5 PeptideiMo-POM抑制A β 40聚集ThT荧光实验
[0043]本实施例采用ThT荧光试验研究A β 40聚集的动力学特征，因为ThT染料能够特异性稳定结合淀粉样多肽纤维，纤维量越多，结合ThT后的荧光越强。最后，通过JASCO FP6500荧光分光光度计检测聚合程度。按以下设计试验分组:Αβ 40、Αβ40+Ζη2\A β 40+Ζη2++Ρ印tide、A β 40+Zn2++Mo-P0M 和 A β 40+Zn2++P印tide@Mo-P0M。其中，A β 40 浓度为40 μ M，Zn2+浓度为80 μ M，Mo-POM和，PeptideiMo-POM的浓度为5 μ g/mL。将所有样品在振荡器上震荡1s使其充分混匀后置于37°C恒温培养箱孵育。在孵育过程的不同时期(0、1、2、3、4、5、6天)，选取小样份等量的A β 40溶液加入ThT溶液。充分混匀后在激发波450nm、发射波485nm的条件下检测混合样品的荧光强度，试验重复三次，并取平均值作为最终试验结果。
[0044]实验结果如图3所示，Αβ 40自身孵育也会产生明显的聚集作用，因为ThT荧光强度随着孵育时间的增加，在第二天到第五天呈指数增长，六天之后荧光强度区域稳定，处于平台期。而加入Zn2+后，Αβ 40的聚集程度较自身聚集显著增加，说明Zn2+能促进Αβ 40的聚集。在Zn2+存在的情况下，加入Peptide或Mo-POM共同孵育，ThT荧光强度有一定程度的降低，说明多肽和Mo-POM具有一定的抑制A β 40纤维化的能力。当加入P印tide@Mo-P0M时，荧光强度显著下降，说明其能与A β 40有效结合，阻止自身的聚集和纤维化。这可能是由于多肽修饰Mo-POM后，由于多肽的Αβ靶向性，P印tide@Mo-P0M能有效与Αβ纤维结合，破坏折叠结构的形成，从而大大的增加了 Mo-POM抑制Αβ聚集及纤维化的能力。(注:本实施例使用的P^tideOMo-POM为实施例2制备得到的P印tide@Mo_P0M。)
[0045]实施例6 PeptideiMo-POM抑制A β 40聚集浊度实验
[0046]浊度是A β 40溶液光密度变化的反应指标，它能指示所有类型的A β 40聚集的总量，包括各种二聚体、寡聚体以及无定形聚集等。分别取已配置好的50yLAi340母液置于于ImL离心管，分别按上述实验设置对照组、实验组，在实验组加入4 μ L的氯化锌溶液和不同浓度的 Mo-POM 和 PeptideOMo-POM(5 μ g/mL、10 μ g/mL、20 μ g/mL)，然后加入缓冲液至总体积为100 μ L，充分混匀。配置好的样品置于37°C孵育2天。最后在每个离心管内加入缓冲液至总体积1000 μ L，混匀，用紫外分光光度计检测吸光度(405nm)。
[0047]结果如图4，当加入Zn2+后，Αβ 40溶液的浊度明显上升，说明Zn 2+能加剧Αβ纤维化的程度。而加入不同浓度的Mo-POM或P^tideOMo-POM后，可以发现，随着加入纳米浓度的增加，A β 40溶液的浊度则逐渐下降，说明Mo-POM和P印tideOMo-POM都能有效抑制Αβ 40的聚集以及纤维化，并且P印tideOMo-POM表现出了更好的抑制效果。(注:本实施例使用的P印tide@Mo-POM为实施例3制备得到的P印tide@Mo_POM。)
[0048]实施例7 Αβ纤维化的抑制和降解实验
[0049]本实施例研究Mo-POM和P印tide@Mo-P0M对A β纤维化的抑制和降解。即在抑制纤维化试验中，先将新鲜配制的Αβ溶液与Zn2+溶液混合，5min后，分别加入Mo-POM和PeptideOM0-POM共同孵育72h。在降解试验中，先将新鲜配制A β溶液与Zn2+溶液混合，共同孵育48h，形成纤维后，再加入Mo-POM和P印tide@Mo-P0M共同孵育72h。首先，我们采用TEM透射电镜进行观测，如图5所示，(a)为抑制试验，(b)为降解试验。可以发现在抑制试验(a)中，Mo-POM和Zn2+共同孵育，Αβ纤维结构有所减少，但纤维结构依然存在，且相互缠绕，而大部分的Mo-POM则聚集成较大的纳米颗粒，散落分布在纤维的周围。说明Mo-POM与Αβ纤维的亲和性不高，抑制效果不好。而加入P印tide@Mo-P0M后，Αβ纤维显著减少，只存在少量较短的低聚物，说明P^tideOMo-POM良好的抑制A β纤维化的能力，大部分的A β依然以单体形式存在，只有少量发生了聚集。同样的，在降解试验(b)中，Αβ和Zn2+共同孵育48h后，形成了大量的纤维，并且出现了团聚缠绕的现象。48h后加入Μο-Ρ0Μ，Αβ纤维减少但依然清晰可见较多较长的纤维。并且跟上述结果类似，大部分Mo-POM并没有与A β纤维结合，只是分布在周围。当加入PeptideOM0-POM共同孵育后，可见大量的纤维发生断裂，形成长度较短的小纤维。以上结果说明，PeptideOMo-POM不仅具有抑制A β单体形成纤维的能力，而且还具有降解Αβ纤维的能力。(注:本实施例使用的PeptideOMo-POM为实施例1制备得到的P印tide@Mo-P0M。)
[0050]实施例8 A β 40纤维诱导PC12细胞凋亡
[0051]本实施例研究了 A β 40纤维诱导PC12细胞凋亡和P印tide@Mo-P0M对神经细胞的保护作用。采用PC12细胞作为细胞模型，PC12细胞的异常与阿尔兹海默症发生有着密切的关系，是体外研究AD的主要模式细胞。通过MTT法对自身孵育72h A β 40以及在Zn2+诱导下孵育72h A β 40，还有单独的Ζη2+、Ρ印tide、Mo-P0M以及P印tide@Mo_P0M对PC12的细胞毒性进行评估。结果如图6，加入单独孵育72h的Aβ 40作用细胞48h后，细胞活性降到60%左右；在Zn2+共同孵育的A β 40作用下，毒性显著增加，细胞活性降低到50%以下。说明在Zn2+诱导下，Αβ40聚集作用加剧，形成的Αβ纤维具有很大的神经毒性。而单独加入的Ζη2+、Ρ印tide、Mo-P0M以及P印tide@Mo-P0M没有明显毒性，细胞活性不受影响，都在90%以上。为进一步研究P印tideOMo-POM对PC12细胞的保护作用，在Zn2+存在的情况下，分别加入P印tide、Mo-POM以及P印tide@Mo_P0M和Αβ 40共同孵育72h后，再与PC12细胞作用。结果如图7所示，Peptide和Mo-POM对PC12细胞具有一定的保护作用，与Zn2+诱导下Αβ 40相比，细胞活性由38.9%分别增加到43.9%和52.8%。而加入P印tide@Mo-P0M后，PC12细胞活性显著增加，达到75%以上。以上结果说明，PeptideOMo-POM具有良好的保护PC12免受A β 40毒性的作用，能有效降低Zn2+诱导A β 40纤维化产生的细胞毒性。(注:本实施例使用的P印tide@Mo-P0M为实施例1制备得到的P印tide@Mo_P0M。)
[0052]实施例9 PeptideiMo-POM透过血脑屏障BBB的能力
[0053]本实施例以bEnd.3为血脑屏障模型，采用Transwell实验研究纳米透过血脑屏障的能力。
[0054]构建BBB体外模型:在TranswelI上层接种bEnd.3细胞，初始密度为I X 15个细胞/孔。下层接种PC12细胞，待细胞贴壁后在Transwell上层中加入荧光标记的PeptideFAM和P印tideFAM@Mo_POM纳米，培养3天后，用激光共聚焦检测下层PC12细胞中纳米的焚光。结果如图8所示，在Transwell上层加入单独的PeptideFAM孵育后在PC12细胞中检测到的荧光很少，说明单独的P印tideFAM透过血脑屏障的能力很差，而对于P印tideFAMOMo-POM，在Transwell上层孵育3天后，在下层PC12细胞中检测到了很强的荧光，这说明与单独的P印tideFAM相比，PeptideiMo-POM能有效的提高多肽透过血脑屏障的能力。(注:本实施例使用的PeptideOMo-POM为实施例1制备得到的PeptideOMo-POM。)
【主权项】
1.一种多肽功能化的钼多金属氧酸盐纳米，其特征在于，是将钒掺杂的多钼氧酸盐Mo-POM经A β靶向多肽修饰而成。2.根据权利要求1所述的多肽功能化的钼多金属氧酸盐纳米，其特征在于，所述的钒掺杂的多钼氧酸盐 Mo-POM 的分子式为(H2O) 3 (NH4)18 [Mo57V6 (NO3)6O183 (H2O)183].56Η20 ;所述A β 靶向多肽为 Ac-QKLVFF-NH2。3.权利要求1或2所述的多肽功能化的钼多金属氧酸盐纳米的制备方法，其特征在于，包含如下步骤:将钒掺杂的多钼氧酸盐Mo-POM溶液与Ac-QKLVFF-NH2S肽溶液混合，室温下搅拌10?60min，然后在O?10°C陈化6?24h，最后将混合溶液离心、超声、洗涤、干燥即得多肽功能化的钼多金属氧酸盐纳米。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，钒掺杂的多钼氧酸盐Mo-POM溶液的浓度为100?500 μ M，Ac-QKLVFF-NH2多肽溶液的浓度为10?50mM。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，钒掺杂的多钼氧酸盐Mo-POM溶液的浓度为100?300 μ M，Ac-QKLVFF-NH2多肽溶液的浓度为10?30mM。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，钒掺杂的多钼氧酸盐Mo-POM溶液的浓度为200 μ M，Ac-QKLVFF-NH2多肽溶液的浓度为20mM。7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，钒掺杂的多钼氧酸盐Mo-POM溶液和Ac-QKLVFF-NH2多肽溶液的体积比为5?10:1。8.钒掺杂的多钼氧酸盐Mo-POM或权利要求1所述的多肽功能化的钼多金属氧酸盐纳米在制备治疗阿尔兹海默症的药物中的应用。9.钒掺杂的多钼氧酸盐Mo-POM或权利要求1所述的多肽功能化的钼多金属氧酸盐纳米作为Αβ聚集抑制剂或A β纤维化抑制剂的应用。10.钒掺杂的多钼氧酸盐Mo-POM或权利要求1所述的多肽功能化的钼多金属氧酸盐纳米作为药物载体的应用。
【专利摘要】本发明涉及金属纳米材料制备领域，具体公开了一种多肽功能化的钼多金属氧酸盐纳米及其制备方法和应用。所述的多肽功能化的钼多金属氧酸盐纳米是将钒掺杂的多钼氧酸盐Mo-POM经Aβ靶向多肽修饰而成。能够有效抑制Aβ自身的聚集和Zn2+诱导的纤维化，同时，对于已经形成的Aβ纤维还表现出了量好的降解能力；此外，还具有良好的透过血脑屏障的能力，可以作为一种潜在的治疗阿尔兹海默症的药物。
【IPC分类】A61K33/24, A61K47/48, A61P25/28
【公开号】CN105012342
【申请号】CN201510271613
【发明人】刘杰, 尹田田, 陈庆昌
【申请人】暨南大学
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年5月25日