感染的心肌细胞表面面积则比对照组AdGFP明显 减少（图2)，即ACE3的干扰腺病毒促进心肌细胞肥大，ACE3的过表达腺病毒抑制心肌细胞 肥大。
[0049] 实施例3心肌肥厚模型小鼠心肌肥厚及纤维化检测和心功能检测 1.采用主动脉弓缩窄手术（AB)建立小鼠心肌肥厚模型 选用8-10周龄、体重在23. 5-27. 5g的野生型小鼠（WT)、ACE3基因敲除小鼠 (ACE3-KO)、心脏特异性ACE3转基因小鼠（ACE3-TG)、及非转基因小鼠（NTG)各分成假手术 组（Sham)和AB术心肌肥厚模型组，即WT Sham组、WT AB组，ACE3-KO Sham组、ACE3-KO AB 组，ACE3-TG Sham组、ACE3-TG AB组，NTG Sham组、NTG AB组，每组10只小鼠。造模方法 同实施例1。AB术后4周分别进行心肌肥厚及纤维化的检测和心功能的检测。
[0050] 2?取材 (1)前期工作：预先准备装有20mL的体积分数10%甲醛的尿杯，并贴好标签(小鼠编号、 组别、手术类型及取材日期)。将倒满质量分数10% KC1溶液的培养皿置于取材处。打开分 析天平，调零备用。再称重处死小鼠。
[0051] (2)取材：眼科弯镊夹住心耳下方的血管蒂，剪下心脏，迅速置于质量分数10% KC1 溶液中。待心脏停跳在舒张期后，置于灭菌纱布上，轻轻挤压心腔内液体，蘸干表面液体后， 称重并记录，将心脏放入相应的尿杯中，固定48h后用于病理学检测。
[0052] (3)相关测量及计算：取出小鼠肺脏，修剪后滤纸吸干，称重并记录。剪开小鼠后 肢胫骨处皮肤，测量并记录胫骨长度。计算心重与体重的比值（HW/BW)，肺重与体重的比值 (LW/BW)以及心重与胫骨长度的比值（HW/TL)。
[0053] 3?病理学检测 3. 1制备石蜡标本切片 主要操作程序包括修剪心脏一包埋框处理一流水冲洗一脱水一透明一浸蜡一包埋一 切片一摊片一晾干或烘烤后备用。
[0054] 3. 2苏木精-伊红（HE )染色 主要步骤为：取石蜡标本切片55°C烘烤30min -二甲苯5min，3次一100%酒精 lmin - 95%酒精lmin - 70%酒精lmin -双蒸水lmin -苏木素溶液(珠海贝索，BA-4021) 5min -水洗lmin - 1%盐酸酒精(取3mL浓盐酸与297mL 70%酒精充分混合均匀）l-3s - 水洗lmin - Scott液(碳酸氢钠0. 35g，七水硫酸镁2g，两者溶于100mL蒸馏水)lmin -水 洗lmin -伊红溶液(珠海贝索，BA-4024) 3-5min -蒸馏水洗去浮色一70%酒精Is - 95% 酒精Is - 100%酒精30s，3次一二甲苯2min，3次一趁二甲苯未干立即封片一通风橱内吹 干，显微镜拍照。
[0055] HE染色图片统计：每张图片选择3个以上边界清楚，核大致位于中央的细胞，用 Image-Pro Plus 6. 0软件圈细胞面积。
[0056] 3.3天狼星红（PSR)染色 主要步骤为：取石蜡标本切片55°C烘烤30min -二甲苯2min，3次一100%酒精 lmin - 95%酒精lmin - 70%酒精lmin -流水冲洗lOmin -双蒸水lmin -质量分数0. 2%磷 钼酸2min - 0. 1%天狼猩红苦味酸溶液滴于组织上，湿盒中染色90min -去除残液一0. 01N 盐酸4s - 70%酒精1次一90%酒精1次一100%酒精30s，3次一二甲苯2min，3次一趁二 甲苯未干立即盖玻片封片，显微镜拍照。
[0057] PSR染色图片统计（Image-Pro Plus 6. 0软件):胶原比例=胶原面积八总面积-空 白面积）X 100%。
[0058] 心肌组织由心肌细胞和间质组织组成，心脏是一终末分化器官，心肌细胞失去增 殖能力，各种生理或病理性刺激引起的心肌细胞反应，只能是单个细胞的体积增大而不能 在数量上增殖。因此，在心肌肥厚的病理生理过程中，主要表现为心肌细胞体积增大，肌节 数量增多，细胞排列紊乱，心脏间质改变包括心肌成纤维细胞的增殖与转化，胶原纤维密度 增加，胶原分泌增加，胶原比例平衡失调等。
[0059] WT和ACE3-K0小鼠采用AB术建立心肌肥厚模型后的表型结果见图3-5。Sham(假 手术）组中WT小鼠和ACE3-K0小鼠的Hff/BW、LW/BW及HW/TL之间的差异均无统计学意义； ACE3-K0 小鼠 AB 术后 4 周的 Hff/BW、LW/BW、HW/TL 高于其 Sham 组；AB 术后 4 周，ACE3-K0 小鼠的Hff/BW、LW/BW及HW/TL均较WT小鼠升高（图3)。HE染色切片可观察到：Sham组心 脏无明显差异，AB组较Sham组的心脏均增大，ACE3-K0组小鼠的心脏明显大于WT组小鼠； Sham组心肌肌原纤维细胞排列整齐、致密，形态完整，胞核及核仁结构清晰；AB组肌丝排列 紊乱、松散，心肌细胞体积明显增大，形态不规整，胞核深染、增大、畸形，核仁模糊，WT组则 无ACE3-K0组细胞肥大明显，差异有统计学意义（图4)。PSR染色后，发现AB组心室心肌间 质胶原含量较Sham组增加，动脉血管周围胶原增加更为明显，胶原增粗，排列紊乱成网络 状；ACE3-K0小鼠AB术后心肌间质胶原含量及血管周围胶原含量则比WT小鼠AB术后增加 较多（图5)。以上结果说明经AB术建模后，小鼠发生明显的心肌肥厚，ACE3-K0小鼠的心肌 肥厚及纤维化程度大于WT小鼠。
[0060] 图6-8是NTG和ACE3-TG小鼠采用AB术建立心肌肥厚模型后的表型结果。NTG小 鼠AB术后4周的Hff/BW、LW/BW及HW/TL高于其Sham组；AB术后4周TG小鼠的Hff/BW、LW/ BW及HW/TL增大的程度明显小于NTG小鼠（图6)。HE染色切片可观察到：AB组较Sham组 的心脏均增大，且AB术后TG小鼠心脏增大的程度远小于NTG小鼠；TG小鼠AB术后心肌细 胞横截面积增加小于NTG小鼠AB组（图7)。PSR染色可见，TG小鼠AB术后心肌间质胶原 含量及血管周围胶原含量小于NTG小鼠AB组（图8)。以上结果说明经AB术建模后，小鼠发 生明显的心肌肥厚，ACE3-TG小鼠的心肌肥厚及纤维化程度小于NTG小鼠。
[0061] 4?超声检测心功能 4. 1前期准备 (1)麻醉机准备：先连接氧气瓶和麻醉机上的进气接口，再拧开麻醉机上加药口密封 盖，迅速加入异氟烷至安全刻度后拧紧密封盖。拧开氧气瓶上总阀门，调整流量控制阀的旋 钮，出气压力维持在〇? 2-0. 3mPa。
[0062] (2)待测小鼠准备：待检测小鼠用异氟烷迅速麻醉后，左胸前区剃毛，将处理好的 小鼠头部伸入麻醉剂导管套头内，以1. 5-2. 0%异氟烷维持小鼠稳定的麻醉状态。
[0063] 4.2心功能检测 小鼠取左侧卧位或仰卧位，并在剃毛区均匀涂抹超声耦合剂(天津成信公司）。采用 高频超声诊断仪，频率为15MHz，选取标准左心室乳头肌短轴切面，测量左室舒张末期内径 (LVEDd)、左室收缩末期内径（LVESd)及短轴缩短率（FS)。
[0064] 图9是WT和ACE3-K0小鼠采用AB术建立心肌肥厚模型后心功能的检测结果。与 WT Sham组相比，WT小鼠AB术后4周表现出心功能减弱和心肌肥厚，主要表现为心肌肥厚 的指标LVEDd、LVESd均不同程度的增加，而反映心功能的指标FS则下降。AB术后4周， ACE3-K0小鼠心肌肥厚的指标增大的程度及反映心功能的指标下降的程度大于WT小鼠（图 9)。这些结果均与ACE3-K0小鼠心肌肥厚程度较大的结果一致。
[0065] 图10是NTG和ACE3-TG小鼠采用AB术建立心肌肥厚模型后心功能的检测结果。 AB术后4周，与NTG小鼠相比，TG小鼠心肌肥厚的指标增大的程度及反映心功能的指标下 降的程度则小于NTG组（图10)。
[0066] 由以上结果可知，在主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚疾病模型中，ACE3基因缺陷显 著促进了心肌肥厚、纤维化，恶化心功能，ACE3基因过表达显著抑制了心肌肥厚、纤维化，保 护心功能。因此ACE3基因具有保护心功能和抑制心肌肥厚及纤维化的作用，特别是ACE3 基因具有能够抑制主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚相关疾病发生的作用。
[0067] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 血管紧张素转化酶3在筛选保护心脏功能的药物中的应用。2. 血管紧张素转化酶3在制备保护心脏功能的药物中的应用。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于：包括血管紧张素转化酶3作为保护心脏 功能的药物的有效成分，能够促进血管紧张素转化酶3表达的化学物质作为保护心脏功能 的药物的有效成分。4. 血管紧张素转化酶3在筛选抗心脏纤维化的药物中的应用。5. 血管紧张素转化酶3在制备抗心脏纤维化的药物中的应用。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于：包括血管紧张素转化酶3作为抗心脏纤 维化的药物的有效成分，能够促进血管紧张素转化酶3表达的化学物质作为抗心脏纤维化 的药物的有效成分。7. 血管紧张素转化酶3在筛选预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物中应用。8. 血管紧张素转化酶3在制备预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物中应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于：包括血管紧张素转化酶3作为预防、缓解 和/或治疗心肌肥厚的药物的有效成分，能够促进血管紧张素转化酶3表达的化学物质作 为预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物的有效成分。
【专利摘要】本发明公开了一种血管紧张素转化酶3（ACE3）在治疗心肌肥厚中的功能及应用，属于基因的功能与应用领域。本发明确定了ACE3的表达与心肌肥厚之间的相互关系，研究结果表明在发生心肌肥厚的模型中，ACE3的表达和正常组相比显著降低；抑制ACE3表达显著促进了心肌肥厚、纤维化，恶化心功能，促进ACE3过表达则显著抑制了心肌肥厚、纤维化，保护心功能。因此，ACE3可作为靶基因，用于筛选保护心脏功能、抗心脏纤维化和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物，用于制备保护心脏功能、抗心肌肥厚和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物，为心肌肥厚的治疗提供了一条有效的新途径。
【IPC分类】A61K38/48, A61P9/00, A61K45/00, C12Q1/68
【公开号】CN105106944
【申请号】CN201510639123
【发明人】李红良, 张志仁, 于长江, 张晓晶
【申请人】武汉大学
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年9月29日