>[0317] 将式（I)化合物和化合物H以IOmM的浓度溶于100 % DMSO(Cellgro,目录 号25-290-CQC)中且储存在-20°C直至使用。将化合物排列于2ml深96孔板（Greiner bio-one，目录号780271)中，连续3倍稀释七次，得到22nM至16200nM的浓度范围。重组 人碱性FGF购自R&D system (目录号233-FB)且以50 μ g/ml在无菌PBS中复原。在所有 实验中其均以固定浓度l〇〇ng/ml使用。
[0318] 对于CellTiter-Glo?测定，将细胞分配于组织培养物处理的96孔板（Costar，目 录号3904)中，培养基的最终体积为80 μ L且密度为每孔3000个细胞。涂布后12至24小 时，将20 μ L各化合物连续稀释液转移至含有细胞的板，通过3倍稀释产生2700ηΜ至3. 7ηΜ 的化合物浓度范围且最终DMSO浓度为0. 16%。各孔的总体积为120 μ L。温育板72小时 并使用CellTiter-Glo?发光细胞活力测定（CTG, Promega)和Victor ? Χ4酶标仪（Perkin Elmer)测定化合物对细胞增殖的作用。对于实时生长测定，将细胞以每孔4000个细胞的 密度接种于xCELLigence E-板（Roche目录号05232368001)中总共90 μ 1的培养基中，且 在涂布后24小时，向孔中添加11 μ 1含有或不含化合物的培养基。除LGX818+FGF2处理的 COLO 741细胞（N= 1)外，对于所有细胞系和处理组，均涂布2-4个重复孔。其中化合物和 生长因子的所示最终浓度对于化合物H为luM，对于FGF2为100ng/ml且对于式（I)化合 物为IOOnM(SK-MEL-5)或500nM(C0L0 741)。用xCELLigence基于阻抗的实时细胞分析仪 每两个小时连续监测细胞持续七天。使用电极在E-板上测量阻抗，其中细胞的表面积覆盖 率越高产生的电极阻抗越大。电极阻抗以细胞指数值呈现，且用作细胞活力和数量的指示。 在所有情况下，均将细胞指数值归一化为添加化合物后所紧邻的时间点。
[0319] 对于Western分析，将细胞以每孔5x105个细胞的密度涂布于6孔（Costar，目录 号3506)板中的2. Oml完全培养基中。涂布后12至24小时，用各种化合物处理细胞，且 在所有实验中，式（I)化合物、化合物H和FGF2均分别以100nM、1.0 uM和lOOng/ml的最 终浓度使用。在新鲜制备的补充有磷酸酶（PhosStop，目录号04906845001)与蛋白酶抑制 剂（Roche，目录号11697498001)的细胞裂解缓冲液（Cell Signaling Technology目录号 9803)中添加化合物后2小时和24小时收获细胞。通过电泳经由NuPAGE4-12% Bis-Tis midi凝胶（Novex，目录号WG1402BX10)从细胞裂解物分离蛋白，转移至硝酸纤维膜，随后 与得自Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)的抗体一起温育，这些抗体识别 P-AKT (S473,目录号 4058)、总 AKT (目录号 2920)、p-ERKl/2 (T202/Y204,目录号 9101)、 总ERKl/2(目录号9107)、p-MEKl/2(S217/221，目录号9121)和β-肌动蛋白（Ambion，目 录号 AM4302)。与 IRDye 680RD 山羊抗兔 IgG (Li-Cor，目录号 926-68071)和 IRDye 800 CW山羊抗小鼠 IgG(Li-Cor，目录号926-32210) -起温育且用Odyssey红外线成像系统 (Li-Cor, Lincoln, NE, USA)扫描后观察 Western 印迹。
[0320] 为确定FGFR是否可援救用式（I)化合物处理的BRAFV600E突变黑素瘤细胞系的 亚群，在十一个T1799突变BRAF细胞系中在FGFR活化的配体FGF2存在或不存在下检查其 抗增殖作用。在FGF2不存在下，六个黑素瘤和五个CRC衍生细胞系中的IC50值分别在3. 0 至470nM和4. 0至185nM的范围内（表7)。六个细胞系所测得的IC50值不受FGF2存在的 影响，然而，对于剩余的五个细胞系，对式（I)化合物的反应大大削弱（例如CL-34)或完全 消失（例如Is 411N)。因此，FGF2的存在能够通过式⑴的B-Raf抑制剂的抗增殖作用援 救BRAFV600E黑素瘤衍生细胞系的群。此外，在来源于CRC肿瘤的BRAFV600E突变细胞系 中也观察到类似的作用。
[0321] 表 7
[0322]
[0323] 在一组BRAF T1799突变黑素瘤和CRC细胞系中存在或不存在lOOng/ml FGF2下 式（I)化合物的单一药剂IC50值。突变型（mut)和野生型（wt)状况由已发布的数据确定。 除了在分别具有V600K和V600D的MDST8 (mut*)和WM-266-4 (mut#)的情况下，所有BRAF 突变均导致V600E取代。PTEN mut名称表示PTEN基因的基于突变、基因拷贝数和mRNA表 达信息的简要叫法。
[0324] 为确定FGF2对BRAFV600E黑素瘤细胞系的援救是否取决于FGFR信号传导，检查 了选择性FGFR抑制剂化合物H是否可防止FGF2介导的援救。在化合物H存在或不存在下， 将由FGF2不同程度援救的两个细胞系（C0L0 741和SK-MEL-5,表8-1)培养于含有式（I) 化合物和FGF2的培养基中，且实时测量生长。
[0325] 与早前的IC50数据一致，式（I)化合物抑制了两种细胞系的生长，且该生长抑 制通过添加 FGF2而消除（图3)。作为单一药剂，化合物H未影响任一细胞系（A组，对于 SK-MEL-5未示出）的增殖且在FGF2不存在下与式（I)化合物组合时不会有助于其单一药 剂活性。在FGF2存在下与式（I)化合物组合时，化合物H恢复抗增殖作用至在FGF2不存 在下所观察到的水平。这些结果表明FGF2介导的援救可经由添加选择性FGFR抑制剂化合 物H而阻止。
[0326] 为研究恢复的MAPK或活化的PIK3C信号传导是否可支持FGF2介导的援救，经由 磷酸化 MEK1/2 (MAP2K1/2)、ERKl/2 (MAPK1/2)和 AKT1/2/3 的 Western 印迹分析来检查 FGF2 对MPK和PIK3C信号传导的作用。如图4所示，将COLO 741和SK-MEL-5细胞与式（I)化 合物一起温育在化合物添加后2小时和24小时均导致MAPK信号传导的显著抑制，其可由 磷酸化MEK和ERK两者的水平下降来判定。在COLO 741细胞中，在2小时时，AKT的磷酸 化水平不受影响，但在24小时时显示出适度下降。相比之下，FGF2和化合物H在以单一药 剂形式添加时均不影响2小时或24小时的信号传导。当组合FGF2和式（I)化合物时，相 对于单独的式（I)化合物，在处理后两小时观察到信号传导的微弱变化（但在SK-MEL-5细 胞中观察到P-ERK的略微增加），但到24小时，磷酸化MEK和ERK的水平已大体上但非完 全恢复。最后，向式（I)化合物/FGF2组合添加化合物H完全消除了 FGF2诱导的MPK和 PIK3C信号传导变化。这些数据强烈表明：FGF2对B-Raf抑制剂的抗增殖作用的抑制是由 于MPK信号传导的再活化，且指示化合物H能够完全抑制这些FGF2诱导的信号传导变化。
[0327] 实施例6
[0328] 目的：评估式（I)化合物和⑶K 4抑制剂化合物C的组合在HMEX1906原发性黑素 瘤模型中的功效，该模型在5mg/kg式（I)化合物存在下生长且耐受5mg/kg式（I)化合物 (HMEX1906-R5)
[0329] 药物配制：在0· 5 % MC/0. 5 % Tween80中配制化合物C且在20 % PEG300/3 % ETPGS中配制式（I)化合物。
[0330] 将肿瘤剁/切成细胞系样悬液（肿瘤均质化）。添加7mL基质胶和I. 5mL HBSS。 在手掌中温热悬液直至基质胶变稠，然后用18G针皮下植入雌性裸鼠右侧腹部。
[0331] 植入后18天将小鼠分配至以下组中，其中平均肿瘤体积为266mm3且平均体重为 25克。
[0332] 组：10只小鼠/组，途径为经口，给药体积为0. 2mL
[0333] 组 1 :媒介物，Omg/kg bidxl4
[0334] 组 2 :化合物 C，250mg/kg qdx21
[0335] 组 3 :式⑴化合物，5mg/kg bidx21
[0336] 组 4 :化合物 C 250mg/kg qd x21+式⑴化合物 5mg/kg bid x21
[0337] 结果：
[0339] *3只小鼠由于大肿瘤而被实施安乐死。
【主权项】
1. 一种用于治疗罹患特征为B-Raf中的突变、尤其是B-Raf中的V600突变的增生性疾 病、极其是特征为B-Raf中的V600突变的黑素瘤的患者的方法，其包括： (a)从所述患者获得肿瘤样品并测试选自包括BRAF、CRAF、CCNDl、CDK4、肥R2、IGF-1R、cMET、FGFRl、FGFR2、FGFR3EGFR、MAP2K1、MAP2K2、NRAS、KRASHRAS、PTEN、PIK3CA和P16 的 组的基因中的遗传变化， 化）施用包含B-Raf抑制剂和第二抑制剂的药物组合疗法，所述第二抑制剂基于所述 肿瘤样品中所发现的遗传变化而选择，其中， (i) 当所述肿瘤样品具有BRAF、CRAF、MAP2Kl、MAPK2、NRAS、KRASHRAS或EGFR中的遗 传变化时，所述第二抑制剂为Mek1/2抑制剂，或 (ii) 当所述肿瘤样品具有CCNDUCDK4或P16中的遗传变化时，所述第二抑制剂为CDK 4抑制剂，或 (iii) 当所述肿瘤样品具有肥R2、IGF-1R、PTEN或PIK3CA中的遗传变化时，所述第二 抑制剂为PI3激酶抑制剂，或 (iv) 当所述肿瘤样品具有CMET中的遗传变化时，所述第二抑制剂为C-Met受体酪氨酸 激酶抑制剂， (V)当所述肿瘤样品具有FGFR1、FGFR2或FGFR3中的遗传变化时，所述第二抑制剂为FGW激酶抑制剂。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述B-Raf抑制剂为式（I)化合物式（I)化合物3. 根据权利要求1和2中的一项所述的方法，其包括： (a)从所述患者获得肿瘤样品并检测BRAF、CRAF、MAP2K1、MAPK2、NRAS、KRASHRAS或EGH?中的遗传变化，和 化）向所述患者施用包含所述B-Raf抑制剂和第二抑制剂的药物组合疗法，所述第二 抑制剂是为化合物B的Mek1/2抑制剂。4. 根据权利要求1和2中的一项所述的方法，其包括： 化）从所述患者获得肿瘤样品并检测CCND1、CDK4或P16中的遗传变化，和 (d)向所述患者施用包含所述B-Raf抑制剂和第二抑制剂的药物组合疗法，所述第二 抑制剂为CDK4抑制剂。5. 根据权利要求1和2中的一项所述的方法，其包括： (a)在疾病进展后从所述患者获得肿瘤样品并检测肥R2、IGF-1R、PTEN或PIK3CA中的 遗传变化，和 化）向所述患者施用包含所述B-Raf抑制剂和第二抑制剂的药物组合疗法，所述第二 抑制剂为PI3激酶抑制剂。6. 根据权利要求1和2中的一项所述的方法，其包括： (a)获得肿瘤样品并检测CMET中的遗传变化，和 化）向所述患者施用包含所述B-Raf抑制剂和第二抑制剂的药物组合疗法，所述第二 抑制剂为C-Met受体酪氨酸激酶抑制剂。7. 根据权利要求1和2中的一项所述的方法，其包括： (a)从所述患者获得肿瘤样品并检测FGFR1、FGFR2或FGFR3中的遗传变化，和 化）向所述患者施用包含所述B-Raf抑制剂和第二抑制剂的药物组合疗法，所述第二 抑制剂为FGH?激酶抑制剂。8. -种治疗性组合，其包含式（I)的B-Raf抑制剂和为化合物F的第二抑制剂或其药 学上可接受的盐，供单独、同时或序贯施用。9. 一种治疗性组合，其包含式（I)的B-Raf抑制剂和为化合物G的第二抑制剂或其药 学上可接受的盐，供单独、同时或序贯施用。10. -种治疗性组合，其包含式（I)的B-Raf抑制剂和为化合物H的第二抑制剂或其药 学上可接受的盐，供单独、同时或序贯施用。11. 一种治疗罹患特征为B-Raf中的V600突变的增生性疾病的患者的方法，其包括向 所述患者施用治疗有效量的根据权利要求8、9或10中的任一项所述的组合。12. 根据权利要求8、9或10中的任一项所述的组合的用途，其用于制备用W治疗或预 防增生性疾病的药物组合物或药物。13. -种用于选择待与B-Raf抑制剂组合的第二抑制剂的诊断方法，其中测试肿瘤样 品的包括B-Raf、C-Raf、CCNDl、CDK4、肥R2、IGF-1R、cMET、FGFRl、FGFR2、FGFR3EGFR、MAP2K1、 MAP2K2、NRAS、KRASHRAS、PTEN、PIK3CA和P16 的一组基因中的遗传变化。14. 一种诊断药盒，其用于检测包括B-Raf、C-Raf、CCND1、CDK4、肥R2、IGF-1R、cMET、 FGFR1、FGFR2、FGFR3EGFR、MAP2K1、MAP2K2、NRAS、KRASHRAS、PTEN、PIK3CA和P16 的一组基 因中的遗传变化。15. 根据权利要求1-11中的任一项所述的方法，其中所述增生性疾病是特征为B-Raf 中的V600突变的黑素瘤。
【专利摘要】通过以下方式逆转对用于治疗增生性疾病的B-Raf抑制剂的抗性：从患者获得肿瘤样品并测试其包括BRAF、CRAF、CCND1、CDK4、HER2、IGF-1R、cMET、FGFR1、FGFR2、FGFR3EGFR、MAP2K1、MAP2K2、NRAS、KRAS？HRAS、PTEN、PIK3CA和P16的一组基因中的遗传变化，以及施用克服对所述B-Raf抑制剂的抗性的包含所述B-Raf抑制剂和第二抑制剂的药物组合疗法，所述第二抑制剂基于所述肿瘤样品中所发现的遗传变化而选择。
【IPC分类】A61K31/4745, A61K31/519, A61K31/506, A61K31/496, A61K31/5377, A61K31/53, A61P35/00, A61K31/4184, A61K45/06, A61K31/4439
【公开号】CN105209073
【申请号】CN201480026686
【发明人】G·卡波尼格罗, D·斯图尔特, L·德帕塞瓦尔
【申请人】诺华股份有限公司
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2014年3月19日
【公告号】CA2907704A1, EP2976106A2, WO2014147573A2, WO2014147573A3