B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1分钟后，将膜蛋白面朝下与此混合液 充分接触；1分钟后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹子中。在暗室 中，将IX显影液和定影液分别到入玻璃盘中；在红灯下取出X-光片，用剪刀剪下适当大 小，比PVDF膜略大；打开X-光片夹，把X-光片放在膜上，关好X-光片夹，开始计时；根据 信号的强弱调整曝光时间长短，一般为1到5分钟，也可选择不同时间多次压片，可达最佳 效果；曝光完成后，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显 影。显影时间一般为两分钟左右，溫度低于16°C需适当延长显影时间；显影结束后，马上把 X-光片浸入定影液中定影5到10分钟，W胶片透明为止；用蒸馈水冲去残留的定影液后， 室溫下惊干。
[0079] G.凝胶图象分析
[0080] 将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度 值。
[0081] H.数据处理及统计
[0082] 对实验结果进行方差分析，结果用Mean±SEM表示。数据差异显著性采用t检验。 P < 0. 05和P < 0. 01分别代表差异显著和极其显著。
[0083] 结果表明：不同浓度木犀草素作用后都能够降低肠毒素A、B的分泌，高浓度木犀 草素对肠毒素A、B分泌的抑制作用强于低浓度。结果见图4.
[0084] < 实例5〉 阳0化]木犀草素对对金葡菌agrA和hlamRNA水平的影响
[0086] 收集不同亚抑菌浓度木犀草素处理下5.aureusN315菌体，利用化bo化re?试剂 盒提取总RNA;应用:PrimeScript⑧RT试剂盒将RNA反转录成cDNA，-20°C保存备用；巧光 定量PCR所用引物WS.aureusN315基因为模板，引物由北京六合华大基因科技股份有限 公司合成RT-PCR引物：
[0087] 16SrRNA-F5' -CGTGCTACAATGGACAATACAAA-3';
[0088] 16SrRNA-R5' -ATCTACGATTACTAGCGATTC-CA-3';
[0089]agrA-F5^ -TGAAATTCGTAAGCATGACCC-3^；
[0090]agrA-R5^ -CATCGCTGCAACTTTGTAGAC-3^；
[0091]hla-F-TCACTTTCCAGCCTACT-3';
[0092] -TTGGTGCAAATGTTT-C-3< 。 阳〇9引按照SYBR够PremixExhq? (ROX)操作方法进行，使用ABr於ism:猿7500 实时巧光定量PCR仪进行巧光定量PCR扩增反应体系为25L反应条件为：95°CImin; 95°C15s' 60°C34s，72°Clmin，40 个循环。leSrRNA作为内参，2 方法进行分析。
[0094] 结果表明木犀草素亚抑菌浓度1/16MIC、1/8MIC对S.aureusN315hla和agrA基 因转录具有明显的抑制作用。结果见图5、6。 阳0巧] < 实例6〉
[0096] 一种抑制金黄色葡萄球菌生物膜形成的药物组合物，按重量份数计，所述药物组 合物包括：
[0097] 木犀草素7;酸不溜根100和蒲公英1300。
[0098] 其中，所述药物组合物的应用条件为：抑值为5. 2、溫度25°C。
[0099] < 实例7〉
[0100] 一种抑制金黄色葡萄球菌生物膜形成的药物组合物，按重量份数计，所述药物组 合物包括：
[0101] 木犀草素7. 8 ;酸不溜根150和蒲公英1450。 阳102] 其中，所述药物组合物的应用条件为：抑值为5. 6、溫度30°C。 阳103] <实例8〉
[0104] 一种抑制金黄色葡萄球菌生物膜形成的药物组合物，按重量份数计，所述药物组 合物包括： 阳1化]木犀草素8. 4 ;酸不溜根200和蒲公英1600。
[0106] 其中，所述药物组合物的应用条件为：抑值为6. 2、溫度34°C。 阳107] <实例9〉
[0108] 一种抑制金黄色葡萄球菌生物膜形成的药物组合物，按重量份数计，所述药物组 合物包括：
[0109] 木犀草素9;酸不溜根230和蒲公英1800。
[0110] 其中，所述药物组合物的应用条件为：抑值为6. 9、溫度38°C。 阳111] 设置对比试验验证抑制金黄色葡萄球菌生物膜形成的药物组合物的药效，其中， 设置酸不溜根和蒲公英为对照实验组1和实验组2,取与 < 实例6〉-<实例9〉所对应的应用 条件和相同剂量进行对金黄色葡萄球菌抑菌试验，试验结构见下表1阳112]
[0113] 表1中数据说明本发明提供的抑制金黄色葡萄球菌生物膜形成的药物组合物只 需要极少量的木犀草素就能够有效抑制金黄色葡萄球菌生物膜形成，降低其耐药性，同时 应用合适比例的酸不溜根和蒲公英能够对游离的金黄色葡萄球菌进行有效抑制甚至杀死 菌体，总体上有效抑制金黄色葡萄救球群体感应系统，有效减少其感染致病性，为医学上制 备特异的抑制金黄色葡萄球菌生物膜形成的制剂提供有价值的参考。
[0114] 尽管本发明/发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式 中所列运用。它完全可W被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言， 可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发 明并不限于特定的细节和运里示出与描述的图例。
【主权项】
1. 木犀草素在制备抑制金黄色葡萄球菌生物膜形成的药物中的应用。2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，木犀草素在抑制金黄色葡萄球菌生物膜形 成中的最小有效浓度为8 y g/mL。3. 木犀草素在制备降低金黄色葡萄球菌毒力因子致病性的药物中的应用。4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌毒力因子为a -溶血 素、凝固酶和肠毒素A、B。5. 如权利要求3所述的应用，其特征在于，木犀草素在降低金黄色葡萄球菌中凝固酶 产生的最低有效浓度为16 y g/mL ;木犀草素在降低金黄色葡萄球菌中a -溶血素产生的最 低有效浓度为8 y g/mL，木犀草素在降低金黄色葡萄球菌中肠毒素A、B产生的最低有效浓 度为 8 y g/mL。6. 木犀草素在制备抑制金黄色葡萄球菌hla和agrA基因转录的药物中的应用。7. -种抑制金黄色葡萄球菌生物膜形成的药物组合物，所述药物组合物中含有木犀草 素。8. 如权利要求7所述的抑制金黄色葡萄球菌生物膜形成的药物组合物，其特征在于， 还包括：酸不溜根和蒲公英。9. 如权利要求8所述的抑制金黄色葡萄球菌生物膜形成的药物组合物，其特征在于， 以重量份计，所述药物组合物由以下组分组成：木犀草素7~9 ;酸不溜根100~230和蒲 公英1300~1800。10. 如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的应用条件为：pH 值为 5. 2-6. 9、温度 25-38 °C。
【专利摘要】本发明涉及医药技术领域，本发明提供木犀草素在抑制细菌群体感应系统中的应用，并为该应用提供具有应用价值的最小有效浓度，为医学上制备特异的生物膜形成抑制剂提供参考；木犀草素在制备降低金黄色葡萄球菌毒力因子致病性的药物中的应用；木犀草素在制备抑制金黄色葡萄球菌hla和agrA基因转录的药物中的应用。本发明还提供一种抑制金黄色葡萄球菌生物膜形成的药物组合物，其中含有木犀草素，该药物组合物，只需要极少量的木犀草素就能够通过有效抑制金黄色葡萄球菌的群体感应系统，抑制其生物膜形成，降低其在抗感染治疗中，向高度耐药的生物膜感染的转归风险，为医学上制备特异的抑制金黄色葡萄球菌生物膜形成的制剂提供有价值的参考。
【IPC分类】A61K31/352, A61P31/04, A61K36/704
【公开号】CN105147663
【申请号】CN201510489318
【发明人】枉前
【申请人】中国人民解放军第三军医大学第二附属医院
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年8月11日