平。如 果认为非当前规定的其它剂量水平的加入和其他患者以已测试的剂量水平加入为提供最 佳安全性及耐受性、药代动力学和药效动力学数据所必需，则可进行这些变化。
[0256] 表3临时剂量水平
[0259] *在研究过程中可添加其它和/或中间剂量水平，或可以低于MTD的任何剂量水平 添加研究队列以充分了解安全性、PK或ro。
[0260] **剂量水平-1和-2还将用于需要从起始剂量水平减少剂量的患者。该研究不允 许低于剂量水平_2的剂量减少。
[0261] 剂量递增确定的实施
[0262] 在该周期的前21天中在评估个体患者对双重组合的耐受性后将进行第二药剂的 剂量递增的确定。
[0263] 为实施剂量递增确定，将在剂量确定期间评估可获得的毒性信息（包括非DLT的 不良事件和实验室异常）、BLRM的建议和可获得的PK及信息。直至研究者收到表明已 评估前一剂量水平的结果且允许进行较高剂量水平的书面确认后才可以按下一较高剂量 水平施用药物。如果确定递增至较高剂量水平，但以前一剂量水平治疗的一个或多个其他 患者在第一治疗周期中经历DLT，则在任何其他患者以该较高剂量水平加入前将用该新信 息更新BRLM。
[0264] 剂量递增过程将逐步实施且用3个患者的队列进行。仅第二药剂、化合物F、化合 物H、化合物G或化合物C将根据BLRM递增。
[0265] 在用式⑴的B-Raf抑制剂单一药剂治疗的部分I内的任何时间均不允许进行患 者自身的剂量递增。
[0266] 在用组合治疗的第二部分期间，允许进行第二药剂的患者自身剂量递增，式（I) 的B-Raf抑制剂+化合物B分支中的患者除外，其将以式（I)的B-Raf抑制剂和化合物 B(45mg BID)的组合的所宣布的RP2D治疗。
[0267] 为使患者以化合物F、化合物H、化合物G或化合物C的较高剂量治疗，其必须耐受 较低剂量组合至少1个疗法周期（例如其不得在最初分配的一对较低剂量下经历CTCAE等 级多2的毒性，因为无法排除该毒性与研究药物的关系）。此外，待用来治疗患者的一对新 的较高剂量必须满足用于患者自身递增的改良EWOC标准（添加参考章节）。
[0268] 下一队列中新加入的患者将以末次剂量递增会议所确定的剂量开始治疗。随后将 为下一队列更新贝氏逻辑回归模型（BLRM)和患者自身剂量界限。
[0269] 治疗中断和治疗中止
[0270] 如果患者需要对式（I)的B-Raf抑制剂、化合物B、化合物F、化合物H、化合物C或 化合物G从下一计划剂量的预期日期起〉连续21天的剂量延迟，则该患者应从该研究治疗 中止。在例外情形下，如果患者明显受益于研究治疗（即稳定的疾病、部分反应、完全反应） 且研究者认为不存在安全性担忧，则患者可以按基于安全性而调节的剂量水平保留在研究 治疗中。
[0271] 分子预筛选
[0272] 分子预筛选知情同意书
[0273] 必须在任何研究相关分子预筛选程序前签署分子预筛选知情同意书（在已评定 BRAF的突变状况不属于该研究时不适用）。这仅适用于部分1患者。
[0274] 新鲜或归档活检样本的BRAF突变状况
[0275] 为进入研究的筛选期，患者必须具有BRAF V600突变的书面文件，其应在新鲜肿瘤 活检时于当地获得（优选）或可使用最新归档的肿瘤样品。必须在任何研究相关分子预筛 选程序前签署分子预筛选知情同意书（在已评定突变状况不属于该研究时不适用）。
[0276] 通过指定的当地实验室确认BRAF V600密码子（例如V600E/K/D/R)的突变且由 研究中心记录后，患者可开始筛选程序。
[0277] 治疗期
[0278] 治疗期分成两个部分：
[0279] 部分I :将在21天（3个日历周）的周期中将式⑴的B-Raf抑制剂连续给予未 曾用过BRAF抑制剂的患者，其在周期1的第1天开始。周期之间将无计划的间隔。患者将 接受式（I)的B-Raf抑制剂单一药剂，直至在发生疾病进展或不可接受的毒性（无论何者 首先发生）后开始组合治疗为止。
[0280] 部份II :接受式（I)的B-Raf抑制剂至少一个21天的周期且发生进展的患者将基 于复发时肿瘤活检中所鉴定的遗传变化进入部分II中以接受式（I)的B-Raf抑制剂+第 二药剂的治疗组合。
[0281] 无固定的治疗持续时间；患者可用式（I)的B-Raf抑制剂单一药剂继续治疗，直至 组合治疗为止，以及在第一疾病进展期间发生了妨碍任何进一步治疗的不可接受的毒性和 /或在研究者判断下或因患者拒绝（撤回同意）而中断治疗为止。在第一疾病进展时，已知 活检的分析结果后，患者可开始用式（I)的B-Raf抑制剂+第二抑制剂组合治疗，直至第二 疾病进展、发生了妨碍任何进一步治疗的不可接受的毒性和/或在研究者判断下或因患者 拒绝（撤回同意）而中断治疗为止。
[0282] 尽管患者要求>21天的剂量中断，但因患者经历了临床获益的客观证据且研究者 认为患者保留在研究中具有最佳利益，则患者保留在研究中。
[0283] 贝氏逻辑回归模型
[0284] 由EWOC原理指导的自适应BLRM将指导每种研究药物（化合物F、化合物H、化合 物G或化合物C)与式（I)的B-Raf抑制剂的组合至其相应的MTD/RP2D的剂量递增。对于 各组合，将对整个剂量递增期间所收集的周期1剂量限制毒性数据（即不存在或存在DLT) 拟合组合治疗的5参数BLRM，以模拟与式（I)的B-Raf抑制剂组合给予的化合物F、化合物 H、化合物G或化合物C的剂量-毒性关系。
[0285] 附录1中提供BLRM的定义、模型参数的先验分布（以关于靶向剂当前可获得的信 息为基础）和DLT率的相关先验分布。
[0286] 剂量推荐
[0287] 组合搭配物的剂量推荐受限于进入部分II的患者之间可能不同的式（I)的B-Raf 抑制剂的剂量。该推荐将基于DLT率的后验概述，其包括平均值、中值、标准偏差、95%可信 区间和各剂量组合的真实DLT率在以下种类之一中的概率：
[0288] [0%，16% ]剂量不足
[0289] [I6%，35% ]靶向毒性
[0290] [35%，100% ]过度毒性
[0291] 按照EWOC的原理，在各患者队列后，推荐的剂量组合是这样的组合，其在满足以 下超剂量标准的剂量之间的目标区间[16%，35% ]中具有DLT的最高后验概率：存在低 于25%几率的过度毒性。另外，两种研究药物的队列内最大组合剂量递增限于100%，其中 100%是指各研究药物的相对递增的总和，即对于式（I)的B-Raf抑制剂（其剂量不能超过 450mg)以及对于第二靶向剂（可用时其不能递增至超过其s. a. MTD/RP2D)分别为0%和 100%〇
[0292] 组合搭配物的患者自身剂量递增将限于50%且将由BLRM根据反映个体患者耐受 性的以下改良EWOC标准指导：患者的自身剂量将能够递增至存在低于40%几率的过度毒 性的剂量。此外，如果在某一剂量水平下在2个或更多个患者中观察到CTCAE 2级的治疗 相关毒性或如果任何患者经历3级或更高的毒性，则组合搭配物的剂量增加将<任何后续 剂量增加的25%。
[0293] 剂量递增会议上将使用可获得的毒性信息（包括非DLT的AE)、ΡΚ、Η)和功效信息 以及来自贝氏模型的建议的临床综合结果来确定下一队列的剂量组合。研究者和试验人员 将参与决策。
[0294] 如果队列中的前2个可评估患者在第3个患者加入前经历DLT，则将在任何其他患 者加入该队列前再评估任何组合的模型。各组合的最终推荐MTD/RP2D将基于对来自BLRM 的建议的考虑以及基于安全性的整体评定，该整体评定考虑到来自所测试的所有不同剂量 组合的后续周期的耐受性数据。
[0295] 实施例2
[0296] 材料和方法
[0297] 在DMSO中制备化合物储液，其最终浓度为10mM。在适当的细胞培养基中以3倍增 量连续稀释工作储液以获得在2. 7 μ M至I. 2nM范围内的最终测定浓度。
[0298] 细胞系、细胞培养物、细胞活力测量
[0299] A-375和WM-266-4细胞购自美国典型培养物保藏中心（ATCC)。将A-375细胞培养 于DMEM培养基（ATCC)中，且将WM-266-4细胞培养于EMEM培养基（ATCC)中，这两种培养基 均补充有10%胎牛血清（Gibco)，然后在37°C/5% C02下温育。从Novartis-Emeryville 获得经工程改造以表达常见的指示抗性的等位基因的细胞系。这些抗性模型包括表达突 变型MEK1P124L、截短型p61-BRAFV600E或突变型NRASQ61K的A-375细胞，以及表达突 变型MEK1C121S、截短型p61-BRAFV600E或突变型NRASQ61K的WM-266-4细胞。将这些 细胞培养于具有选择标记物G418且存在5uM LFE158(MEK突变体）或LIH720(截短型 P61-BRAFV600E)的适当的母培养基中。
[0300] 板布局、细胞分配和化合物添加
[0301] 对于筛选，使用具有8通道标准盒的MultiDrop Combi (Thermo-Fisher)将细胞以 每孔 500 (A-375)或 750 (WM-266-4)个的细胞密度接种于 384 孔板（Thermo Scientific， 目录号4332)中的80ul培养基中。为促使细胞在整个孔中均匀分布，将细胞在1000RPM下 短暂离心并在室温下温育30分钟。在37°C、5% C02下温育所有板24小时，随后添加化合 物。在适当的培养基中新鲜制备化合物储液，并使用配有200nl针式工具的PAA机器人添 加。在最少三个重复孔中，均通过经由Cell Titer Glo(Promega)根据制造商的方案对细 胞ATP水平定量以及通过显微成像来评定72小时后单一药剂和组合的作用。对于成像，将 细胞固定于板并经由WellMate分配器以受控的分配速度用10% PFA、0. 3% TX-100于PBS 中的溶液透化。用Hoechst 33342 (H3570, Invitrogen)将细胞核染色，并通过BioTek洗涤 器执行所有必需的洗涤步骤。
[0302] 自动化图像分析
[0303] 得自 InCell Analyzer 2000 (GE Healthcare, 28-9534-63)的图像为 TIFF 格式且 具有2048x2048像素的大小，从而捕获384孔板的所有孔。使用开放源代码中的定制脚本、 统计编程语言R和BioConductor软件包EBImage的函数建立自动化图像分析流程。目标 是作为细胞活力的近似值对每个孔的活（细胞）核的数量定量。该流程由七个步骤构成： (I.)使图像平滑以减少强度峰的数量，（II.)应用阈值函数分离前景（信号）与背景（噪 声），（ΠΙ.)鉴定前景中作为细胞核的种子的局部最大值，（IV.)滤除极为贴近的局部最大 值，（V.)从剩余局部最大值使细胞核繁殖，（VI.)以及从繁殖的细胞核提取目标特征（细 胞核数量、尺寸特征和强度特征）。作为最后一步（VII.)，为排除对碎片（例如破裂的细胞 核）进行计数，分别使用在DMSO和星形孢菌素（Staurosporin)处理的孔中所鉴定的目标 来获得活的和破裂的细胞核的特征分布。使用这些分布来设定区分活细胞核与破裂细胞核 的截止值。从所鉴定的目标的总数减去破裂细胞核的数量，并将结果报道为该孔的最终计 数。
[0304] 数据归一化
[0305] 数据包含各处理（化合物）条件-DMSO处理孔的42个重复样和星形孢菌素处理 孔的两个重复样的三个重复测量结果。将数据归一化至DMSO测量结果的中值，且通过计算 三个重复测量的中值来概述。将数据导入Chalice中以计算化合物协同作用。
[0306]
[0308] 实施例3
[0309] 在七个BRAF突变CRC衍生细胞系中RAF激酶抑制剂（式⑴化合物）和PIK3C α 激酶抑制剂（化合物X)的单一药剂和组合对增殖的作用。所有细胞系均表达BRAFV600E蛋 白。在ΡΙ3Κα基因中具有已知或推定的活化突变的细胞用（*)标记，而PTEN缺失的细胞用 (#)标记。在72小时cell titer glo?测定中测量了细胞增殖，且所提供的所有结果均为 至少三次重复测量的结果。示出了式（I)化合物和化合物X的单一药剂IC50值。表6中 针对各组合给出了 50%作用水平下的协同作用评分（SS)测量结果以及组合指数（CI50)。 当SS值彡2. 0且CI值< 0. 5时，认为相互作用为协同作用。当SS值彡2. 0但CI值>0. 5 或SS值〈2. 0但CI值< 0. 5时，认为相互作用为相加作用/协同作用。当SS值〈2. 0且CI 值>0. 5时，相互作用称为相加作用。协同作用的叫法在"作用描述"列中给出。
[0310] 表 6
[0311] 在8狀?￥6_突变CRC细胞系中式（I)化合物与化合物X的组合
[0312]
[0313] 实施例4
[0314] 该实施例研究单一药剂形式和组合形式的式（I)化合物和化合物F在体内对 HT-29和RKO细胞系模型的生长的作用。这些抑制剂的浓度和给药计划为每天一次50mg/ kg (式（I)化合物）和每天一次32. 7mg/kg(化合物F)。所有化合物均在其为单一药剂形 式时组合给药。在HT-29模型中在第28天停止给药且在21天后在RKO模型中停止给药。 结果分别在图1和图2中报道。
[0315] 实施例5
[0316] 所有细胞系均购自 ATTC(SK-MEL-5、SK-MEL-24、UACC-62、COLO 741、C0L0-800、 WM-266-4、C〇1〇205、LS411N、SW 1417)、ECACC(MDST8)、DSMZ(CL-34)和 NCI (L0X 頂VI)。 根据供应商的建议，将细胞培养于补充有10% (或对于CL-34细胞为20% )FBS(GIBC0， 目录号 10099-141)的 RPMI1640(ATCC，目录号 30-2001)或 DMEM(ATCC，目录号 30-2002) 中。将细胞系培养于37°C和5%C02培养箱中且在T-75烧瓶中扩增。在所有情况 下，均将细胞从冷冻储液解冻，经由多1代使用1:3稀释度扩增，使用ViCell计数器 (Beckman-Coulter)计数且评定活力，随后涂于96孔或6孔板中。为使细胞系分裂和扩 增，使用〇. 25 %胰蛋白酶-EDTA (GIBC0,目录号25200)从烧瓶取出细胞。如通过在Idexx Radii (Columbia，MO, USA)执行的PCR检测方法所测定，所有细胞系均确定为不含支原体污 染，并通过检测一组SNP而正确鉴定。