小分子毒素的连接子带有马来酰亚胺基团，该结构中的双键比较活泼，可与 游离巯基进行加成反应，从而将小分子毒素与含有游离巯基的化合物偶联在一起，形成偶 联物。
[0045] 方法：
[0046] 2. 1偶联方法确立
[0047] ①将抗体溶液均分成A、B、C 3个组，每组3个平行，共计9支样品。按照TCEP/PH =3,37°C水浴条件下还原30min，测定各组样品中的巯基含量。
[0048] ②A组还原结束后放置常温下。
[0049] ③B组还原结束后用巯基含量10倍的碘乙酰胺封闭巯基30min后添加带有连接 子的小分子毒素 MMAE，投料比（摩尔比）为MMAE/PH-SH = 2,常温下反应120min。
[0050] ④C组还原结束后添加带有连接子的小分子毒素 MMAE，投料比为MMAE/PH-SH = 2,常温下反应120min。
[0051] ⑤测定各组巯基含量。
[0052] ⑥因为小分子毒素在248nm处有特异性吸收，偶联结束后，测定残留毒素分子在 248nm处的吸光值。
[0053] 2. 2偶联温度优化
[0054] 取抗体PH(10mg/ml)溶液900 μ 1，分装在9支EP管中，均分成A、B、C共计3组， 每组3管，每管100 μ 1。选用TCEP/PH = 3,37°C水浴条件下，还原时间30min，测定每管中 巯基的含量。小分子毒素加入量为MMAE/PH-SH = 2, A、B、C组分别在0°C、常温25°C、37°C 条件下偶联120min。
[0055] 2· 3MMAE加入量优化
[0056] 选用已与连接子MC-Val-Cit-PAB连接好的MMAE (购买的成品）与PH偶联。取 抗体PH(10mg/ml)溶液900 μ1，分装在9支EP管中，均分成A、B、C三组，每组3管，每管 100 μ 1。选用TCEP/PH = 3,37°C水浴条件下，还原时间30min，测定每管中巯基的含量。Α、 B、C三组分别选用MMAE/PH-SH = 1、2、3在(TC冰上偶联120min。
[0057] 2. 4偶联时间优化
[0058] 取抗体PH(10mg/ml)溶液1200 μ 1，分装在12支EP管中，均分成A、B、C、D四组， 每组3管，每管100 μ 1。选用TCEP/PH = 3, 37°C水浴条件下，还原时间30min，测定每管中 巯基的含量。小分子加入量为MMAE/PH-SH = 2,偶联条件为0°C冰上，A、B、C、D四组偶联时 间分别为 30min、60min、90min、120min。
[0059] 通过优化的制备条件所制备的ADC，具体结构如图3所示，命名为PH-MMAE。
[0060] 结果：
[0061] 为了探索抗体偶联的方法与条件，本研究首先验证了偶联方法的可行性。将PH还 原后，分成3组：A组不做任何处理，置于常温下；B组选择用10倍巯基含量的碘乙酰胺封闭 后与MMAE偶联；C组与MMAE偶联；3组样品偶联如后的自由疏基含量如表1所不：、
[0064] 注^表示偶联后，残留小分子在248nm处吸光强弱
[0065] 结果表明：A组中，抗体还原后暴露在空气中，巯基化学性质比较活泼，容易被空 气等氧化，因此巯基含量与偶联前会有所降低，这与之前的实验结果是一致的；B组中，抗 体还原后，用碘乙酰胺封闭抗体还原后游离的巯基。MMAE与抗体偶联后，通过检测残留 MMAE的吸光值，与偶联初时添加的MMAE的吸光值接近，说明抗体的巯基被封闭后，MMAE不 能与其偶联；C组中，抗体还原后，MMAE与之偶联，偶联后检测不到残留的疏基，残留MMAE吸 光值明显降低。表明MMAE与巯基反应，已经偶联到抗体上。
[0066] 2. 1偶联温度优化
[0067] 为了探讨在偶联过程中温度对于偶联物组成成分与偶联率的影响，设置在37°C、 25°C、冰上0°C三个温度进行研究。实验结果表明：在三种温度下，PH-MMAE的偶联率均为 60%左右，没有显著差异。理论上偶联后的样品为一混合物，含有未偶联上毒素分子的抗体 和偶联上2、4、6、8个毒素分子的抗体，而偶联上4个毒素分子时活性较高。在(TC冰上制备 的ADC中含有偶联上2-4个毒素分子的比例较37 °C、25 °C高，此外低温有助于保持抗体的生 物活性，因此本研究选择偶联温度为〇°C冰上。
[0068] 2· 2MMAE加入量优化
[0069] 在前面的实验中，选择MMAE与抗体还原的巯基投料摩尔比为2时，偶联反应完全。 为了优化生产工艺，节约生产成本，提高MMAE的利用率，对偶联过程中MMAE加入量进行优 化。选择MMAE与抗体还原的巯基投料摩尔比为1、1. 5和2三个梯度，均在优化的还原时间、 还原剂加入量、偶联温度下进行。实验结果表明：当MMAE加入量与抗体还原巯基摩尔比为 1:1时，偶联率仅为40% ;摩尔比为1:1. 5和1:2时，偶联率提高到60%左右。因此必须在 MMAE过量的情况下才能获得较高偶联率的PH-MMAE。但1:1. 5与1:2两组样品的偶联率无 显著差异，因此选择1:1. 5为适宜的MMAE与抗体还原巯基投料摩尔比。
[0070] 2. 3偶联时间优化
[0071] 设置偶联时间梯度，分别为30min、60min、90min、120min、150min五个梯度。实验 结果显示：偶联30min偶联率仅约为40% ;偶联60min约为60% ;90min可达到80%。之 后偶联时间的延长偶联率变化较小，90min与120min偶联率相差3%，120min与150min相 差仅约为〇. 6%，因此本研究选择最优的偶联时间为120min。
[0072] 3、PH-MMAE的纯化与检测
[0073] 3. 1纯化方法
[0074] 流动相：20mM PB，pH 7. 2 ;
[0075] 保存液：20禮？8,0.05%叠氮化钠，？!17.2。
[0076] Superdex G25脱盐柱；流速：lml/min ;进样体积：500ul，检测波长为280nm。
[0077] 采用注射进样，在Superdex G25脱盐柱上大分子蛋白质先流出，小分子物质流出 时间长，因而样品中的小分子物质得以去除。
[0078] 3. 2HPLC 检测
[0079] 流动相 A : I. 5M (NH4) 2S04, 25mM KH2PO4, pH 7. 0 ;
[0080] 流动相 B :25mM KH2PO4与异丙醇（25% V/75% V)，pH 7· 0 ;
[0081] 保存液：超纯水。
[0082] 疏水层析柱（TSKgel Butyl-NPR);流速：0· 8ml/min ;进样体积：30 μ 1 ;洗脱： 2-12min线性洗脱，检测波长分别为280nm和248nm。
[0083] ①打开Ultimate 3000变色龙工作站，将流动相替换为流动相A，排尽管路中的气 泡，正确装柱后，调节流速至0. 8ml/min，压力上限设置119bar。
[0084] ②流动相A平衡柱子30min，待基线平直，压力稳定后运行进样程序。
[0085] ③程序运行结束后对所获色谱图作积分处理，根据面积归一划法，计算偶联物占 整个样品的比例及组成分布。
[0086] ④所有样品分析结束，用保存液保存色谱柱。
[0087] 3. 3SDS-PAGE 检测
[0088] (1)配制分离胶和浓缩胶，非还原样品（8%分离胶）；还原处理样品（12%分离 胶），浓缩胶均为5%。
[0089] (2)样品处理，加入5X loading Buffer (5倍浓度上样缓冲液），100°C水浴处理 5min，还原处理样品加热前加入5% β -疏基乙醇。
[0090] (3)按Bio-Rad蛋白电泳操作指南装配好电泳装置，灌注适量1倍电泳稀释液。
[0091] (4)微量进样器进样，上样量保持在2-10 μ g之间，以90ν进行浓缩胶电泳，随后调 节电压至120V跑完分离胶。
[0092] (5)经染色、脱色后，用Bio-Rad凝胶成像仪采集SDS-PAGE图像，利用image凝胶 成像软件对电泳条带进行分析。
[0093] 结果
[0094] 3. ISDS-PAGE 检测
[0095] PH偶联上MMAE后，分子量发生改变，在SDS-PAGE凝胶电泳条件下，条带出现的位 置将会出现差异。图4表明：PH-MMAE在还原条件下被还原成2条带，分别对应抗体的重链 和轻链，与抗体（PH)比较，PH-MMAE的重链和轻链位置略高，说明ADC的重链和轻链上均偶 联上了 MMAE。非