物包含分离自猪或牛的肠腔液或肠粘膜的任选经巴氏灭菌的纯的 分泌型IgA。
[0006] 在另一方面，本文包括从来源分离的分泌型IgA，所述来源是猪或牛的肠粘膜，其 中分离的分泌型IgA中分泌型IgA的浓度是来源材料中的浓度的至少两倍，其中所述来源 材料是干燥肠粘膜、由肠粘膜制备的水性蛋白质制备物或由肠粘膜制备的干蛋白质制备 物。
[0007] 在又一方面，食物组合物包含基础食物组合物和有效提高动物的生长速率、提高 动物的饲料效率、减少动物的胃肠炎症、降低动物的胃肠感染的风险或其组合的量的分泌 型 IgA。
[0008] 在又一方面，提高对象的生长速率、提高对象的饲料效率、减少对象的胃肠炎症、 降低对象的胃肠感染的风险或其组合的方法包括向所述对象施用有效提高所述对象的生 长速率、提高所述对象的饲料效率、减少所述对象的胃肠炎症、降低所述对象的胃肠感染的 风险或其组合的量的分泌型IgA。
[0009] 在另一方面，提高动物的生长速率、提高动物的饲料效率、减少动物的胃肠炎症、 降低动物的胃肠感染的风险或其组合的方法包括向所述动物施用来自猪或牛的干燥肠粘 膜，其中所述干燥肠粘膜是未经水解的，并且其中所述干燥肠粘膜包含有效提高所述动物 的生长速率、提高所述动物的饲料效率、减少所述动物的胃肠炎症、降低所述动物的胃肠感 染的风险或其组合的量的分泌型IgA。
[0010] 在另一方面，用于纯化分泌型IgA的方法包括用分子量为3000至30, 000的聚乙 二醇处理猪的肠腔液以沉淀分泌型IgA，并分离沉淀的分泌型IgA。在另一方面，制备动物 食物的方法包括干燥未经水解的猪或牛肠粘膜，并将干燥的未经水解的猪或牛肠粘膜添加 至基础动物食物组合物。
[0011] 根据以下发明详述、附图和所附权利要求书，本领域技术人员会理解并了解上述 及其它特征。
[0012] 发明详述
[0013] 本文描述了包含SIgA的组合物和用于从动物（例如猪和牛）的肠腔液或肠粘膜 中纯化SIgA的方法。SIgA是具有多种抗原结合活性的免疫球蛋白。当SIgA从粘膜释放至 外部环境时，其与病原体、食物抗原和变应原形成免疫复合物，从而阻止它们结合并穿透肠 粘膜。因此，经纯化的SIgA可用于补充动物的SIgA缺乏以及提高其体重增加和/或饲料 效率。
[0014] 目前，猪和牛肠通常被用作肝素的来源。肝素是高度硫酸化的糖胺聚糖，其被广 泛用作抗凝剂。与SIgA类似，肝素不能通过现代的化学方法产生，而是从生物来源分离。 通常使用包括高温、高压和/或蛋白酶的方法使肝素与组织分离来从全猪肠或内皮内衬 (endothelial lining)(粘膜）纯化肝素。最后的纯化通常包括阳离子交换树脂的使用。本 申请的目的是从肠粘膜分离SIgA以及在制备用于提取肝素的肠期间从肠腔液分离SIgA。
[0015] 本文中使用的肠腔液是存在于动物肠腔内的液体。所述腔是肠的内腔，消化的食 物通过内腔并且营养物质在此被吸收。肠腔液的组成根据生物体的饮食、进食/禁食状态 和疾病状态而不同。肠腔液包含例如脂质；蛋白质，包括SIgA ;细菌；离子，例如钠、钾和钙； 以及固体未消化物质。
[0016] 此外，本文中使用的肠粘膜指肠的内壁（腔内衬（luminal lining))。肠包括称为 浆膜的外壁、中间肌肉层和称为粘膜的内部。
[0017] 在一实施方案中，本文描述了包含分离的SIgA和/或纯的SIgA的组合物。分离 的SIgA或纯的SIgA分离或纯化自猪或牛的肠腔液或肠粘膜。
[0018] 本文中使用的术语"分离的"蛋白质包括与存在于该蛋白质的天然来源中的其它 蛋白质或非蛋白质分子的至少一部分分离的蛋白质分子。分离的蛋白质不含来自为该蛋白 质之来源的细胞、组织或体液源的大量细胞材料或其它污染性多肽。分离的SIgA的SIgA 浓度可以是来源材料中浓度的两倍，即来源肠粘膜或肠腔液中SIgA浓度的两倍。在另一些 实施方案中，与来源肠粘膜中的浓度相比，分离的SIgA的浓度是3倍、4倍、5倍、10倍或更 多倍。
[0019] 在一实施方案中，分泌型SIgA分离自为猪或牛之肠粘膜的来源，其中分离的分泌 型IgA中分泌型IgA的浓度是来源材料中浓度的至少两倍，其中来源材料是干燥肠粘膜、肠 粘膜的水性制备物或由肠粘膜制备的干蛋白质制备物。
[0020] 在一实施方案中，分离的SIgA制备物是来源于肠粘膜的干制备物，其中在分离的 SIgA中包含的IgA为蛋白质材料的5%或更多。不受理论的限制，认为每100g粘膜蛋白质 含有5至IOg SIgA。在另一些实施方案中，在分离的SIgA中包含的IgA多于蛋白质材料的 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 95%。
[0021] 术语纯的在提及SIgA时指SIgA是分离的并且SIgA组分（IgA和分泌型组分）占 样品中蛋白质的多于75%，具体地多于85%，并且更具体地多于95%。纯的SIgA可由肠粘 膜或肠腔液制备而来。
[0022] 在一实施方案中，纯的SIgA制备物是经巴氏灭菌的。巴氏灭菌是这样的过程：将 液体加热至特定的温度并持续限定的时间长度，随后基本上立即将液体冷却。巴氏灭菌的 目的是减少液体中存活病原体的数目。用于巴氏灭菌的示例性条件是50°C至KKTC持续5 至30秒或120°C至150°C持续1至8秒，用于储存稳定性巴氏灭菌。如本文中所示，对分离 自猪肠粘膜的SIgA进行巴氏灭菌在使用该SIgA制备物提高鸡的饲料效率方面是重要的。
[0023] 在一实施方案中，纯的SIgA组合物的分泌型IgA脂多糖（LPS)结合活性为血清型 IgA脂多糖结合活性的至少5倍。间接ELISA可证明LPS结合活性。将LPS包被在微量滴 定板上。将肠 SIgA或血清IgA以不同的稀释度添加至结合在微量滴定板上的LPS。在将未 结合的SIgA通过洗涤除去之后，使用与酶（如辣根过氧化物酶）偶联的抗-IgA抗体加底 物检测与结合于板之LPS结合的SIgA的量。当给定量的肠 SIgA相对于相同量的血清IgA 具有更高的结合能力时，结合增加。
[0024] 在一实施方案中，经巴氏灭菌的纯的SIgA是包含可药用赋形剂的药物组合物的 形式。
[0025] 在一实施方案中，用于纯化SIgA组合物的方法包括用分子量为3000至30, 000的 聚乙二醇处理猪或牛的肠腔液并分离沉淀的SIgA。在一实施方案中，与肠腔液中的SIgA 浓度相比，SIgA被富集至少两倍。在另一实施方案中，所述方法还包括将所沉淀的SIgA重 悬于分子量为3000至30, 000之聚乙二醇的溶液中以产生再沉淀的SIgA，并分离再沉淀的 SIgA。可重复重悬和沉淀直至产生本文中所述的纯的SIgA组合物。
[0026] 在一实施方案中，沉淀的SIgA组合物是如上文所述经巴氏灭菌的。
[0027] 可对沉淀的纯的SIgA进行另外的处理/纯化步骤，例如过滤灭菌、使用冰冷乙醇 的沉淀（低于〇°C以使PEG溶解并只留下纯的蛋白质）、脱盐。用于纯化的其它方法例如硫 酸钠沉淀和γ角叉菜胶以及尺寸排阻层析。
[0028] 在一实施方案中，纯的SIgA或分离的SIgA由猪或牛的肠粘膜制备而来。在一实 施方案中，纯的SIgA或分离的SIgA的制备包括裂解肠粘膜、通过例如离心除去碎片并随后 将上清液中的蛋白质用不同浓度的分子量为3000至30, 000的聚乙二醇（3. 5%至15% w/ v)依次沉淀，从而将使SIgA与