r Scientific Pittsburgh PA)过 滤。一旦将材料过滤，就将其冻干直至需要。然后，将冻干的粉末用经灭菌的酸化PBS (pH 4)以I : 10w/v的稀释度再水合。随后，将该储存液进一步稀释至1 : 1000并在SDS-PAGE 凝胶上分离，之后使用考马斯亮蓝染色来进行可视化。考马斯亮蓝使所有的蛋白质染色并 允许可视化。在凝胶上鉴定出6条独特的条带。不受理论的限制，认为这些条带表示含有 一些污染物的IgA。将该凝胶送至威斯康星大学麦迪逊分校生物技术中心（University of Wisconsin-Madison Biotechnology Center)进行蛋白质测序以采用另一种方式来确定样 品纯度。在发现的6条带中有4条在所发现的前3种蛋白质中具有IgM或IgA。在一些情 况下，在这4条带中发现了 IgM和IgA两者。该结果证实已从猪的腔分离出高丰度的抗体。 前两条带是氨肽酶，其是非特异性酶。具有抗体IgM也是非常好的；IgM是另一种第一应答 型抗体。其是响应于感染分泌的第一抗体。
[0050] 表2 :通过蛋白质测序鉴定的蛋白质
[0053] 经证实，IgA以高丰度存在，因为达50%的条带具有大量的IgA。有趣的是，在我们 的经过滤器灭菌腔液中发现的达50%的条带中大量鉴定出另一种重要抗体，IgM。在83% 的条带中鉴定出IgA或IgM，这与使用捕获ELISA确定纯度大于90%类似。序列覆盖率是对 蛋白质的多少进行测序的量度，即存在该蛋白质中73%的氨基酸。最高的量在IgA和IgM 中。
[0054] 确定分离物中的IgA并还确定IgA是否具有活性的另一种方式是使用ELISA来 使IgA与两种不同的底物（LPS和分离的大豆蛋白）结合。简单地，将96孔板用溶解于包 被缓冲液中的0. 25g分离的大豆蛋白或2mg大肠杆菌（E. Coli)055 :B5脂多糖包被过夜 以允许肽附着于 Nunc IVlaxisorp⑨ F 板（Thermo-Fisher Scientific，Rochester NY) 上。然后，将板用不含蛋白质的封闭液（Pierce，Rockford IL)封闭1小时。随后，将板用 PBS-〇.05%Tween(Fisher_Scientific，Pittsburgh PA)洗绦 3 次。接着，使用经冷冻干燥 的腔液以10倍的稀释度（1 : 10至1 : 1，〇〇〇, 〇〇〇, 〇〇〇)上样保持1小时。随后，将板用 PBS-Tween(0. 05% )洗涤3次。接着，在封闭缓冲液中加入山羊抗-猪IgA二抗（Bethyl Laboratories，Montgomery TX)(5yL 2。抗体：12.5mL封闭缓冲液），保持30分钟。将板用 洗涤缓冲液洗涤6次。之后，在底物缓冲液（二乙醇胺97mL，100mg MgCl2,0.2g NaN3,800mL ddH20, pH 9. 8)中加入底物、孵育15分钟，然后在450nm下读数。使用猪血清作为对照。
[0055] 表3:与LPS结合的IgA的ELISA结果
[0056]
[0057] 表3示出了 IgA与LPS结合的结果。使用的对照是1 μ g分离自猪血清的IgA。需 要将从腔分离的IgA稀释4000倍以与对照一样地结合，即猪肠的腔中有4mg(4000稀释度 X 1 μ g[在对照中发现的结合量]与LPS结合的IgA。
[0058] 表4 :与大豆蛋白结合的IgA的ELISA结果
[0059]
[0060] 表4示出了与分离的大豆蛋白结合的IgA的结果。使用的对照是lug分离自猪血 清的IgA。需要将从腔分离的IgA稀释8000倍以与对照一样地结合，即，猪肠的腔中有8mg 与大豆蛋白结合的IgA。
[0061] 不受理论的限制，认为来自LPS和大豆蛋白的结果是合理的，因为不大可能会有 超过5%的可用IgA与大豆蛋白和LPS非特异性地结合。
[0062] 实施例2.对IgA制备物进行巴氏灭菌
[0063] 使用巴氏灭菌来从IgA制备物消除细菌。来自威斯康星大学麦迪逊分校乳制品试 验工场（University of Wisconsin-Madison Dairy Pilot Plant)的商品级巴氏灭菌器将 包含IgA的腔液加热至12Γ F 20秒，此后将材料快速冷却。在巴氏灭菌后，IgA的量几乎 没有损失并且IgA的结合能力没有下降。
[0064] 实施例3.分离自猪肠腔的SIgA在市售鸡中表现出生长促进
[0065] 雏鸡研宄#1 :涉及动物的所有操作经由威斯康星大学动物管理和使用委员 会(University of Wisconsin Animal Care and Use Committee)批准。 从 Welp Hatchery(Bancroft IA)购买了 100只Cornish Rock肉用雏鸡并将其分成至少50只雏 鸡/组的组，其中在经热灭活的IgA(对照，IgA被加热至80°C 30分钟）和IgA之间等分 雏鸡。向雏鸡喂食0. 02g抗体/Kg饲料（对照或IgA)。该0. 02g抗体/Kg饲料在全饮食 (Sunfresh? Purina，Gray Summit MO)之上进行喂食。每周将雏鸡称重并监测饲料效 率。在这一情况下，IgA是未经巴氏灭菌的。
[0066] 表5 :来自雏鸡研宄1的结果
[0067]
[0068] 表5显示：对于以0. 02g/Kg鸡饲料喂食的未经巴氏灭菌的IgA，饲料效率或体重 增加均未得到提高。体重增加在第一周有所提高但P值为〇. 2,因此不被认为是成功的实 验。
[0069] 雏鸡研宄#2 :从Welp Hatchery (Bancroft IA)购买了 100 只 Cornish Rock 肉用雏 鸡并将其分成至少50只雏鸡/组的组，其中在经热灭活的IgA (对照，IgA被加热至80°C 30 分钟）和IgA之间等分雏鸡。向雏鸡喂食0. 02g抗体/Kg饲料（对照或IgA)。该0. 02g抗 体/Kg饲料在全饮食（Sunfresh? Purina，Gray Summit MO)之上进行喂食。每周将雏 鸡称重并监测饲料效率。在这一情况下，IgA是经巴氏灭菌的。
[0070] 表6 :来自雏鸡研宄2的结果
[0071]
[0072] 不受理论的限制，认为巴氏灭菌是本实验的关键。将研宄1与研宄2的体重进行 比较，不管用对照还是测试，体重都较高。IgA使生长速率提升约4%并且使饲料效率提高 约4. 5%。这些是用于家禽业的相关数值并且该实验应被认为是成功的。
[0073] 实施例4.仅使用经冷冻干燥的粘膜提高了市售鸡中的饲料效率
[0074] 利用粘膜的雏鸡研宄 #1 :从 Welp Hatchery (Bancroft IA)购买了 100 只 Cornish Rock肉用雏鸡并将其分成至少50只雏鸡/组的组，其中在经热灭活的粘膜（对照，粘膜被 加热至80°C 30分钟）和粘膜之间等分雏鸡。向雏鸡喂食0. 02g粘膜/Kg饲料（对照或粘 膜）。该 〇.〇2g 粘膜/Kg 饲料在全饮食（Sunfresh? Purina，Gray Summit MO)之上进 行喂食。每周将雏鸡称重并监测饲料效率。在这一情况下，IgA是未经巴氏灭菌的。
[0075] 表7 :使用经冷冻干燥的粘膜的雏鸡研宄
[0076]
[0077]
[0078] 本实验成功地使饲料效率提高了 13 %至16 %。在第1周之后，对照中的饲料转化 不如我们在前4个实验中观察到的那么好。然而，第2周和第3周与在前2个雏鸡研宄中 所观察到的接近。尽管如此，使用粘膜的饲料转化比来自所有其它实验的IgA最佳值好10 点。
[0079] 我们测量的猪中的粘膜量（3. 5镑（Ibs)湿重）在冻干后是219. 5克。喂食率等 于20克冻干粘膜/吨饲料。
[0080] 实施例5.从猪肠粘膜分离SIgA
[0081] 将粘膜在4°0下在等份（50%裂解缓冲液：50%粘膜）的裂解缓冲液[50臟 01/1 HEPES，150mmol/L NaCI，10%甘油，l%Triton X-100，1.5mmol/L MgCl2，10yg/mL 抑肽酶， 104区/11^亮抑酶肽，1臟01/1苯甲磺酰氟（?]\07)、20(^111〇1/1恥 3￥04、20(^111〇1/1似卩和 lmmol/L EGTA(最终pH 7. 5)]中均化过夜。然后，向裂解缓冲液/粘膜混合物添加3. 5% w/v PEG 8000并在4°C下以14, OOOx g离心10分钟。将上清液保留，随后通过玻璃棉过滤。 然后，将上清液与8. 5% w/v PEG 8000合并、溶解并随后在4°C下以14, OOOx g离心10分 钟。接着，将上清液弃去并将得到的沉淀物重悬于包含12% PEG 8000w/v的去离子水溶液 中，之后在4°C下以14, OOOx g离心10分钟。将上清液弃去，将得到的沉淀物在-80°C下冷 冻1小时并冻干。
[0082] 除非本文中另外指出或明显与上下文矛盾，否则使用的没有数量词修饰的名词 (尤其是在所述权利要求书的上下文中）应被解释为涵盖单数和复数两者。本文中使用的 术语第一、第二等并非意在指代任何特定的顺序，而仅仅是